基因组DNA连接法测序 - 免扩增条形码测序试剂盒-24（SQK-NBD114.24）
MinION: Protocol
基因组DNA连接法测序 - 免扩增条形码测序试剂盒-24（SQK-NBD114.24） V NBE_9169_v114_revS_20Nov2024
本中文版本对应的英文原文实验指南版本为：NBE_9169_v114_revS_15Sep2022。
为天然基因组DNA文库添加条形码
- 需使用免扩增条形码测序试剂盒-24 V14 (SQK-NBD114.24)
- 无需PCR扩增
- 使用多达24种条形码
- 可分析天然DNA
- 与R10.4.1 测序芯片兼容
仅供研究使用
FOR RESEARCH USE ONLY
概览
本中文版本对应的英文原文实验指南版本为：NBE_9169_v114_revS_15Sep2022。
为天然基因组DNA文库添加条形码
- 需使用免扩增条形码测序试剂盒-24 V14 (SQK-NBD114.24)
- 无需PCR扩增
- 使用多达24种条形码
- 可分析天然DNA
- 与R10.4.1 测序芯片兼容
仅供研究使用
1. 实验指南概览
免扩增条形码试剂盒-24 V14 实验指南简介
本实验指南详细描述了使用免扩增条形码测序试剂盒-24 V14（SQK-NBD114.24）为基因组DNA（gDNA）样品进行免扩增添加条码建库测序的操作流程及常见问题的解决方法。试剂盒内含24种不同的条形码，可实现多达24个不同样本的混样测序。为使您尽快熟悉操作流程，我们强烈建议您在使用样品测序前，先使用Lambda标准品完成标准对照实验。
测序工作流程：
准备您的实验
您将需要：
- 提取DNA，并评估DNA的长度、浓度和纯度。 质量评估步骤对确保实验成功至关重要。
- 确保您已准备好测序试剂盒、正确的仪器以及第三方试剂。
- 下载数据收集和分析软件。
- 检查您的测序芯片上有足够多的活性纳米孔，以确保测序良好运行。
文库制备
您将需要：
- 修复DNA，并对DNA进行末端修复以便与接头连接。
- 将试剂盒中提供的免扩增条码连接到DNA末端。
- 将试剂盒中提供的测序接头连接到DNA末端。
- 对测序芯片进行预处理，将DNA文库加至芯片。
测序和分析
您将需要：
- 使用MinKNOW软件开始测序。该软件会通过测序仪收集原始数据，并将其识别成碱基序列。
- 通过MinKNOW或Guppy碱基识别进行条形码拆分，选择“SQK-NBD114.24 试剂盒”选项。
- 使用EPI2ME软件，选择所需工作流程进行进一步分析（此步骤非必需）。
重要
我们不建议在测序前混合含条码文库与无条码文库。
重要
实验方案适用性
本实验方案只适用于与以下产品搭配使用：
- 免扩增条形码测序试剂盒-24（SQK-NBD114.24）
- R10.4.1 测序芯片（FLO-MIN114）
- 测序芯片清洗剂盒 (EXP-WSH004)
- 测序辅助扩展包 V14 (EXP-AUX003)
- 免扩增条形码扩展包 V14 (EXP-NBA114)
2. 仪器及耗材
材料
- 免扩增条形码测序试剂盒-24 V14（SQK-NBD114.24）
- 如使用多于4种条形码，则各样本的gDNA起始量为 400 ng
- 如使用少于等于4种条形码，则各样本的gDNA起始量为 1000 ng
耗材
- NEB Blunt/TA 连接酶预混液（NEB，M0367）
- NEBNext FFPE修复混合液（NEB，M6630）
- NEBNext Ultra II 末端修复/ dA尾添加模块（NEB，E7546）
- NEBNext 快速连接模块（NEB，E6056）
- Eppendorf低吸附twin.tec®96孔PCR板，半裙边（Eppendorf™，0030129504）带热封
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- 2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
- 新制备的80%乙醇（用无核酸酶水配制）
- Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
- Qubit dsDNA HS Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32851）
- （非必需）牛血清白蛋白（BSA）（50 mg/mL）（例如 Invitrogen™ UltraPure™ BSA （50 mg/mL）， AM2616）
仪器
- Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
- 微孔板离心机，如Fisherbrand™ 微孔板迷你离心机（Fisher Scientific, 11766427）
- 迷你离心机
- 磁力架
- 涡旋混匀仪
- 热循环仪
- 多通道移液枪和枪头
- P1000 移液枪和枪头
- P200 移液枪和枪头
- P100 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
- P10 移液枪和枪头
- P2移液枪和枪头
- 盛有冰的冰桶
- 计时器
- Eppendorf 5424 离心机（或等效器材）
- Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
可选仪器
- Nanodrop 分光光度计
本实验指南中，我们建议以下起始量：
- 如使用多于4种条形码，我们推荐各样本的起始量为400ng
- 如使用不超过4种条形码，我们推荐各样本的起始量为1000ng
起始DNA
DNA质控
选择符合质量和浓度要求的起始DNA至关重要的。使用过少或过多的DNA，或者质量较差的DNA（如，高度碎片化、含有RNA或化学污染物的DNA）都会影响文库制备。
有关如何对DNA样品进行质控，请参考起始DNA/RNA质控实验指南 。
化学污染物
从原始样本中提取DNA的方法不同，可能会导致经纯化的DNA中所残留的化学污染物不同。这会影响文库的制备效率和测序质量。请在牛津纳米孔社区的 Contaminants（污染物）页面 了解更多信息。
第三方试剂
Oxford Nanopore Technologies推荐您使用本实验指南中提及的所有第三方试剂，并已对其加以验证。我们尚未对其它替代试剂进行测试。
我们建议您按制造商说明准备待用的第三方试剂.
