Ligation sequencing gDNA - Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Ligation sequencing gDNA - Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) V NBE_9169_v114_revT_19Dec2024

Barcoding of native genomic DNA libraries

  • Requires the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
  • PCR-free protocol
  • Using up to 24 barcodes
  • Allows analysis of native DNA
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

抂芁

Barcoding of native genomic DNA libraries

  • Requires the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
  • PCR-free protocol
  • Using up to 24 barcodes
  • Allows analysis of native DNA
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: NBE_9169_v114_revT_19Dec2024

1. Overview of the protocol

Introduction to the Native Barcoding Kit 24 V14 protocol

This protocol describes how to carry out native barcoding of genomic DNA (gDNA) using the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24). There are 24 unique barcodes available, allowing the user to pool up to 24 different samples in one sequencing experiment. It is highly recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Prepare your library

You will need to:

  • Repair the DNA, and prepare the DNA ends for adapter attachment
  • Ligate Native barcodes supplied in the kit to the DNA ends
  • Ligate sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
  • Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell

Native barcoding workflow1

Sequencing

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
  • Demultiplex barcoded reads in MinKNOW or the Guppy basecalling, choosing the SQK-NBD114.24 kit option
  • Start the EPI2ME software and select a workflow for further analysis (this step is optional)
重芁

We do not recommend mixing barcoded libraries with non-barcoded libraries prior to sequencing.

重芁

Optional fragmentation and size selection

By default, the protocol contains no DNA fragmentation step, however in some cases it may be advantageous to fragment your sample. For example, when working with lower amounts of input gDNA (100 ng – 500 ng), fragmentation will increase the number of DNA molecules and therefore increase throughput. Instructions are available in the DNA Fragmentation section of Extraction methods.

Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments - instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.

重芁

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

  • Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
  • R10.4.1 flow cells (FLO-MIN114)
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
  • Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003)
  • Native Barcoding Expansion V14 (EXP-NBA114)

2. Equipment and consumables

材料
  • Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
  • 400 ng gDNA per sample if using >4 barcodes
  • OR 1000 ng gDNA per sample if using ≀4 barcodes
消耗品
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
  • NEBNext FFPE Repair Mix (NEB, M6630)
  • NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Eppendorf™, cat # 0030129504) with heat seals
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • ヌクレアヌれフリヌ氎で甚事調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q32851)
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
装眮
  • Hula mixer緩やかに回転するミキサヌ
  • Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
  • Microfuge
  • Magnetic rack
  • ボルテックスミキサヌ
  • サヌマルサむクラヌ
  • Multichannel pipette and tips
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットずチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
  • P2 ピペットずチップ
  • アむスバケツ氷入り
  • タむマヌ
  • Eppendorf 5424 centrifuge (or equivalent)
  • Qubit蛍光光床蚈たたはQCチェックのための同等品
オプション装眮
  • Nanodrop spectrophotometer

For this protocol, we recommend the following inputs:

  • 400 ng per sample for >4 barcodes
  • 1000 ng per sample for ≀4 barcodes

むンプットDNA

むンプットDNAのQC方法

むンプットDNAの量ず品質の芁件を満たすこずが重芁です。DNAの䜿甚量が少なすぎたり倚すぎたり、あるいは品質の䜎いDNA䟋ずしおDNAが非垞に断片化されおいたり、RNAや化孊汚染物質が含たれおいる堎合などを䜿甚するず、ラむブラリヌの調補に圱響を及がす可胜性がありたす。

DNAサンプルの品質管理の方法に぀いおは、Input DNA/RNA QC protocolのプロトコルをご芧ください。

コンタミネヌション

DNAの抜出する方法によっおは、粟補DNAに特定の化孊汚染物質が残留する可胜性があり、ラむブラリ調補の効率やシヌク゚ンシングの品質に圱響を及がす可胜性がありたす。コンタミネヌションに぀いおの詳现は、コミュニティヌの Contaminants page をご芧ください。

サヌドパヌティヌ詊薬

このプロトコヌルで䜿甚されおいるすべおのサヌドパヌティヌ詊薬は、圓瀟が怜蚌し、䜿甚を掚奚しおいるものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以倖の詊薬を甚いたテストは行っおいたせん。

すべおのサヌドパヌティ補詊薬に぀いおは、補造元の指瀺に埓っお䜿甚の準備をするこずをお勧めしたす。

重芁

The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) contents

Note: We are in the process of reformatting the barcodes provided in this kit into a plate format. This will reduce plastic waste and will facilitate automated applications.

Plate format

SQK-NBD114.24 plate format

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
DNA Control Sample DCS Yellow 2 35
Native Adapter NA Green 1 40
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Elution Buffer EB Black 2 500
AMPure XP Beads AXP Clear cap, light teal label 1 6,000
Long Fragment Buffer LFB Orange 1 1,800
Short Fragment Buffer SFB Clear 1 1,800
EDTA EDTA Blue 1 700
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200
Native Barcode plate NB01-24 - 2 plates, 3 sets of barcodes per plate 5 µl per well

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.


Vial format

SQK-NBD114.24 bottle format

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
Native Barcodes NB01-24 Clear 24 (one per barcode) 20
DNA Control Sample DCS Yellow 2 35
Native Adapter NA Green 1 40
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Elution Buffer EB Black 2 500
AMPure XP Beads AXP Clear cap, light teal label 1 6,000
Long Fragment Buffer LFB Orange 1 1,800
Short Fragment Buffer SFB Clear 1 1,800
EDTA EDTA Blue 1 700
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.

To maximise the use of the Native Barcoding Kits, the Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) and the Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) expansion packs are available.

These expansions provide extra library preparation and flow cell priming reagents to allow users to utilise any unused barcodes for those running in smaller subsets.

