Rapid Sequencing Kit V14 - gDNA (SQK-RAD114)


概要

The fastest and simplest protocol for genomic DNA involving:

  • ~10 mins library prep
  • Fragmentation
  • No third-party ligase needed
  • No PCR

This is an Early Access product For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

For Research Use Only

Document version: RSE_9177_v114_revM_16Nov2022

1. Overview of the protocol

重要

This is an Early Access product

For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

Please ensure you always use the most recent version of the protocol.

Introduction to Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)

This protocol describes the step-by-step instructions to complete a rapid sequencing of genomic DNA using the Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114). This protocol uses our most recent Kit 14 chemistry and is optimised for a fast library preparation and requires minimal laboratory equipment.

It is highly recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity using the Input DNA/RNA QC protocol.
    The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • If not already installed, download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell(s) to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

You will need to:

Library preparation step Process Time Stop option
Tagmentation Tagment your DNA using the Fragmentation Mix 5 minutes -
Adapter attachment Attach sequencing adapters to the DNA ends 5 minutes We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes -

RAD004 workflow

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and basecall reads.
  • Optional: Start the EPI2ME software and select a workflow for further analysis, e.g. metagenomic analysis or drug resistance mapping.
重要

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

材料
  • 100-150 ng high molecular weight genomic DNA
  • Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)

消耗品
  • MinIONとGridIONのFlow Cell
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes

装置
  • MinIONかGridION のデバイス
  • MinIONとGridIONのFlow Cell ライトシールド
  • Microfuge
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 ピペットとチップ
  • Timer
  • Thermal cycler or heat blocks
オプション装置
  • Qubit蛍光光度計(またはQCチェックのための同等品)

For this protocol, you will need ~100 ng high molecular weight genomic DNA.

Lower inputs can be used but sequencing output will be reduced.

インプットDNA

インプットDNAのQC方法

インプットDNAの量と品質の要件を満たすことが重要です。DNAの使用量が少なすぎたり多すぎたり、あるいは品質の低いDNA(例としてDNAが非常に断片化されていたり、RNAや化学汚染物質が含まれている場合など)を使用すると、ライブラリーの調製に影響を及ぼす可能性があります。

DNAサンプルの品質管理の方法については、Input DNA/RNA QC protocolのプロトコルをご覧ください。

コンタミネーション

DNAの抽出する方法によっては、精製DNAに特定の化学汚染物質が残留する可能性があり、ライブラリ調製の効率やシークエンシングの品質に影響を及ぼす可能性があります。コンタミネーションについての詳細は、コミュニティーの Contaminants page をご覧ください。

サードパーティー試薬

このプロトコールで使用されているすべてのサードパーティー試薬は、当社が検証し、使用を推奨しているものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以外の試薬を用いたテストは行っていません。

すべてのサードパーティ製試薬については、製造元の指示に従って使用の準備をすることをお勧めします。

フローセルのチェックをしてください

シークエンシング実験を開始する前に、フローセルのポアの数を確認することを強くお勧めします。このフローセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの場合は代理店への到着から12週間以内に行ってください。またはFlongle Flow Cellの場合は代理店への到着から4週間以内に行う必要があります。Oxford Nanopore Technologiesは、フローセルチェックの実施から2日以内に結果が報告され、推奨される保管方法に従っていた場合に、以下の表に記載されているナノポアの有効数に満たさない場合には、フローセルを交換します。 フローセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指示に従ってください。

Flow cell 保証する最小有効ポア数(以下の数未満のフローセルが交換対象となります)
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000

Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114) contents

Note: We are in the process of reformatting our kits with single-use tubes into a bottle format.

Single-use tubes format:

RAD114 tubes


Bottle format:

RAD114 bottle

3. Library preparation

材料
  • 100-150 ng high molecular weight genomic DNA
  • Rapid Adapter (RA)
  • Adapter Buffer (ADB)
  • Fragmentation Mix (FRA)

消耗品
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes

装置
  • Thermal cycler or heat blocks
  • P2 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
CHECKPOINT

フローセルのチェックを行ってください。

ライブラリー調製を開始する前にフローセルチェックを行い、良好なシークエンスランに十分なポアを持つフローセルを使用することをお勧めします。

詳細については、MinKNOWプロトコルのflow cell check instructions を参照してください。

Thaw the kit components at room temperature, spin down briefly using a microfuge and mix by pipetting as indicated by the table below:

Reagent 1. Thaw at room temperature 2. Briefly spin down 3. Mix well by pipetting
Fragmentation Mix (FRA) Not frozen
Rapid Adapter (RA) Not frozen
Adapter Buffer (ADB) Not frozen

Once thawed, keep all the kit components on ice.