重要
本试剂盒及实验指南中所使用的免扩增接头（NA） 不能与其它测序接头互换使用。
免扩增条形码测序试剂盒-24 V14（SQK-NBD114.24）内容物
请注意： 我们正在将试剂盒中的条形码包装更改为96孔板形式。这一改动将减少塑料浪费，并支持自动化应用。
孔板形式
| 名称 | 缩写 | 管盖颜色 | 管数 | 每管溶液体积 (μl) |
|---|---|---|---|---|
| DNA参照 | DCS | 黄色 | 2 | 35 |
| 免扩增接头 | NA | 绿色 | 1 | 40 |
| 测序缓冲液 | SB | 红色 | 1 | 700 |
| 文库颗粒 | LIB | 粉色 | 1 | 600 |
| 文库溶液 | LIS | 白色管盖，粉色标签 | 1 | 600 |
| 洗脱缓冲液 | EB | 黑色 | 2 | 500 |
| AMPure XP 磁珠 | AXP | 透明管盖，浅青色标签 | 1 | 6,000 |
| 长片段缓冲液 | LFB | 橙色 | 1 | 1,800 |
| 短片段缓冲液 | SFB | 透明 | 1 | 1,800 |
| EDTA | EDTA | 蓝色 | 1 | 700 |
| 测序芯片冲洗液 | FCF | 透明管盖，浅蓝色标签 | 1 | 8,000 |
| 测序芯片系绳 | FCT | 紫色 | 1 | 200 |
| 免扩增条形码孔板 | NB01-24 | - | 两板，每板三套条形码组合 | 每孔15µl |
请注意： 本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20°C 下储存（试剂稳定性将不受损害）。
请注意： DNA参照（DCS）是一段可比对到Lambda基因组的3'端、长度为3.6 kb 的标准扩增子。
管装形式
| 名称 | 缩写 | 管盖颜色 | 管数 | 每管溶液体积 (μl) |
|---|---|---|---|---|
| 免扩增条形码 | NB01-24 | 透明 | 24 (每种条形码一管) | 20 μl |
| DNA参照 | DCS | 黄色 | 2 | 35 |
| 免扩增接头 | NA | 绿色 | 1 | 40 |
| 测序缓冲液 | SB | 红色 | 1 | 700 |
| 文库颗粒 | LIB | 粉色 | 1 | 600 |
| 文库溶液 | LIS | 白色管盖，粉色标签 | 1 | 600 |
| 洗脱缓冲液 | EB | 黑色 | 2 | 500 |
| AMPure XP 磁珠 | AXP | 透明管盖，浅青色标签 | 1 | 6,000 |
| 长片段缓冲液 | LFB | 橙色 | 1 | 1,800 |
| 短片段缓冲液 | SFB | 透明 | 1 | 1,800 |
| EDTA | EDTA | 蓝色 | 1 | 700 |
| 测序芯片冲洗液 | FCF | 透明管盖，浅蓝色标签 | 1 | 8,000 |
| 测序芯片系绳 | FCT | 紫色 | 1 | 200 |
请注意： 本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20°C 下储存（试剂稳定性将不受损害）。
请注意： DNA参照（DCS）是一段可比对到Lambda基因组的3'端、长度为3.6 kb 的标准扩增子。
您可考虑购买免扩增条形码扩展包（EXP-NBA114）及测序辅助扩展包（EXP-AUX003），以最大化利用免扩增条形码试剂盒。
上述扩展包旨在提供额外的建库及测序芯片预处理试剂，方便用户使用条形码测序试剂盒中剩余的少部分条形码运行测序实验。
当联用时，两扩展包内试剂可满足12次反应。如果您在此过程中需要额外的 EDTA，我们建议使用浓度为0.25M的EDTA。如果您使用不超过24种条码进行建库，则建议为每个样本添加4 µl的EDTA；如果使用25至96种条码进行建库，则建议添加2 µl。
免扩增条形码扩展包（EXP-NBA114）内容物：
请注意： 本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20℃储存（试剂稳定性将不受损害）。
测序辅助扩展包 V14（EXP-AUX003）内容物：
免扩增条形码的序列
| 内容物 | 正向序列 | 反向序列 |
|---|---|---|
| NB01 | CACAAAGACACCGACAACTTTCTT | AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG |
| NB02 | ACAGACGACTACAAACGGAATCGA | TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT |
| NB03 | CCTGGTAACTGGGACACAAGACTC | GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG |
| NB04 | TAGGGAAACACGATAGAATCCGAA | TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA |
| NB05 | AAGGTTACACAAACCCTGGACAAG | CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT |
| NB06 | GACTACTTTCTGCCTTTGCGAGAA | TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC |
| NB07 | AAGGATTCATTCCCACGGTAACAC | GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT |
| NB08 | ACGTAACTTGGTTTGTTCCCTGAA | TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT |
| NB09 | AACCAAGACTCGCTGTGCCTAGTT | AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT |
| NB10 | GAGAGGACAAAGGTTTCAACGCTT | AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC |
| NB11 | TCCATTCCCTCCGATAGATGAAAC | GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA |
| NB12 | TCCGATTCTGCTTCTTTCTACCTG | CAGGTAGAAAGAAGCAGAATCGGA |
| NB13 | AGAACGACTTCCATACTCGTGTGA | TCACACGAGTATGGAAGTCGTTCT |