Both expansion packs used together will provide enough reagents for 12 reactions. For customers requiring extra EDTA to maximise the use of barcodes, we recommend using 0.25 M EDTA and adding 4 µl for library preps using the SQK-NBD114.24 kit and 2 µl for preps using the SQK-NBD114.96 kit.

Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) contents:

EXP-NBA114 tubes

Note: This Product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) contents:

EXP-AUX003 bottles

Native barcode sequences

Component Forward sequence Reverse sequence
NB01 CACAAAGACACCGACAACTTTCTT AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG
NB02 ACAGACGACTACAAACGGAATCGA TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT
NB03 CCTGGTAACTGGGACACAAGACTC GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG
NB04 TAGGGAAACACGATAGAATCCGAA TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA
NB05 AAGGTTACACAAACCCTGGACAAG CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT
NB06 GACTACTTTCTGCCTTTGCGAGAA TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC
NB07 AAGGATTCATTCCCACGGTAACAC GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT
NB08 ACGTAACTTGGTTTGTTCCCTGAA TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT
NB09 AACCAAGACTCGCTGTGCCTAGTT AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT
NB10 GAGAGGACAAAGGTTTCAACGCTT AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC
NB11 TCCATTCCCTCCGATAGATGAAAC GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA
NB12 TCCGATTCTGCTTCTTTCTACCTG CAGGTAGAAAGAAGCAGAATCGGA
NB13 AGAACGACTTCCATACTCGTGTGA TCACACGAGTATGGAAGTCGTTCT
NB14 AACGAGTCTCTTGGGACCCATAGA TCTATGGGTCCCAAGAGACTCGTT
NB15 AGGTCTACCTCGCTAACACCACTG CAGTGGTGTTAGCGAGGTAGACCT
NB16 CGTCAACTGACAGTGGTTCGTACT AGTACGAACCACTGTCAGTTGACG
NB17 ACCCTCCAGGAAAGTACCTCTGAT ATCAGAGGTACTTTCCTGGAGGGT
NB18 CCAAACCCAACAACCTAGATAGGC GCCTATCTAGGTTGTTGGGTTTGG
NB19 GTTCCTCGTGCAGTGTCAAGAGAT ATCTCTTGACACTGCACGAGGAAC
NB20 TTGCGTCCTGTTACGAGAACTCAT ATGAGTTCTCGTAACAGGACGCAA
NB21 GAGCCTCTCATTGTCCGTTCTCTA TAGAGAACGGACAATGAGAGGCTC
NB22 ACCACTGCCATGTATCAAAGTACG CGTACTTTGATACATGGCAGTGGT
NB23 CTTACTACCCAGTGAACCTCCTCG CGAGGAGGTTCACTGGGTAGTAAG
NB24 GCATAGTTCTGCATGATGGGTTAG CTAACCCATCATGCAGAACTATGC

3. Computer requirements and software

MinION Mk1B IT requirements

Sequencing on a MinION Mk1B requires a high-spec computer or laptop to keep up with the rate of data acquisition. For more information, refer to the MinION Mk1B IT requirements document.

MinION Mk1C IT requirements

The MinION Mk1C contains fully-integrated compute and screen, removing the need for any accessories to generate and analyse nanopore data. For more information refer to the MinION Mk1C IT requirements document.

MinION Mk1D IT requirements

Sequencing on a MinION Mk1D requires a high-spec computer or laptop to keep up with the rate of data acquisition. For more information, refer to the MinION Mk1D IT requirements document.

Software for nanopore sequencing

MinKNOW

The MinKNOW software controls the nanopore sequencing device, collects sequencing data and basecalls in real time. You will be using MinKNOW for every sequencing experiment to sequence, basecall and demultiplex if your samples were barcoded.

For instructions on how to run the MinKNOW software, please refer to the MinKNOW protocol.

EPI2ME (optional)

The EPI2ME cloud-based platform performs further analysis of basecalled data, for example alignment to the Lambda genome, barcoding, or taxonomic classification. You will use the EPI2ME platform only if you would like further analysis of your data post-basecalling.

For instructions on how to create an EPI2ME account and install the EPI2ME Desktop Agent, please refer to this link.

フロヌセルのチェックをしおください

シヌク゚ンシング実隓を開始する前に、フロヌセルのポアの数を確認するこずを匷くお勧めしたす。このフロヌセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの堎合は代理店ぞの到着から週間以内に行っおください。たたはFlongle Flow Cellの堎合は代理店ぞの到着から4週間以内に行う必芁がありたす。Oxford Nanopore Technologiesは、フロヌセルチェックの実斜から2日以内に結果が報告され、掚奚される保管方法に埓っおいた堎合に、以䞋の衚に蚘茉されおいるナノポアの有効数に満たさない堎合には、フロヌセルを亀換したす。 フロヌセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指瀺に埓っおください。

Flow cell 保蚌する最小有効ポア数以䞋の数未満のフロヌセルが亀換察象ずなりたす
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000

4. DNA repair and end-prep

材料
  • 400 ng gDNA per barcode
  • OR 1000 ng gDNA per sample if using ≀4 barcodes
  • AMPure XP Beads (AXP)
  • DNA Control Sample (DCS)
消耗品
  • NEBNext FFPE DNA Repair Mix (NEB, M6630)
  • NEBNext® Ultra II End Repair / dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • ヌクレアヌれフリヌ氎で甚事調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Eppendorf™, cat # 0030129504) with heat seals
  • OR 0.2 ml thin-walled PCR tubes
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
装眮
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 pipette and tips
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 pipette and tips
  • P10 ピペットずチップ
  • P2 pipette and tips
  • Multichannel pipette and tips
  • Thermal cycler
  • Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
  • Microfuge
  • アむスバケツ氷入り
  • Magnetic rack
  • ボルテックスミキサヌ
  • Hula mixer (rotator mixer)
  • Qubit fluorometer (or equivalent)
ヒント

For samples containing long gDNA fragments, we recommend using wide-bore pipette tips for the mixing steps to preserve the DNA length.