Prepare the DNA in nuclease-free water.

  • Transfer 100-150 ng genomic DNA into a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
  • Adjust the volume to 10 µl with nuclease-free water
  • Mix by flicking the tube to avoid unwanted shearing
  • Spin down briefly in a microfuge

In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:

Reagent Volume
100-150 ng template DNA 10 μl
Fragmentation Mix (FRA) 1 μl
Total 11 μl

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Incubate the tube at 30°C for 2 minutes and then at 80°C for 2 minutes. Briefly put the tube on ice to cool it down.

CHECKPOINT

The tagmented DNA in 11 μl is taken into the adapter attachment step.

In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, dilute the Rapid Adapter (RA) as follows and pipette mix:

Reagents Volume
Rapid Adapter (RA) 1.5 μl
Adapter Buffer (ADB) 3.5 μl
Total 5 μl

Add 1 μl of diluted Rapid Adapter (RA) to the tagmented DNA.

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Incubate the reaction for 5 minutes at room temperature.

最終ステップ

The prepared DNA library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice until ready to load.

4. Priming and loading the MinION and GridION Flow Cell

材料
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB)
  • Sequencing Buffer (SB)

消耗品
  • MinIONとGridIONのFlow Cell
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes

装置
  • MinIONかGridION のデバイス
  • MinIONとGridIONのFlow Cell ライトシールド
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
重要

注意:本キットはR10.4.1フローセル(FLO-MIN114)のみに対応しています。

ヒント

フローセルのプライミングとローディング

新規ユーザーは、 初回使用前に'Priming and loading your flow cell' のビデオをご覧いただくことをお勧めします。

Sequencing Buffer(SB)、Library Beads(LIB)またはLibrary Solution(LISを使用する場合のみ)、Flow Cell Tether(FCT)およびFlow Cell Flush(FCF)を室温で融解してから、ボルテックスで混合します。その後、スピンダウンして氷上で保存します。

重要

MinION R10.4.1フローセル(FLO-MIN114)での最適なシークエンス性能と出力向上のために、フローセルのプライミングミックスに最終濃度0.2 mg/mlでBovine Serum Albumin (BSA) を添加することを推奨します。

(注: その他のアルブミンの種類(組換えヒト血清アルブミンなど)の使用は推奨しません。

BSA入りのフローセルプライミングミックスを調製するには、Flow Cell Flush (FCF)とFlow Cell Tether(FCT)を以下の指示に従って組み合わせます。室温でピペッティングして混合します。

(注: キットの容器を変更している最中です。今までは実験の後に使い捨てるシングルユーズチューブを使用していましたが、バッファー単位のボトル容器に変更しています。お手持ちのキットの使用方法に従ってください。

シングルユースチューブの場合: 50 mg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)5 µlとFlow Cell Tether (FCT)30 µlをFlow Cell Flush (FCF)チューブに直接加えます。

ボトル容器の場合:: フローセルの数に適したチューブに以下の試薬を組み合わせます。

試薬 1フローセルあたりの容量
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
合計 1,205 µl

MinIONまたはGridIONデバイスの蓋を開け、フローセルをクリップの下にスライドさせます。 フローセルをしっかりと押さえ、サーマルプレートと電気接触が密着しているかを確認してください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b_JP

オプショナルステップ

ライブラリーをロードする前にフローセルチェックを行い、使用可能なポアの数を把握して下さい。

フローセルが以前にチェックされている場合は、このステップを省略できます。

詳細については、MinKNOWプロトコルのフローセルチェックの手順 flow cell check instructionsを参照してください。

フローセルのプライミングポートカバーを時計方向にスライドさせ、プライミングポートを開きます。

Flow Cell Loading Diagrams Step 2_JP

重要

フローセルからバッファーを引き上げる際には注意してください。20~30μl以上は除去せず、ポアのアレイ全体が常にバッファーで覆われていることを確認して下さい。アレイに気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。