| NB14 | AACGAGTCTCTTGGGACCCATAGA | TCTATGGGTCCCAAGAGACTCGTT |
| NB15 | AGGTCTACCTCGCTAACACCACTG | CAGTGGTGTTAGCGAGGTAGACCT |
| NB16 | CGTCAACTGACAGTGGTTCGTACT | AGTACGAACCACTGTCAGTTGACG |
| NB17 | ACCCTCCAGGAAAGTACCTCTGAT | ATCAGAGGTACTTTCCTGGAGGGT |
| NB18 | CCAAACCCAACAACCTAGATAGGC | GCCTATCTAGGTTGTTGGGTTTGG |
| NB19 | GTTCCTCGTGCAGTGTCAAGAGAT | ATCTCTTGACACTGCACGAGGAAC |
| NB20 | TTGCGTCCTGTTACGAGAACTCAT | ATGAGTTCTCGTAACAGGACGCAA |
| NB21 | GAGCCTCTCATTGTCCGTTCTCTA | TAGAGAACGGACAATGAGAGGCTC |
| NB22 | ACCACTGCCATGTATCAAAGTACG | CGTACTTTGATACATGGCAGTGGT |
| NB23 | CTTACTACCCAGTGAACCTCCTCG | CGAGGAGGTTCACTGGGTAGTAAG |
| NB24 | GCATAGTTCTGCATGATGGGTTAG | CTAACCCATCATGCAGAACTATGC |
3. 计算机要求及软件
MinION Mk1C的IT配置要求
MinION Mk1C是一款集计算功能和触控屏幕于一体的便携式测序分析仪，它无需依赖任何额外设备，即可生成并分析纳米孔测序数据。您可以在 MinION Mk1C的IT配置要求文件中了解更多。
MinION Mk1B的IT配置要求
请为MinION Mk1B配备一台高规格的计算机或笔记本电脑，以适配数据采集的速度。您可以在MinION Mk1B的IT配置要求文件中了解更多。
纳米孔测序相关软件
MinKNOW
MinKNOW软件负责控制纳米孔测序仪、实时收集测序数据并进行碱基识别。您将在每次测序实验中使用MinKNOW。MinKNOW还可以通过条形码标记序列，并在测序完成后对数据进行碱基/序列识别及拆分。
有关如何运行MinKNOW软件的说明，请参考 MinKNOW实验指南中的相关部分。
EPI2ME （可选）
EPI2ME云端平台为下机数据提供进一步的分析（如，与Lambda基因组比对、条形码拆分、或分类学鉴定）。EPI2ME 仅 在您需要对下机数据进一步分析时使用。
有关如何创建EPI2ME账户并安装EPI2ME桌面代理（EPI2ME Desktop Agent）的说明，请参考EPI2ME平台使用指南。
测序芯片质检
我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到MinION /GridION /PremethION测序芯片12周之内进行，或者在您收到Flongle测序芯片四周内进行。Oxford Nanopore Technologies会对活性孔数量少于以下标准的芯片进行替换** ：
| 测序芯片 | 芯片上的活性孔数确保不少于 |
|---|---|
| Flongle 测序芯片 | 50 |
| MinION/GridION 测序芯片 | 800 |
| PromethION 测序芯片 | 5000 |
** 请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于Oxford Nanopore Technologies推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两天内递交给我们。请您按照 测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。
4. DNA损伤及末端修复
材料
- 每种条形码需要400ng的基因组DNA
- 如使用少于等于4种条形码，则各样本的gDNA起始量为 1000 ng
- AMPure XP 磁珠（AXP）
- DNA参照（DCS）
耗材
- NEBNext FFPE DNA 修复混合液（NEB，M6630）
- NEBNext® Ultra II 末端修复/ dA尾添加模块（NEB，E7546）
- 新制备的80%乙醇（用无核酸酶水配制）
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- Eppendorf低吸附twin.tec®96孔PCR板，半裙边（Eppendorf™，0030129504）带热封
- 或 0.2ml 薄壁PCR管
- 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
- Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
- Qubit dsDNA HS Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（Invitrogen, Q32851）
仪器
- P1000 移液枪和枪头
- P200 移液枪和枪头
- P100 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
- P10 移液枪和枪头
- P2 移液枪和枪头
- 多通道移液枪和枪头
- 热循环仪
- 微孔板离心机，如Fisherbrand™ 微孔板迷你离心机（Fisher Scientific, 11766427）
- 迷你离心机
- 盛有冰的冰桶
- 磁力架
- 涡旋混匀仪
- Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
- Qubit荧光计 （或用于质控检测的等效仪器）
提示
如样本中含有长片段gDNA，我们推荐您使用宽口枪头吹打混匀，以尽量避免打断DNA。
将DNA参照（DCS）和AMPure XP磁珠（AXP）于室温下解冻，并涡旋振荡混匀。然后将DNA参照（DCS）置于冰上，将磁珠继续置于室温。
根据生产厂家的说明准备NEBNext FFPE DNA 修复混合液和 NEBNext Ultra II 末端修复/ dA尾添加模块，并置于冰上。
为获得最优表现，NEB建议如下：
于冰上解冻所有试剂。
轻弹并/或翻转各管，确保各试剂充分混匀。
注意： 请切勿涡旋振荡 FFPE DNA修复混合液或 Ultra II末端修复酶混合物。同一日内首次打开一管试剂前，请务必先将该管试剂瞬时离心。
Ultra II 末端修复缓冲液和 FFPE DNA 修复缓冲液内可能出现少量沉淀。待此两管液体回复至室温后，使用移液枪上下吹打数次，打散沉淀；然后涡旋振荡30秒，以确保沉淀充分溶解。