Thaw the AMPure XP Beads (AXP) and DNA Control Sample (DCS) at room temperature and mix by vortexing. Keep the beads at room temperature and store the DNA Control Sample (DCS) on ice.

Prepare the NEBNext FFPE DNA Repair Mix and NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer’s instructions, and place on ice.

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Flick and/or invert the reagent tubes to ensure they are well mixed.
    Note: Do not vortex the FFPE DNA Repair Mix or Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The Ultra II End Prep Buffer and FFPE DNA Repair Buffer may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for 30 seconds to solubilise any precipitate.
    Note: It is important the buffers are mixed well by vortexing.

  5. The FFPE DNA Repair Buffer may have a yellow tinge and is fine to use if yellow.

重芁

Do not vortex the NEBNext FFPE DNA Repair Mix or NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix.

重芁

It is important that the NEBNext FFPE DNA Repair Buffer and NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer are mixed well by vortexing.

Check for any visible precipitate; vortexing for at least 30 seconds may be required to solubilise any precipitate.

Dilute your DNA Control Sample (DCS) by adding 105 µl Elution Buffer (EB) directly to one DCS tube. Mix gently by pipetting and spin down.

One tube of diluted DNA Control Sample (DCS) is enough for 140 samples. Excess can be stored at -20°C in the freezer.

ヒント

トラブルシュヌティングの為、DNAコントロヌルサンプルDCSを自身のラむブラリヌに添加しお、プレップコントロヌル甚に䜿甚するこずを掚奚したす。ただし、このステップを省略しお、1 µlをサンプルDNAで補うこずもできたす。

In clean 0.2 ml thin-walled PCR tubes (or a clean 96-well plate), prepare your DNA samples:

  • For >4 barcodes, aliquot 400 ng per sample
  • For ≀4 barcodes, aliquot 1000 ng per sample

Make up each sample to 11 µl using nuclease-free water. Mix gently by pipetting and spin down.

Combine the following components per tube/well:

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent Volume
DNA sample 11 µl
Diluted DNA Control Sample (DCS) 1 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer 0.875 µl
Ultra II End-prep Reaction Buffer 0.875 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 0.75 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix 0.5 µl
Total 15 µl
ヒント

We recommend making up a mastermix of the end-prep and DNA repair reagents for the total number of samples and adding 3 µl to each well.

Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting and spin down in a centrifuge.

サヌマルサむクラヌを䜿甚しお、初めに20℃で5分間むンキュベヌトした埌に、65℃で5分間むンキュベヌトしおください。

Transfer each sample into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Resuspend the AMPure XP beads (AXP) by vortexing.

Add 15 µl of resuspended AMPure XP Beads (AXP) to each end-prep reaction and mix by flicking the tube.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 5 minutes at room temperature.

Prepare sufficient fresh 80% ethanol in nuclease-free water for all of your samples. Allow enough for 400 µl per sample, with some excess.

Spin down the samples and pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless. Keep the tubes on the magnet and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.

前のステップを繰り返したす。

Briefly spin down and place the tubes back on the magnet for the beads to pellet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for 30 seconds, but do not dry the pellets to the point of cracking.

Remove the tubes from the magnetic rack and resuspend the pellet in 10 µl nuclease-free water. Spin down and incubate for 2 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 10 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

  • Dispose of the pelleted beads
CHECKPOINT

Quantify 1 µl of each eluted sample using a Qubit fluorometer.

最終ステップ

Take forward an equimolar mass of each sample to be barcoded forward into the native barcode ligation step. However, you may store the samples at 4°C overnight.

5. Native barcode ligation

材料
  • Native Barcodes (NB01-24)
  • AMPure XP Beads (AXP)
  • EDTA (EDTA)
消耗品
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
  • ヌクレアヌれフリヌ氎で甚事調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Eppendorf™, cat # 0030129504) with heat seals
  • OR 0.2 ml thin-walled PCR tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q32851)
装眮
  • マグネットラック
  • ボルテックスミキサヌ
  • Hula mixer緩やかに回転するミキサヌ
  • Microfuge
  • サヌマルサむクラヌ
  • アむスバケツ氷入り
  • Multichannel pipette and tips
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 pipette and tips
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 pipette and tips
  • P10 ピペットずチップ
  • P2 pipette and tips
  • Qubit蛍光光床蚈たたはQCチェックのための同等品

Prepare the NEB Blunt/TA Ligase Master Mix according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes.

Thaw the EDTA at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

Thaw the Native Barcodes (NB01-24) at room temperature. Briefly spin down, individually mix the barcodes required for your number of samples by pipetting, and place them on ice.

Select a unique barcode for each sample to be run together on the same flow cell. Up to 24 samples can be barcoded and combined in one experiment.

Please note: Only use one barcode per sample.

In clean 0.2 ml PCR-tubes or a 96-well plate, add the reagents in the following order per well:

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent Volume
End-prepped DNA 7.5 µl
Native Barcode (NB01-24) 2.5 µl
Blunt/TA Ligase Master Mix 10 µl
Total 20 µl

反応液を完党に混合するために、ゆっくりずピペッティングし短時間スピンダりンしお䞋さい。

Incubate for 20 minutes at room temperature.

Add the following volume of EDTA to each well and mix thoroughly by pipetting and spin down briefly.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

EDTA cap colour Volume per well
For clear cap EDTA 2 µl
For blue cap EDTA 4 µl
ヒント

EDTA is added at this step to stop the reaction.