プライミングポートを開けた後に、カバーの下に小さな気泡がないかを確認して下さい。気泡を取り除くために少量の液を引き上げます。

  1. P1000ピペットを200 µ Lに設定して下さい。
  2. ピペットの先端をプライミングポートに差し込みます。
  3. 目盛りが220-230 ulと表示されるまでダイヤルを回して、20-30 ulを吸い上げるか、少量のバッファーがピペットの先端に入るのが見えるまでダイヤルを回します。

(注: プライミングポートからセンサーアレイ全体にバッファーがあることを確認してください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5_JP

気泡が混入しないように、プライミングポートからフローセルにプライミングミックスを800µl注入し、 5分間待ちます。この5分間の間に、以下の手順でライブラリーをロードする準備をして下さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5_JP

重要

Library Beads(LIB)チューブにはビーズの懸濁液が入っています。これらのビーズはすぐに沈殿するので、使用直前に混合することが重要です。

ほとんどのシーケンス実験にはLibrary Beads (LIB)の使用を推奨します。しかし、より粘性の高いライブラリーにはLibrary Solution(LIS)を使ってください。

Library Beads(LIB)の液をピペッティングすることで十分に混合して下さい。

新しい1.5mlのEppendorf DNA LoBindチューブにてライブラリーをロードする準備をします。(詳細は以下に記載されています。)

試薬 1フローセルあたりの容量
Sequencing Buffer (SB) 37.5 µl
Library Beads (LIB)またはLibrary Solution(LIS)(使用する場合)は、使用直前に混合して下さい。 25.5 µl
DNA library 12 µl
合計 75 µl

フローセルのプライミングを完了させます。

  1. SpotON サンプルポートカバーをゆっくりと持ち上げ、SpotON サンプルポートにアクセスできるようにします。
  2. 200μlのプライミングミックスをフローセルのプライミングポート(SpotONサンプルポートではありません)に気泡が入らないように注入します。

Flow Cell Loading Diagrams Step 5_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5_JP

調製したライブラリーは、ロードする直前にピペッティング混合して下さい。

調製したライブラリー75μlをSpotONサンプルポートからフローセルに滴下します。次の一滴を追加する前に各一滴がポートに入っていることを確認して下さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 07 V5_JP

SpotONサンプルポートカバーをゆっくりと元に戻し、バング(カバーの先)がSpotONポートに入ることを確認し、プライミングポートを閉じます。

Step 8 update_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 9_JP

重要

最適なシークエンス出力を得るために、ライブラリーがロードされたすぐにライトシールドをフローセルに取り付けてください。

ライブラリーがフローセル上にある状態では(ウォッシングやリロードのステップを含める)、フローセルにライトシールドを付けたままにしておくことを推奨します。ライトシールドは、ライブラリーがフローセルから除去された時点で取り外すことができます。

ライトシールドを以下のようにフローセルに設置して下さい。

  1. ライトシールドの先端を慎重にクリップに当てます。 (注: ライトシールドをクリップの下に無理に押し込まないでください。

  2. ライトシールドをフローセルにゆっくりと下ろします。ライトシールドは、フローセルの上部全体を覆うようにSpotONカバーの周囲に取り付けます。

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised-Japanese step10

注意

MinIONフローセルライトシールドは、フローセルに固定されていないため、取り付け後の取り扱いには注意が必要です。

最終ステップ

デバイスの蓋を閉め、MinKNOWでシークエンスランをセットします。

5. Data acquisition and basecalling

シークエンスの開始方法

フローセルをロードしたら、MinKNOWでシークエンシングランを開始できます。MinKNOWは、装置、データ収集、リアルタイムベースコールを制御するシークエンスソフトウェアです。 MinKNOWの設定と使用の詳細については、MinKNOW Protocolを参照してください。

MinKNOWは、複数の方法でシークエンスの設定をすることができます。

  • シークエンシングデバイスに直接かリモートで接続されているコンピューター。
  • GridION、Minion Mk1C、またはPromethion 24/48シークエンシングデバイスで直接使用できます。