注意： 请务必涡旋振荡混匀缓冲液。FFPE DNA 修复缓冲液可能轻微泛黄，不影响使用。
重要
勿涡旋振荡NEBNext FFPE DNA 修复混合液或NEBNext Ultra II 末端修复酶混合物。
重要
请务必涡旋振荡NEBNext FFPE DNA 修复缓冲液及NEBNext Ultra II末端修复反应缓冲液，以充分混匀。
查看是否有残留沉淀。涡旋振荡至少30秒以溶解所有沉淀。
向一管DNA参照（DCS）中加入105 µl 洗脱缓冲液（EB）以稀释DCS，上下吹打混匀并瞬时离心。
稀释后的DNA参照可供140个样本使用，剩余部分可于-20℃下保存。
提示
我们推荐您在制备文库时，加入1μl 的DNA参照，以便日后进行问题排查。您也可以选择跳过此步骤，以额外的1μl DNA样本替代。
在清洁的0.2ml薄壁PCR管（或洁净的96孔板）中，按下述方法准备各DNA样本（每个样本对应一支PCR管）：
- 如使用多于4种条形码，则向对应管内加入400ng样本
- 如使用少于或等于4种条形码，则向对应各管内加入1000ng样本
使用无核酸酶水将每个样本的体积补足至11 µl。轻轻吹打混匀，并瞬时离心。
在各0.2ml的薄壁PCR管/板孔中，混合以下试剂：
每添加一样试剂后，请吹打混匀10-20次，再添加下一样试剂。
| 试剂 | 体积 |
|---|---|
| DNA 样本 | 11 µl |
| 稀释后的DNA参照 (DCS) | 1 µl |
| NEBNext FFPE DNA 修复缓冲液 | 0.875 µl |
| Ultra II 末端修复反应缓冲液 | 0.875 µl |
| Ultra II 末端修复酶混合物 | 0.75 µl |
| NEBNext FFPE DNA 修复混合液 | 0.5 µl |
| 总体积 | 15 µl |
提示
我们建议您首先根据样本总数制备足量的、由FFPE DNA修复试剂及末端修复试剂组成的预混液，再向每支PCR管/每个板孔内加入3µl该预混液。
充分吹打混匀管中试剂，并于离心机内瞬时离心。
使用热循环仪，在20℃下孵育5分钟，然后在65℃下孵育5分钟。
将各样本分别转至对应的洁净的1.5 ml Eppendorf DNA LoBind离心管中。
涡旋振荡以重悬AMPure XP磁珠（AXP）。
将15µl重悬的AMPure XP磁珠（AXP）加入上述各DNA末端修复反应体系中，轻弹离心管以充分混合。
将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育5分钟。
使用无核酸酶水，新鲜制备足量的80%乙醇。请为每个样本预留至少400 µl，并留有余量。
将样品瞬时离心，并静置于磁力架上待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去清液。
保持离心管在磁力架上不动，以200µl新鲜制备的80%乙醇洗涤磁珠。小心不要扰动磁珠。用移液枪将乙醇吸走并弃掉。
如在此过程中不慎扰动磁珠，请静待磁珠和液相分离后再吸出乙醇。
重复上述步骤。
将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的乙醇。让磁珠在空气中干燥30秒，但不要干至表面开裂。
将离心管从磁力架上移开，并将磁珠重悬于10µl无核酸酶的水中。瞬时离心，然后在室温下孵育2分钟。
将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。
将10µl洗脱液转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind管中。
- 弃掉磁珠。
CHECKPOINT
取1µl的各洗脱样本，用Qubit荧光计分别定量。
步骤结束
取等摩尔质量的各样本，用于稍后的免扩增条形码连接步骤。如需要，您也可以此时将样品置于4℃储存过夜。
5. 免扩增条形码连接
材料
- 免扩增条形码（NB01-24）
- AMPure XP 磁珠（AXP）
- EDTA（EDTA）
耗材
- NEB Blunt/TA 连接酶预混液（NEB，M0367）
- 新制备的80%乙醇（用无核酸酶水配制）
- 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind离心管
- Eppendorf低吸附twin.tec®96孔PCR板，半裙边（Eppendorf™，0030129504）带热封
- 或 0.2ml 薄壁PCR管
- Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
- Qubit dsDNA HS Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32851）
仪器
- 磁力架
- 涡旋混匀仪
- Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
- 迷你离心机
- 热循环仪
- 盛有冰的冰桶
- 多通道移液枪和枪头
- P1000 移液枪和枪头
- P200 移液枪和枪头
- P100 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
- P10 移液枪和枪头
- P2 移液枪和枪头
- Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
根据生产厂家的说明准备NEB Blunt/TA 连接酶预混液，并置于冰上：
于室温下解冻试剂。
瞬时离心试剂管5秒。
上下吹打整管试剂10次，以确保充分混匀。
于室温下解冻EDTA，并涡旋振荡混匀，然后瞬时离心，置于冰上。
在室温下解冻免扩增条形码（NB01-24）。短暂离心后，根据样本数量分别吹打混匀所需条形码，然后置于冰上。
为计划上样于同一测序芯片的各样本选择不同的条形码。一个实验最多可为24个样本添加条码并混样测序。
请注意： 每个样本使用一种条形码。
对每个样本，在一支洁净的 0.2ml PCR管内/96孔板的一个孔内，按下表顺序依次添加试剂：
每添加一样试剂后，请吹打混匀10-20次，再添加下一样试剂。
| 试剂 | 体积 |
|---|---|
| 经过末端修复的DNA | 7.5 µl |
| 免扩增条形码（NB01-24） | 2.5 µl |
| Blunt/TA 连接酶预混液 | 10 µl |
| 总体积 | 20 µl |
轻轻吹打以充分混匀，并瞬时离心。
室温下孵育20分钟。
按下表向每管/每孔内加入对应体积的EDTA，吹打混匀，然后瞬时离心。
注意： 请根据EDTA的管盖颜色进行相应操作。
| EDTA 管盖颜色 | 每孔／每管体积 |
|---|---|
| 透明管盖的EDTA | 2 µl |
| 蓝色管盖的EDTA | 4 µl |
提示
在此步骤中添加EDTA的目的是终止反应。
于一支洁净的1.5 ml Eppendorf DNA LoBind离心管中，混合已连接条形码的各DNA样本。