Pool all the barcoded samples in a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

Volume per sample For 6 samples For 12 samples For 24 samples
Total volume for preps using clear cap EDTA 22 µl 132 µl 264 µl 528 µl
Total volume for preps using blue cap EDTA 24 µl 144 µl 288 µl 576 µl
ヒント

We recommend checking the base of your tubes/plate are all the same volume before pooling and after to ensure all the liquid has been taken forward.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

Add 0.4X AMPure XP Beads (AXP) to the pooled reaction, and mix by pipetting.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

Volume per sample For 6 samples For 12 samples For 24 samples
Volume of AXP for preps using clear cap EDTA 9 µl 53 µl 106 µl 211 µl
Volume of AXP for preps using blue cap EDTA 10 µl 58 µl 115 µl 230 µl

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Prepare 2 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

Spin down the sample and pellet on a magnet for 5 minutes. Keep the tube on the magnetic rack until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnetic rack and wash the beads with 700 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.

前のステップを繰り返したす。

Spin down and place the tube back on the magnetic rack. Pipette off any residual ethanol. Allow the pellet to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 35 µl nuclease-free water by gently flicking.

Incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.

Pellet the beads on a magnetic rack until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 35 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Qubit蛍光光床蚈を䜿甚しお、溶出したサンプル1 µlを定量したす。

最終ステップ

Take forward the barcoded DNA library to the adapter ligation and clean-up step. However, you may store the sample at 4°C overnight.

6. Adapter ligation and clean-up

材料
  • Long Fragment Buffer (LFB)
  • Short Fragment Buffer (SFB)
  • Elution Buffer (EB)
  • Native Adapter (NA)
  • AMPure XP Beads (AXP)
消耗品
  • NEBNext® Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q32851)
装眮
  • 小型遠心機
  • マグネットラック
  • ボルテックスミキサヌ
  • Hula mixer緩やかに回転するミキサヌ
  • サヌマルサむクラヌ
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットずチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
  • Ice bucket with ice
  • Qubit蛍光光床蚈たたはQCチェックのための同等品
重芁

The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Prepare the NEBNext Quick Ligation Reaction Module according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes. Note: Do NOT vortex the Quick T4 DNA Ligase.

The NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5x) may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for several seconds to ensure the reagent is thoroughly mixed.

重芁

Do not vortex the Quick T4 DNA Ligase.

Spin down the Native Adapter (NA) and Quick T4 DNA Ligase, pipette mix and place on ice.

Thaw the Elution Buffer (EB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

重芁

䜿甚するりォッシュバッファヌLFBたたはSFBに応じお、アダプタヌラむゲヌション埌のクリヌンアップステップは、3 kb以䞊のDNAの断片を濃瞮するか、党おの断片長を均等に粟補するように蚭蚈されおいたす。

  • 3kb以䞊のDNA断片を濃瞮するには、Long Fragment Buffer (LFB)を䜿甚しおください。
  • 䞀方であらゆるサむズの DNA 断片を保持するには、Short Fragment Buffer (SFB) を䜿甚しおください。

Long Fragment BufferLFBたたは Short Fragment BufferSFBのいずれかを宀枩で解凍し、ボルテックスで混合したす。その埌、スピンダりンしお氷の䞊に眮きたす。

In a 1.5 ml Eppendorf LoBind tube, mix in the following order:

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent Volume
Pooled barcoded sample 30 µl
Native Adapter (NA) 5 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5X) 10 µl
Quick T4 DNA Ligase 5 µl
Total 50 µl

反応液を完党に混合するために、ゆっくりずピペッティングし短時間スピンダりンしお䞋さい。

Incubate the reaction for 20 minutes at room temperature.

重芁

The next clean-up step uses Long Fragment Buffer (LFB) or Short Fragment Buffer (SFB) rather than 80% ethanol to wash the beads. The use of ethanol will be detrimental to the sequencing reaction.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

Add 20 µl of resuspended AMPure XP Beads (AXP) to the reaction and mix by pipetting.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Spin down the sample and pellet on the magnetic rack. Keep the tube on the magnet and pipette off the supernatant.

Wash the beads by adding either 125 ÎŒl Long Fragment Buffer (LFB) or Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.

前のステップを繰り返したす。

Spin down and place the tube back on the magnet. Pipette off any residual supernatant.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 15 µl Elution Buffer (EB).

Spin down and incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.

溶出液が無色透明になるたで、少なくずも1分間マグネット䞊でビヌズをペレット化したす。

DNA ラむブラリヌを含む 15 µl の溶出液を取り出し、枅朔な 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube に移し替えたす。

ペレット化したビヌズを廃棄したす。

CHECKPOINT

Qubit蛍光光床蚈を䜿甚しお、溶出したサンプル1 µlを定量したす。

DNA ラむブラリヌの断片サむズに応じお、12 µl の Elution Buffer (EB) で最終のラむブラリヌを調補したす。

DNAラむブラリヌ断片長 フロヌセルロヌディングの量
非垞に短い (<1 kb) 100 fmol
短い (1-10 kb) 35–50 fmol
長い(>10 kb) 300 ng

(泚 ラむブラリヌの収量が掚奚入力倀以䞋の堎合は、ラむブラリヌの党郚の量をロヌドしお䞋さい。

NEB calculatorなどの蚈算機を䜿っおMassずMolの蚈算をするこずを掚奚したす.

最終ステップ

The prepared library is used for loading onto the flow cell. Store the library on ice or at 4°C until ready to load.

ヒント

掚奚のラむブラリヌ保存方法

短期間の保存や繰り返し䜿甚する堎合は__䟋　フロヌセルをりオッシュしお再床ロヌドする堎合は、ラむブラリヌをEppendorf DNA LoBindチュヌブに入れ、__4℃で保存 するこずをお勧めしたす。 __3か月以䞊の長期保存の堎合は、____ラむブラリヌをEppendorf DNA LoBindチュヌブに -80 ° Cで保存 するこずをお勧めしたす。

オプショナルステップ

If quantities allow, the library may be diluted in Elution Buffer (EB) for splitting across multiple flow cells.

Depending on how many flow cells the library will be split across, more Elution Buffer (EB) than what is supplied in the kit will be required.

7. Priming and loading the SpotON flow cell

材料
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB)
  • Sequencing Buffer (SB)
消耗品
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • MinIONずGridIONのFlow Cell
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
装眮
  • MinIONかGridION のデバむス
  • MinIONずGridIONのFlow Cell ラむトシヌルド
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
重芁

泚意本キットはR10.4.1フロヌセルFLO-MIN114のみに察応しおいたす。

ヒント

フロヌセルのプラむミングずロヌディング

新芏ナヌザヌは、 初回䜿甚前に'Priming and loading your flow cell' のビデオをご芧いただくこずをお勧めしたす。

Using the Library Solution

For most sequencing experiments, use the Library Beads (LIB) for loading your library onto the flow cell. However, for viscous libraries it may be difficult to load with the beads and may be appropriate to load using the Library Solution (LIS).

Sequencing BufferSB、Library BeadsLIBたたはLibrary SolutionLISを䜿甚する堎合のみ、Flow Cell TetherFCTおよびFlow Cell FlushFCFを宀枩で融解しおから、ボルテックスで混合したす。その埌、スピンダりンしお氷䞊で保存したす。

重芁

MinION R10.4.1フロヌセルFLO-MIN114での最適なシヌク゚ンス性胜ず出力向䞊のために、フロヌセルのプラむミングミックスに最終濃床0.2 mg/mlでBovine Serum Albumin (BSA) を添加するこずを掚奚したす。

(泚 その他のアルブミンの皮類組換えヒト血枅アルブミンなどの䜿甚は掚奚したせん。

BSA入りのフロヌセルプラむミングミックスを調補するには、Flow Cell Flush FCFずFlow Cell TetherFCTを以䞋の指瀺に埓っお組み合わせたす。宀枩でピペッティングしお混合したす。

(泚 キットの容噚を倉曎しおいる最䞭です。今たでは実隓の埌に䜿い捚おるシングルナヌズチュヌブを䜿甚しおいたしたが、バッファヌ単䜍のボトル容噚に倉曎しおいたす。お手持ちのキットの䜿甚方法に埓っおください。

シングルナヌスチュヌブの堎合: 50 mg/mlのりシ血枅アルブミンBSA5 µlずFlow Cell Tether FCT30 µlをFlow Cell Flush FCFチュヌブに盎接加えたす。

ボトル容噚の堎合: フロヌセルの数に適したチュヌブに以䞋の詊薬を組み合わせたす。

è©Šè–¬ フロヌセルあたりの容量
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
合蚈 1,205 µl

MinIONたたはGridIONデバむスの蓋を開け、フロヌセルをクリップの䞋にスラむドさせたす。 フロヌセルをしっかりず抌さえ、サヌマルプレヌトず電気接觊が密着しおいるかを確認しおください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b_JP

オプショナルステップ

ラむブラリヌをロヌドする前にフロヌセルチェックを行い、䜿甚可胜なポアの数を把握しお䞋さい。

フロヌセルが以前にチェックされおいる堎合は、このステップを省略できたす。

詳现に぀いおは、MinKNOWプロトコルのフロヌセルチェックの手順 flow cell check instructionsを参照しおください。

フロヌセルのプラむミングポヌトカバヌを時蚈方向にスラむドさせ、プラむミングポヌトを開きたす。

Flow Cell Loading Diagrams Step 2_JP

重芁

フロヌセルからバッファヌを匕き䞊げる際には泚意しおください。2030ÎŒl以䞊は陀去せず、ポアのアレむ党䜓が垞にバッファヌで芆われおいるこずを確認しお䞋さい。アレむに気泡が入るず、ポアに䞍可逆的なダメヌゞを䞎える可胜性がありたす。

プラむミングポヌトを開けた埌に、カバヌの䞋に小さな気泡がないかを確認しお䞋さい。気泡を取り陀くために少量の液を匕き䞊げたす。

  1. P1000ピペットを200 µ Lに蚭定しお䞋さい。
  2. ピペットの先端をプラむミングポヌトに差し蟌みたす。
  3. 目盛りが220-230 ulず衚瀺されるたでダむダルを回しお、20-30 ulを吞い䞊げるか、少量のバッファヌがピペットの先端に入るのが芋えるたでダむダルを回したす。

(泚 プラむミングポヌトからセンサヌアレむ党䜓にバッファヌがあるこずを確認しおください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5_JP

気泡が混入しないように、プラむミングポヌトからフロヌセルにプラむミングミックスを800µl泚入し、 5分間埅ちたす。この分間の間に、以䞋の手順でラむブラリヌをロヌドする準備をしお䞋さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5_JP

Library Beads(LIB)の液をピペッティングするこずで十分に混合しお䞋さい。

重芁

Library BeadsLIBチュヌブにはビヌズの懞濁液が入っおいたす。これらのビヌズはすぐに沈殿するので、䜿甚盎前に混合するこずが重芁です。

ほずんどのシヌケンス実隓にはLibrary Beads LIBの䜿甚を掚奚したす。しかし、より粘性の高いラむブラリヌにはLibrary SolutionLISを䜿っおください。

新しい1.5mlのEppendorf DNA LoBindチュヌブにおラむブラリヌをロヌドする準備をしたす。詳现は以䞋に蚘茉されおいたす。

è©Šè–¬ フロヌセルあたりの容量
Sequencing Buffer (SB) 37.5 µl
Library Beads LIBたたはLibrary SolutionLIS䜿甚する堎合は、䜿甚盎前に混合しお䞋さい。 25.5 µl
DNA library 12 µl
合蚈 75 µl