注意： 请根据EDTA的管盖颜色进行相应操作。
| 每个样本的体积 | ６个样本 | 12个样本 | 24个样本 | |
|---|---|---|---|---|
| 使用 透明管盖的EDTA 时，合并后样本总体积 | 22 µl | 132 µl | 264 µl | 528 µl |
| 使用 蓝色管盖的EDTA 时，合并后样本总体积 | 24 µl | 144 µl | 288 µl | 576 µl |
提示
我们建议您在合并各带条码样本前后均查看各PCR管/板孔内液体体积是否相同，确保已将所有液体转移至离心管内。
涡旋振荡以重悬AMPure XP磁珠（AXP）。
向混合的反应体系内加入0.4X AMPure XP磁珠（AXP），吹打混匀。
注意： 请根据EDTA的管盖颜色进行相应操作。
| 每个样本的体积 | ６个样本 | 12个样本 | 24个样本 | |
|---|---|---|---|---|
| 如使用 透明管盖的EDTA ，需加入的AXP磁珠的体积 | 9 µl | 53 µl | 106 µl | 211 µl |
| 如使用 蓝色管盖的EDTA ，需加入的AXP磁珠的体积 | 10 µl | 58 µl | 115 µl | 230 µl |
将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育10分钟。
准备 2 ml 新制备的80％乙醇（用无核酸酶水配制）。
将样品瞬时离心，再静置于磁力架上5分钟待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，直到洗脱液澄清无色，吸出上清。
保持离心管在磁力架上不动，以700µl新鲜制备的80%乙醇洗涤磁珠。小心不要扰动磁珠。用移液枪将乙醇吸走并弃掉。
如在此过程中不慎扰动磁珠，请静待磁珠和液相分离后再吸出乙醇。
重复上述步骤。
将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的乙醇。让磁珠在空气中干燥约30秒，但不要干至表面开裂。
将离心管从磁力架上移开。将磁珠重悬于35µl的无核酸酶水中，轻弹离心管混匀。
37℃下孵育10分钟。请每两分钟轻弹离心管10秒以搅动样本，促进DNA洗脱。
将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。
将此35µl洗脱液转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind管中。
CHECKPOINT
取1µl洗脱样品，用Qubit荧光计定量。
步骤结束
连有条形码的DNA样本将用于稍后的接头连接及纯化步骤。如需要，您也可以此时将样品置于4℃储存过夜。
6. 接头连接及纯化
材料
- 长片段缓冲液（LFB）
- 短片段缓冲液（SFB）
- 洗脱缓冲液（EB）
- 免扩增接头（NA）
- AMPure XP 磁珠（AXP）
耗材
- NEBNext®快速连接模块（NEB，E6056）
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
- Qubit dsDNA HS Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32851）
仪器
- 迷你离心机
- 磁力架
- 涡旋混匀仪
- Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
- 热循环仪
- P1000 移液枪和枪头
- P200 移液枪和枪头
- P100 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
- P10 移液枪和枪头
- 盛有冰的冰桶
- Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
重要
本试剂盒及实验指南中所使用的免扩增接头（NA） 不能与其它测序接头互换使用。
根据生产厂家的说明准备NEBNext 快速连接反应模块，并置于冰上：
于室温下解冻试剂。
瞬时离心试剂管5秒。
下吹打全部体积的试剂10次，以确保充分混匀。 注意： 请勿涡旋振荡快速T4 DNA连接酶。
NEBNext快速连接反应缓冲液（5x）内可能存在少量沉淀。请待该缓冲液回复至室温后，吹打数次使沉淀溶解，再涡旋振荡数秒以充分混匀。
重要
请勿涡旋振荡快速T4 DNA连接酶。
将免扩增接头（NA）和T4连接酶瞬时离心后吹打混匀，然后置于冰上。
将洗脱缓冲液（EB）于室温下解冻，涡旋振荡混匀后，再瞬时离心，置于冰上。
重要
接头连接后的纯化步骤，可通过选择不同缓冲液，按需富集大于3kb的DNA片段（LFB），或均等纯化所有大小的片段（SFB）。
- 如若富集3kb或更长的DNA片段，请使用长片段缓冲液（LFB）
- 如需保留所有大小的DNA片段，请使用短片段缓冲液（SFB）
请在室温下按需解冻一管长片段缓冲液（LFB）或短片段缓冲液（SFB），涡旋振荡混合，瞬时离心后置于冰上。
在一支1.5ml Eppendorf LoBind离心管内，将所有试剂按以下顺序混合：
每添加一样试剂后，请吹打混匀10-20次，再添加下一样试剂。
| 试剂 | 体积 |
|---|---|
| 混合后的含条码样本 | 30 µl |
| 免扩增接头（NA） | 5 µl |
| NEBNext快速连接反应缓冲液（5X） | 10 µl |
| NEBNext快速T4 DNA连接酶 | 5 µl |
| 总体积 | 50 µl |
轻轻吹打以充分混匀，并瞬时离心。
室温下孵育20分钟。
重要
以下纯化步骤中使用长片段缓冲液（LFB）或短片段缓冲液（SFB）洗涤磁珠，而非80%乙醇。使用乙醇将对测序反应产生不利影响。
涡旋振荡以重悬AMPure XP磁珠。
将20µl重悬的AMPure XP磁珠加入反应体系中，吹打混匀。
将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育10分钟。
将样品瞬时离心，并静置于磁力架上待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去清液。
用125μl的长片段缓冲液（LFB）或短片段缓冲液（SFB）洗涤磁珠。轻弹离心管将磁珠混匀后，将离心管瞬时离心，再放回磁力架，静置待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸出清液并丢弃。
重复上述步骤。
将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的清液。
将离心管从磁力架上移开。将磁珠重悬于15µl洗脱缓冲液中（EB）。
瞬时离心，然后在37℃下孵育10分钟。请每两分钟轻弹离心管10秒以搅动样本，促进DNA洗脱。
将离心管静置于磁力架上至少一分钟，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。