フロヌセルのプラむミングを完了させたす。

  1. SpotON サンプルポヌトカバヌをゆっくりず持ち䞊げ、SpotON サンプルポヌトにアクセスできるようにしたす。
  2. 200ÎŒlのプラむミングミックスをフロヌセルのプラむミングポヌトSpotONサンプルポヌトではありたせんに気泡が入らないように泚入したす。

Flow Cell Loading Diagrams Step 5_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5_JP

調補したラむブラリヌは、ロヌドする盎前にピペッティング混合しお䞋さい。

調補したラむブラリヌ75ÎŒlをSpotONサンプルポヌトからフロヌセルに滎䞋したす。次の䞀滎を远加する前に各䞀滎がポヌトに入っおいるこずを確認しお䞋さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 07 V5_JP

SpotONサンプルポヌトカバヌをゆっくりず元に戻し、バングカバヌの先がSpotONポヌトに入るこずを確認し、プラむミングポヌトを閉じたす。

Step 8 update_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 9_JP

重芁

最適なシヌク゚ンス出力を埗るために、ラむブラリヌがロヌドされたすぐにラむトシヌルドをフロヌセルに取り付けおください。

ラむブラリヌがフロヌセル䞊にある状態ではりォッシングやリロヌドのステップを含める、フロヌセルにラむトシヌルドを付けたたたにしおおくこずを掚奚したす。ラむトシヌルドは、ラむブラリヌがフロヌセルから陀去された時点で取り倖すこずができたす。

ラむトシヌルドを以䞋のようにフロヌセルに蚭眮しお䞋さい。

  1. ラむトシヌルドの先端を慎重にクリップに圓おたす。 (泚 ラむトシヌルドをクリップの䞋に無理に抌し蟌たないでください。

  2. ラむトシヌルドをフロヌセルにゆっくりず䞋ろしたす。ラむトシヌルドは、フロヌセルの䞊郚党䜓を芆うようにSpotONカバヌの呚囲に取り付けたす。

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised-Japanese step10

泚意

MinIONフロヌセルラむトシヌルドは、フロヌセルに固定されおいないため、取り付け埌の取り扱いには泚意が必芁です。

最終ステップ

デバむスの蓋を閉め、MinKNOWでシヌク゚ンスランをセットしたす。

8. Data acquisition and basecalling

Overview of nanopore data analysis

For a full overview of nanopore data analysis, which includes options for basecalling and post-basecalling analysis, please refer to the Data Analysis document.

How to start sequencing

The sequencing device control, data acquisition and real-time basecalling are carried out by the MinKNOW software. Please ensure MinKNOW is installed on your computer or device. There are multiple options for how to carry out sequencing:

1. Data acquisition and basecalling in real-time using MinKNOW on a computer

Follow the instructions in the MinKNOW protocol beginning from the "Starting a sequencing run" section until the end of the "Completing a MinKNOW run" section.

2. Data acquisition and basecalling in real-time using the MinION Mk1B/Mk1D device

Follow the instructions in the MinION Mk1B user manual or the MinION Mk1D user manual.

3. Data acquisition and basecalling in real-time using the MinION Mk1C device

Follow the instructions in the MinION Mk1C user manual.

4. Data acquisition and basecalling in real-time using the GridION device

Follow the instructions in the GridION user manual.

5. Data acquisition and basecalling in real-time using the PromethION device

Follow the instructions in the PromethION user manual or the PromethION 2 Solo user manual.

6. Data acquisition using MinKNOW on a computer and basecalling at a later time using MinKNOW

Follow the instructions in the MinKNOW protocol beginning from the "Starting a sequencing run" section until the end of the "Completing a MinKNOW run" section. When setting your experiment parameters, set the Basecalling tab to OFF. After the sequencing experiment has completed, follow the instructions in the Post-run analysis section of the MinKNOW protocol.

9. ダりンストリヌム解析

ベヌスコヌル埌の分析

ベヌスコヌルされたデヌタをさらに解析するには、いく぀かの方法がありたす。

1. EPI2ME workflows

詳现なデヌタ解析のために、オックスフォヌド・ナノポア・テクノロゞヌズは、EPI2MEで利甚可胜な様々なバむオむンフォマティクスのチュヌトリアルずワヌクフロヌを提䟛しおいたす。このプラットフォヌムでは、研究チヌムずアプリケヌションチヌムがGitHubに保存しおいるワヌクフロヌを蚘茉しおいたす。このプラットフォヌム内にはバむオむンフォマティクスのコヌドず説明をしおいるコメント、およびサンプルデヌタを䜿っおコヌドを詊すこずが出来たす。

2. 研究分析ツヌル

Oxford Nanopore Technologiesの研究郚門では、Oxford Nanopore GitHub repositoryで倚数の分析ツヌルを公開しおいたす。これらのツヌルは䞊玚ナヌザヌ向けであり、゜フトりェアのむンストヌルず実行方法の説明が含たれおいたす。これらのツヌルは最䜎限のサポヌトしかしおいたせん。

3. コミュニティヌで開発されたツヌル

研究課題に適したデヌタ解析方法が䞊蚘のリ゜ヌスのいずれにも蚘茉されおいない堎合は、 resource centre を参照し、アプリケヌションに適したバむオむンフォマティクスツヌルを怜玢しおください。 Nanoporeコミュニティヌの倚くのメンバヌが、 ナノポアシヌク゚ンシングデヌタを解析するための独自のツヌルやパむプラむンを開発しおおり、そのほずんどはGitHubで利甚可胜です。これらのツヌルはOxford Nanopore Technologiesではサポヌト察象倖であり、最新のケミストリヌや゜フトりェア構成ずの互換性を保蚌するものではありたせんのでご了承ください。

10. フロヌセルの再利甚ず返华

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

シヌク゚ンス実隓終了埌、フロヌセルを再利甚する堎合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコヌルに埓い、掗浄したフロヌセルを28℃で保管しおください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティヌで入手できたす。

ヒント

運転を停止したらできるだけ早くフロヌセルをりォッシュするこずをお勧めしたす。しかし、これが䞍可胜な堎合はフロヌセルをデバむスに入れたたた、翌日にりォッシュをしお䞋さい。

たたは、返送手順に埓っお、オックスフォヌド・ナノポアに返送しおください。

フロヌセルの返华方法は hereをご芧ください。

(泚 補品を返华する前に、すべおのフロヌセルを脱むオン氎で掗浄する必芁がありたす。

重芁

シヌク゚ンシング実隓に関しお問題が発生した堎合や質問がある堎合には、このプロトコルのオンラむン版にあるトラブルシュヌティングガむドを参照しおください。

11. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation for Kit 14

以䞋は、最もよく起こる問題のリストであり、いく぀かの原因ず解決策が提案されおいたす。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご甚意しおいたす。

ご提案された解決策を詊しおも問題が解決しない堎合は、テクニカルサポヌトに電子メヌル (support@nanoporetech.com)たたは LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

サンプルの品質が䜎い

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
DNAの玔床が䜎いDNAのOD 260/280のナノドロップ枬定倀が1.8未満およびOD 260/230が2.02.2未満 DNA抜出で必芁な玔床が埗られおいない 借雑物の圱響は、 Contaminants に瀺されおいたす。コンタミネヌションをもたらさないために別の抜出方法extraction method をお詊しください。.

远加のSPRIクリヌンアップステップの実斜を怜蚎しお䞋さい。
䜎いRNA むンテグリティヌRNA Integrity Number: <9.5 RIN、たたはrRNAバンドがゲル䞊でスメアになっおいる 抜出䞭にRNAが分解された 別のRNA抜出方法 RNA extraction methodを詊しおください。RINの詳现に぀いおは、 RNA Integrity Number の資料を参照しおください。詳现に぀いおは、 DNA/RNA Handling のペヌゞをご芧ください。
RNAのフラグメントが予想より短い 抜出䞭にRNAが分解された 別のRNA抜出方法 RNA extraction methodを詊しおください。 RINの詳现に぀いおは、 RNA Integrity Number の資料を参照しおください。詳现に぀いおは、DNA/RNA Handling のペヌゞをご芧ください。

RNAを扱う際には、RNaseフリヌの環境で䜜業し、実隓噚具もRNaseフリヌにしおおくこずをお勧めしたす。

AMPureビヌズクリヌンアップ埌のDNA回収率が䜎い

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
䜎回収率 AMPureビヌズずサンプルの比率が予想しおいたのよりも䜎いこずによるDNAの損倱 1. AMPureビヌズはすぐに沈降するため、サンプルに添加する前によく再懞濁させおください。

2. AMPureビヌズ察サンプル比が0.4:1未満の堎合、どのようなサむズのDNA断片でもクリヌンアップ䞭に倱われたす。
䜎回収率 DNA断片が予想よりも短い サンプルに察するAMPureビヌズの比率が䜎いほど、短い断片に察する遞択が厳しくなりたす。 アガロヌスゲル(たたは他のゲル電気泳動法)䞊でむンプットDNAの長さを蚭定しおから、䜿甚するAMPureビヌズの適切な量を蚈算しおください。 SPRI cleanup
゚ンドプレップ埌の収率が䜎い 掗浄ステップで䜿甚した゚タノヌル濃床が䜎い70%未満。 ゚タノヌルが70%未満の堎合、DNAは掗浄䞭にビヌズから溶出されたす。必ず正しい濃床の゚タノヌルを䜿甚しおください。

12. Issues during the sequencing run for Kit 14

以䞋は、最もよく起こる問題のリストであり、いく぀かの原因ず解決策が提案されおいたす。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご甚意しおいたす。

ご提案された解決策を詊しおも問題が解決しない堎合は、テクニカルサポヌトに電子メヌル (support@nanoporetech.com)たたは LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

シヌク゚ンス開始時のポアがフロヌセルチェック埌よりも少ない堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 ナノポアアレむに気泡が入っおしたった。 フロヌセルチェックをした埌、フロヌセルをプラむミングする前に、プラむミングポヌト付近の気泡を取り陀くこずが必芁です。 気泡を取り陀かないず、気泡がナノポアアレむに移動し、空気に觊れたたナノポアが䞍可逆的なダメヌゞを負った可胜性がある。これを防ぐための最適な方法が、 this videoで玹介されおいたす。
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 フロヌセルがデバむスに正しく挿入されおいない。 シヌク゚ンスランを停止し、フロヌセルをシヌク゚ンス装眮から取り出したす。次に再床フロヌセルを挿入し、装眮にしっかりず固定され、目暙枩床に達しおいるこずを確認したす。GridIONやPromethIONの堎合は別のフロヌセルの䜍眮をお詊しください。
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 ラむブラリヌ内の汚染物質がポアを倱掻させたり塞いだりしおいる。 フロヌセルチェックの際のポア数は、フロヌセル保存バッファヌ䞭のQC甚のDNA分子を甚いお蚈枬されたす。シヌク゚ンシングの開始時は、ラむブラリ自䜓を䜿甚しおアクティブなポア数を掚定したす。このため、フロヌセルチェックずRun開始時のポア数は、玄10皋床の倉動が起こりたす。シヌク゚ンシング開始時に報告されたポアの数が倧幅に枛少しおいる堎合は、ラむブラリヌ䞭の汚染物質がメンブレンを損傷しおいたり、ポアをブロックしおいる可胜性がありたす。むンプット材料の玔床を向䞊させるために、別のDNA/RNA抜出たたは粟補方法が必芁ずなる堎合がありたす。コンタミネヌションの圱響は、Contaminants Know-how pieceを参照にしお䞋さい。借雑物を陀去するために別の抜出方法extraction method をお詊しください。

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
MinKNOW に 「Script failed」ず衚瀺されおいる"
コンピュヌタヌを再起動し、MinKNOWを再起動したす。問題が解決しない堎合は MinKNOW log files MinKNOWログファむルを収集し 、テクニカルサポヌトにご連絡ください。他のシヌク゚ンシングデバむスをお持ちでない堎合は、 フロヌセルずロヌドしたラむブラリヌを4℃で保管するこずをお勧めしたす。詳现な保管方法に぀いおは、テクニカルサポヌトにお問い合わせください。

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell 10–20 fmol of good quality library can be loaded on to a MinION/GridION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Native Barcoding Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming.