将此15µl洗脱液转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind管中。
丢弃磁珠
CHECKPOINT
取1µl洗脱样品，用Qubit荧光计定量。
根据您的 DNA 文库片段的大小，请使用洗脱缓冲液（EB）将最终文库的体积调整至 12 µl。
| 文库片段长度 | 测序芯片上样量 |
|---|---|
| 非常短 (<1 kb) | 100 fmol |
| 短 (1-10 kb) | 35–50 fmol |
| 长 (>10 kb) | 300 ng |
请注意： 如您的文库产量低于我们的推荐值，请使用全部文库上样。
您可按需使用质量与摩尔数转换计算器，如 NEB 计算器。
步骤结束
构建好的文库即可用于测序芯片上样。在上样前，请将文库置于冰上。
提示
文库保存建议
若为 短期 保存或重复使用（例如在清洗芯片后再次上样），我们建议将文库置于Eppendorf LoBind 离心管中 4℃ 保存。 若为一次性使用且储存时长 __超过3个月__，我们建议将文库置于Eppendorf LoBind 离心管中 -80℃ 保存。
可选操作
如DNA文库量足够，您可选择使用洗脱缓冲液（EB）稀释文库，再拆分上样至多张测序芯片。
根据测序芯片的数目，洗脱缓冲液的实际需求量可能会高于本试剂盒中该缓冲液的供应量。
7. SpotON 测序芯片的预处理及上样
材料
- 测序芯片冲洗液（FCF）
- 测序芯片系绳（FCT）
- 文库溶液（LIS）
- 文库颗粒（LIB）
- 测序缓冲液（SB）
耗材
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- MinION 和 GridION测序芯片
- 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
- （非必需）牛血清白蛋白（BSA）（50 mg/mL）（例如 Invitrogen™ UltraPure™ BSA （50 mg/mL）， AM2616）
仪器
- MinION 或 GridION 测序仪
- MinION 及GridION 测序芯片遮光片
- P1000 移液枪和枪头
- P100 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
- P10 移液枪和枪头
重要
请注意：本试剂盒仅兼容R10.4.1测序芯片（FLO-MIN114）。
使用文库溶液
对大多数测序实验，我们建议您使用文库颗粒（LIB）给测序芯片上样。然而，对于粘稠的文库，借助文库颗粒上样可能会比较困难，此时使用文库溶液（LIS）可能更为合适。
于室温下解冻测序缓冲液（SB）、文库颗粒（LIB）或文库溶液（LIS）、测序芯片系绳（FCT）和一管测序芯片冲洗液（FCF）。完全解冻后，涡旋振荡混匀，然后瞬时离心并置于冰上。
重要
为在MinION及GridION R10.4.1测序芯片（FLO-MIN114）上获得最优的测序表现并提高测序产出，我们推荐您向测序芯片预处理液中加入终浓度为0.2 mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）。
请注意： 我们不推荐使用其它类型的白蛋白（例如重组人血清白蛋白）。
按下表制备测序芯片的预处理液，室温下吹打混匀。
请注意： 我们正在将部分试剂的包装形式由单次管装改为瓶装。请按照与您所用试剂盒包装相对应的说明操作。
单次使用管装： 向一整管测序芯片冲洗液（FCF）中加入5µl 50mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）及 30µl 测序芯片系绳（FCT）。
瓶装： 请另拿一支适当体积的离心管制备测序芯片预处理液：
| 试剂 | 体积（每张芯片） |
|---|---|
| 测序芯片冲洗液 (FCF) | 1,170 µl |
| 50mg/ml的牛血清白蛋白 (BSA) | 5 µl |
| 测序芯片系绳 (FCT) | 30 µl |
| 总体积 | 1,205 µl |
打开MinION或GridION测序仪的盖子，将测序芯片插入金属固定夹的下方。用力向下按压芯片，以确保正确的热、电接触。
顺时针转动预处理孔孔盖，使预处理孔显露出来。
重要
从测序芯片中反旋排出缓冲液。请勿吸出超过20-30µl的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。
将预处理孔打开后，检查孔周围是否有小气泡。请按照以下方法，从孔中排出少量液体以清除气泡：
- 将P1000移液枪转至200µl刻度。
- 将枪头垂直插入预处理孔中。
- 反向转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在220-230 µl之间，或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。
__请注意：__ 肉眼检查，确保从预处理孔到传感器阵列的缓冲液连续且无气泡。
通过预处理孔向芯片中加入800µl预处理液，避免引入气泡。等待5分钟。在此期间，请按照以下步骤准备用于上样的DNA文库。
将含有文库颗粒的LIB管用移液枪吹打混匀。
重要
LIB管内的文库颗粒分散于悬浮液中。由于颗粒沉降速度非常快，因此请在混匀颗粒后立即使用。
对于大多数测序实验，我们建议您使用文库颗粒（LIB）。但如文库较为粘稠，您可考虑使用文库溶液（LIS）。
在一支新的1.5ml Eppendorf LoBind离心管中，按下表所示准备上样文库：
| 试剂 | 体积（每张测序芯片） |
|---|---|
| 测序缓冲液（SB） | 37.5 µl |
| 文库颗粒（LIB），使用前即时混匀；或文库溶液（LIS） | 25.5 µl |
| DNA文库 | 12 µl |
| 总体积 | 75 µl |
完成测序芯片的预处理：
- 轻轻地翻起SpotON上样孔盖，使SpotON上样孔显露出来。
- 通过预处理孔（而 非 SpotON加样孔）向芯片中加入200µl预处理液，避免引入气泡。
临上样前，用移液枪轻轻吹打混匀制备好的文库。
通过SpotON加样孔向芯片中逐滴加入75µl样品。确保液滴流入孔内后，再加下一滴。
轻轻合上SpotON加样孔孔盖，确保塞头塞入加样孔内。逆时针转动预处理孔孔盖，盖上预处理孔。
重要
为获得最佳测序产出，在文库样本上样后，请立即在测序芯片上安装遮光片。
我们建议在清洗芯片并重新上样时，将遮光片保留在测序芯片上。一旦文库从测序芯片中吸出，即可取下遮光片。
按下述步骤安装测序芯片遮光片：
小心将遮光片的前沿（平端）与金属固定夹的边沿对齐。 请注意： 请勿将遮光片强行压到固定夹下方。
将遮光片轻轻盖在测序芯片上。遮光片的SpotON加样孔孔盖缺口应与芯片上的SpotON加样孔孔盖接合，遮盖住整个测序芯片的前部。
注意
MinION测序芯片的遮光片并非固定在测序芯片上，因此当为芯片加装遮光片后，请小心操作。