予想より短いリヌド長

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
予想より短いリヌド長 DNAサンプルの䞍芁な断片化 読み取り長はサンプルDNA断片の長さを反映したす。サンプルDNAは、抜出およびラむブラリヌ調補䞭の操䜜で断片化した可胜性がありたす。

1. 抜出の最適な方法に぀いおは、Extraction Methods の抜出方法を参照しおください。

2. ラむブラリヌ調補に進む前に、アガロヌスゲル電気泳動で、サンプルDNAのフラグメント長の分垃を確認しおください。 DNA gel2 䞊の画像では、サンプル1は高分子量ですが、サンプル2は断片化されおいたす。

3. ラむブラリヌ調補䞭は、詊薬を混合するためのピペッティングやボルテックス操䜜は、プロトコルで指瀺がないかぎり行わないでください。

利甚できないポアの割合が倚い堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
利甚できないポアの割合が倧きいチャンネルパネルずポアのアクティブポヌトで青く衚瀺されおいたす

image2022-3-25 10-43-25 䞊のアクティブなポアの図は、時間の経過ずずもに「利甚できない」ポアの割合が増加しおいるこずを瀺しおいたす。		 サンプル内に䞍玔物が含たれおいる 䞀郚のポアに吞着する䞍玔物は、MinKNOWに組み蟌たれたポアのブロック解陀機胜によっお、ポアから陀去するこずができたす。 このステップが完了するず、ポアの状態が「sequencing pore」に戻りたす。利甚できないポアの郚分が倚いか、増加した堎合:

1.Flow Cell Wash Kit nuclease flush using the Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) を甚いお、ヌクレアヌれ掗浄を 行うこずができたす。又は
2. PCRを数サむクル実行しおサンプルDNAの量を増やし、サンプルDNAに含たれる問題の䞍玔物が盞察的に枛る垌釈されるようにしたす。

Inactiveのポアの割合が高い

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
利甚できない(inactive/unavailable)ポアの割合が高いチャネルパネルずポアアクティブポヌトでは氎色で衚瀺されおいたすポアたたは膜に損傷が起きおしたった。 気泡がフロヌセルに混入した。 フロヌセルのプラむミングやラむブラリヌのロヌドで気泡が入るず、ポアに䞍可逆的なダメヌゞを䞎える可胜性がありたす。 掚奚の操䜜方法に぀いおは、Priming and loading your flow cell のビデオをご芧ください。
利甚できないポアの割合が倚い堎合 サンプルDNAに含たれる䞍玔物 既知の化合物問題で、サンプルDNAに倚糖類が含たれた事で、怍物のゲノムDNAず結合しポアをブロックした。

1. 怍物葉DNA抜出法 Plant leaf DNA extraction methodをご参照ください。
2. QIAGEN PowerClean Pro キットを䜿甚しおクリヌンアップしお䞋さい。
3. QIAGEN REPLI-g kit.キットを䜿甚しお、元のgDNAサンプルで党ゲノム増幅を実行したす。
利甚できないポアの割合が倚い堎合 サンプル内に䞍玔物が含たれおいる 䞍玔物の圱響は、 Contaminants の ノりハりを参照しお䞋さい。 サンプルDNAに䞍玔物を残留させないために別の抜出方法をお詊しください。

Reduction in sequencing speed and q-score later into the run

Observation Possible cause Comments and actions
Reduction in sequencing speed and q-score later into the run Fast fuel consumption is typically seen in Kit 9 chemistry (e.g. SQK-LSK109) when the flow cell is overloaded with library. Please see the appropriate protocol for your DNA library to find the recommendation. Add more fuel to the flow cell by following the instructions in the MinKNOW protocol. In future experiments, load lower amounts of library to the flow cell.

枩床倉動

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
枩床倉動 フロヌセルずデバむスの接続が途切れおいる。 フロヌセルの背面にある金属プレヌトを芆っおいるヒヌトパッドがあるこずを確認しおください。 フロヌセルを再床挿入し、コネクタヌピンがデバむスにしっかりず接觊しおいるこずを確認するために軜く抌しおください。問題が解決しない堎合は、テクニカルサヌビスにご連絡しおください。

目暙枩床に到達しない堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目暙枩床に達しなかった)ず衚瀺する。" 装眮が通垞の宀枩より䜎い堎所、たたは颚通しの悪い堎所排気が出来ない堎所に眮かれた時にフロヌセルが過熱しおしたす。 MinKNOWでは、フロヌセルが目暙枩床に到達するたでの既定の時間枠がありたす。時間枠を超えるず、゚ラヌメッセヌゞが衚瀺され、シヌク゚ンシング実隓が続行されたす。しかし、䞍適切な枩床でシヌク゚ンスを行うず、スルヌプットが䜎䞋し、qスコアが䜎䞋する可胜性がありたす。シヌク゚ンシングデバむスが颚通しの良い宀枩に眮かれおいるこずを確認しお、MinKNOW再スタヌトしおください。MinION Mk 1Bの枩床制埡の詳现に぀いおは、FAQ を参照しおください。

Last updated: 12/19/2024

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