步骤结束
小心合上测序设备上盖并在MinKNOW上设置测序实验。
8. 数据采集和碱基识别
纳米孔数据分析概览
有关纳米孔数据分析的完整概述，包括碱基识别和次级分析，请参阅 数据分析 文档。
如何开始测序
MinKNOW软件负责仪器控制，数据采集和实时碱基识别。如您已在计算机上安装MinKNOW，则可选择以下几种途径开展测序：
1. 使用计算机上的MinKNOW进行实时数据采集和碱基识别
请按照 MinKNOW 实验指南 的说明：从“开始测序”部分起，到“MinKNOW运行结束”部分止。
2. 使用GridION进行实时数据采集和碱基识别
请参照 GridION 用户手册 中的说明。
3. 使用MinION Mk1C测序仪进行实时数据采集和碱基识别
请参照 MinION Mk1C 使用指南中的说明。
4. 使用PromethION测序仪进行实时数据采集和碱基识别
请参照 PromethION 使用指南 或 PromethION 2 Solo 使用指南中的说明。
5. 使用计算机上的MinKNOW进行数据采集，过后再用NinKNOW进行线下碱基识别
请按照 MinKNOW 实验指南 中的说明：从“开始测序”部分起，到“MinKNOW运行结束”部分止。 当您设置实验参数时，请将 碱基识别 选项设为“关”。 测序实验结束后，请按照 MinKNOW 实验指南的本地分析 部分操作。
9. 下游分析
下游分析
您可以选择以下几个途径来进一步分析经过碱基识别的数据：
1. EPI2ME 工作流程
Oxford Nanopore Technologies通过EPI2ME Labs平台提供了一系列针对高阶数据分析的生物信息学教程和工作流程。上述资源汇总于纳米孔社区的 EPI2ME Labs 板块。该平台通过描述性文字、生物信息学代码和示例数据，具象化地展示出我们的研究和应用团队发布在 GitHub 上的工作流程。
2. 科研分析工具
Oxford Nanopore Technologies的研发部门开发了许多分析工具，您可在Oxford Nanopore的 GitHub 资料库中找到。这些工具面向有一定经验的用户，并包含如何安装和运行软件的说明。工具以源代码形式提供，因此我们仅提供有限的技术支持。
3. 纳米孔社区用户开发的分析工具
如果以上工具仍无法为您提供解决研究问题的分析方法，请参考资源中心的生物信息学板块。该板块汇总了许多由纳米孔社区成员开发、且在Github上开源的、针对纳米孔数据的生信分析工具。请注意，Oxford Nanopore Technologies不为这些工具提供支持，也不能保证它们与测序所用的最新的化学试剂/软件配置兼容。
10. 测序芯片的重复利用及回收
材料
- 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）
完成测序实验后，如您希望再次使用测序芯片，请按照测序芯片清洗试剂盒的说明进行操作，并将清洗后的芯片置于2-8℃保存。
您可在纳米孔社区获取 测序芯片清洗试剂盒实验指南。
提示
我们建议您在停止测序实验后尽快清洗测序芯片。如若无法实现，请将芯片留在测序设备上，于下一日清洗。
请按照“回收程序”清洗好芯片，以便送回Oxford Nanopore。
您可在 此处找到回收测序芯片的说明。
请注意： 在将测序芯片寄回之前，请使用去离子水对每张芯片进行冲洗。
重要
如果您遇到问题或对测序实验有疑问，请参阅本实验指南在线版本中的“疑难解答指南”一节。
11. 在DNA/RNA提取和使用Kit 14建库过程中可能出现的问题
以下表格列出了常见问题，以及可能的原因和解决方法。
我们还在 Nanopore 社区的“Support”板块 提供了常见问题解答（FAQ）。
如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮(support@nanoporetech.com)）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们。
低质量样本
| 现象 | 可能原因 | 措施及备注 |
|---|---|---|
| 低纯度DNA（Nanodrop测定的DNA吸光度比值260/280<1.8，260/230 <2.0-2.2） | 用户所使用的DNA提取方法未能达到所需纯度 | 您可在 污染物专题技术文档 中查看污染物对后续文库制备和测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法。 请考虑将样品再次用磁珠纯化。 |
| RNA完整度低（RNA完整值（RIN）<9.5，或rRNA在电泳凝胶上的条带呈弥散状） | RNA在提取过程中降解 | 请尝试其它 RNA 提取方法。您可在 RNA完整值专题技术文档 中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅 DNA/RNA 操作 页面。 |
| RNA的片段长度短于预期 | RNA在提取过程中降解 | 请尝试其它 RNA 提取方法。 您可在 RNA完整值专题技术文档中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅DNA/RNA 操作 页面。 我们建议用户在无RNA酶污染的环境中操作，并确保实验设备没有受RNA酶污染. |
经AMPure磁珠纯化后的DNA回收率低
| 现象 | 可能原因 | 措施及备注 |
|---|---|---|
| 低回收率 | AMPure磁珠量与样品量的比例低于预期，导致DNA因未被捕获而丢失 | 1. AMPure磁珠的沉降速度很快。因此临加入磁珠至样品前，请确保将磁珠重悬充分混匀。 2. 当AMPure磁珠量与样品量的比值低于0.4:1时，所有的DNA片段都会在纯化过程中丢失。 |
| 低回收率 | DNA片段短于预期 | AMPure磁珠量与样品量的比值越低，针对短片段的筛选就越严格。每次实验时，请先使用琼脂糖凝胶（或其他凝胶电泳方法）确定起始DNA的长度，并据此计算出合适的AMPure磁珠用量。  |
| 末端修复后的DNA回收率低 | 清洗步骤所用乙醇的浓度低于70% | 当乙醇浓度低于70%时，DNA会从磁珠上洗脱下来。请确保使用正确浓度的乙醇。 |
12. Kit 14 测序过程中可能出现的问题
以下表格列出了常见问题，以及可能的原因和解决方法。
我们还在 Nanopore 社区的“Support”板块 提供了常见问题解答（FAQ）。
如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮(support@nanoporetech.com)）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们。
Mux扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数
| 现象 | 可能原因 | 措施及备注 |
|---|---|---|
| MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 | 纳米孔阵列中引入了气泡 | 在对通过质控的芯片进行预处理之前，请务必排出预处理孔附近的气泡。否则，气泡会进入纳米孔阵列对其造成不可逆转地损害。 视频中演示了避免引入气泡的最佳操作方法。 |
| MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 | 测序芯片没有正确插入测序仪 | 停止测序，将芯片从测序仪中取出，再重新插入测序仪内。请确保测序芯片被牢固地嵌入测序仪中，且达到目标温度。如用户使用的是GridION/PromethION测序仪，也可尝试将芯片插入仪器的其它位置进行测序。 |
| inKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 | 文库中残留的污染物对纳米孔造成损害或堵塞 | 在测序芯片质检阶段，我们用芯片储存缓冲液中的质控DNA分子来评估活性纳米孔的数量。而在测序开始时，我们使用DNA文库本身来评估活性纳米孔的数量。因此，活性纳米孔的数量在这两次评估中会有约10%的浮动。 如测序开始时报告的孔数明显降低，则可能是由于文库中的污染物对膜结构造成了损坏或将纳米孔堵塞。用户可能需要使用其它的DNA/RNA提取或纯化方法，以提高起始核酸的纯度。您可在 污染物专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法 。 |
MinKNOW脚本失败
| 现象 | 可能原因 | 措施及备注 |
|---|---|---|
| MinKNOW显示 "Script failed”（脚本失败） | 重启计算机及MinKNOW。如问题仍未得到解决，请收集 MinKNOW 日志文件 并联系我们的技术支持。 如您没有其他可用的测序设备，我们建议您先将装有文库的测序芯片置于4°C 储存，并联系我们的技术支持团队获取进一步储存上的建议。 |
纳米孔利用率低于40%
| 现象 | 可能原因 | 措施及备注 |
|---|---|---|
| 纳米孔利用率<40% | 测序芯片中的文库量不足 | 向MinION/GridION测序芯片中加入10–20 fmol的优质文库。请在上样前对文库进行定量，并使用 Promega Biomath Calculator 等工具中的“ dsDNA：µg to pmol”功能来计算DNA分子的摩尔量。 |
| 纳米孔利用率接近0 | 尽管您使用了免扩增条形码测序试剂盒，但在接头连接后的纯化步骤中，您并未使用LFB或SFB洗涤，而是选用了酒精。 | 酒精可导致测序接头上的马达蛋白变性。请确保在测序接头连接后使用LFB或SFB。 |
| 纳米孔利用率接近0 | 测序芯片中无系绳 | 系绳（FCT管）随预处理液加入芯片。因此在制备预处理液时，请确保将FCT加入测序芯片冲洗液（FCF）中。 |
读长短于预期
| 现象 | 可能原因 | 措施及备注 |
|---|---|---|
| 读长短于预期 | DNA样本降解 | 读长反映了起始DNA片段的长度。起始DNA在提取和文库制备过程中均有可能被打断。 1. 1. 请查阅纳米孔社区中的 提取方法 以获得最佳DNA提取方案。 2. 在进行文库制备之前，请先跑电泳，查看起始DNA片段的长度分布。  在上图中，样本1为高分子量DNA，而样本2为降解样本。3. 在制备文库的过程中，请避免使用吹打或/和涡旋振荡的方式来混合试剂。轻弹或上下颠倒离心管即可。 |
大量纳米孔处于不可用状态
| 现象 | 可能原因 | Comments and actions |
|---|---|---|
大量纳米孔处于不可用状态 (在通道面板和纳米孔活动状态图上以蓝色表示)  上方的纳米孔活动状态图显示：状态为不可用的纳米孔的比例随着测序进程而不断增加。 | 样本中含有污染物 | 使用MinKNOW中的“Unblocking”（疏通）功能，可对一些污染物进行清除。 如疏通成功，纳米孔的状态会变为"测序孔". 若疏通后，状态为不可用的纳米孔的比例仍然很高甚至增加： 1. 用户可使用 测序芯片冲洗试剂盒（EXP-WSH004）进行核酸酶冲洗 can be performed, 操作，或 2. 使用PCR扩增目标片段，以稀释可能导致问题的污染物。 |
大量纳米孔处于失活状态
| 现象 | 可能原因 | 措施及备注 |
|---|---|---|
| 大量纳米孔处于失活状态（在通道面板和纳米孔活动状态图上以浅蓝色表示。膜结构或纳米孔遭受不可逆转地损伤） | 测序芯片中引入了气泡 | 在芯片预处理和文库上样过程中引入的气泡会对纳米孔带来不可逆转地损害。请观看 测序芯片的预处理及上样 视频了解最佳操作方法。 |
| 大量纳米孔处于失活/不可用状态 | 文库中存在与DNA共纯化的化合物 | 与植物基因组DNA相关的多糖通常能与DNA一同纯化出来。 1. 请参考 植物叶片DNA提取方法。 2. 使用QIAGEN PowerClean Pro试剂盒进行纯化。 3. 利用QIAGEN REPLI-g试剂盒对原始gDNA样本进行全基因组扩增。 |
| 大量纳米孔处于失活/不可用状态 | 样本中含有污染物 | 您可在 污染物专题技术文档 中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法。 |
运行过程中过孔速度和数据质量（Q值）降低
| 现象 | 可能原因 | 措施及备注 |
|---|---|---|
| 运行过程中过孔速度和数据质量（Q值）降低 | 对试剂盒9系列试剂（如SQK-LSK109），当测序芯片的上样量过多时（请参阅相应实验指南获取推荐文库用量），能量消耗通常会加快。 | 请按照MinKNOW 实验指南中的说明为测序芯片补充能量。请在后续实验中减少测序芯片的上样量。 |
温度波动
| 现象 | 可能原因 | 措施及备注 |
|---|---|---|
| 温度波动 | 测序芯片和仪器接触不良 | 检查芯片背面的金属板是否有热垫覆盖。重新插入测序芯片，用力向下按压，以确保芯片的连接器引脚与测序仪牢固接触。如问题仍未得到解决，请联系我们的技术支持。 |
未能达到目标温度
| 现象 | 可能原因 | 措施及备注 |
|---|---|---|
| MinKNOW显示“未能达到目标温度” | 测序仪所处环境低于标准室温，或通风不良（以致芯片过热） | MinKNOW会限定测序芯片达到目标温度的时间。当超过限定时间后，系统会显示出错信息，但测序实验仍会继续。值得注意的是，在错误温度下测序可能会导致通量和数据质量（Q值）降低。请调整测序仪的摆放位置，确保其置于室温下、通风良好的环境中后，再在MinKNOW中继续实验。有关MinION MK1B温度控制的更多信息，请参考此 FAQ （常见问题）文档。 |
Last updated: 11/14/2024
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