シークエンス装置でMinKNOWを使用する方法の詳細については、装置のユーザーマニュアルを参照してください。


MinKNOWでシークエンスランを開始するには、次の手順に従います。

1. スタートページに移動し、 Start sequencing をクリックします。

2. 名前、フローセルの位置、サンプルIDなどの実験の詳細を入力します。

3. キットのページで、ライブラリー調製に使用するシークエンシングキットを選択します。

4. シークエンスランのパラメータの変更を設定(ランオプションの変更など)するか、デフォルト設定のままにします。

(注: シークエンスランの設定時にベースコールがオフになっていた場合には、MinKNOWでポストラン・ベースコールを後日に実行することも出来ます。詳細については、MinKNOW protocolを参照してください。

5. Start をクリックしてシークエンスランを開始します。

シークエンシング後のデータ解析

MinKNOWでシークエンスが終わると、フローセルを再利用または返却ができます。詳しくは、フローセルの再利用と返却のセクションをご覧ください。

シークエンシングとベースコールの後にはデータを解析することができます。 ベースコールおよびベースコール後の解析オプションの詳細については、Data Analysis を参照してください。

ダウンストリーム解析セクションでは、データを解析するためのオプションの概要を説明しています。

6. フローセルの再利用と返却

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

シークエンス実験終了後、フローセルを再利用する場合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコールに従い、洗浄したフローセルを2~8℃で保管してください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティーで入手できます。

ヒント

運転を停止したらできるだけ早くフローセルをウォッシュすることをお勧めします。しかし、これが不可能な場合はフローセルをデバイスに入れたまま、翌日にウォッシュをして下さい。

または、返送手順に従って、オックスフォード・ナノポアに返送してください。

フローセルの返却方法は hereをご覧ください。

(注: 製品を返却する前に、すべてのフローセルを脱イオン水で洗浄する必要があります。

重要

シークエンシング実験に関して問題が発生した場合や質問がある場合には、このプロトコルのオンライン版にあるトラブルシューティングガイドを参照してください。

7. Downstream analysis

Post-basecalling analysis

There are several options for further analysing your basecalled data:

1. EPI2ME workflows

For in-depth data analysis, Oxford Nanopore Technologies offers a range of bioinformatics tutorials and workflows available in EPI2ME. The platform provides a vehicle where workflows deposited in GitHub by our Research and Applications teams can be showcased with descriptive texts, functional bioinformatics code and example data.

2. Research analysis tools

Oxford Nanopore Technologies' Research division has created a number of analysis tools, which are available in the Oxford Nanopore GitHub repository. The tools are aimed at advanced users, and contain instructions for how to install and run the software. They are provided as-is, with minimal support.

3. Community-developed analysis tools

If a data analysis method for your research question is not provided in any of the resources above, please refer to the resource centre and search for bioinformatics tools for your application. Numerous members of the Nanopore Community have developed their own tools and pipelines for analysing nanopore sequencing data, most of which are available on GitHub. Please be aware that these tools are not supported by Oxford Nanopore Technologies, and are not guaranteed to be compatible with the latest chemistry/software configuration.

8. DNA/RNA抽出、およびライブラリ調製時の問題点

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

サンプルの品質が低い

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
DNAの純度が低い(DNAのOD 260/280のナノドロップ測定値が1.8未満およびOD 260/230が2.0~2.2未満) DNA抽出で必要な純度が得られていない 夾雑物の影響は、 Contaminants に示されています。コンタミネーションをもたらさないために別の抽出方法extraction method をお試しください。.

追加のSPRIクリーンアップステップの実施を検討して下さい。
低いRNA インテグリティー(RNA Integrity Number: <9.5 RIN、またはrRNAバンドがゲル上でスメアになっている) 抽出中にRNAが分解された 別のRNA抽出方法 RNA extraction methodを試してください。RINの詳細については、 RNA Integrity Number の資料を参照してください。詳細については、 DNA/RNA Handling のページをご覧ください。
RNAのフラグメントが予想より短い 抽出中にRNAが分解された 別のRNA抽出方法 RNA extraction methodを試してください。 RINの詳細については、 RNA Integrity Number の資料を参照してください。詳細については、DNA/RNA Handling のページをご覧ください。

RNAを扱う際には、RNaseフリーの環境で作業し、実験器具もRNaseフリーにしておくことをお勧めします。

AMPureビーズクリーンアップ後のDNA回収率が低い

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
低回収率 AMPureビーズとサンプルの比率が予想していたのよりも低いことによるDNAの損失 1. AMPureビーズはすぐに沈降するため、サンプルに添加する前によく再懸濁させてください。

2. AMPureビーズ対サンプル比が0.4:1未満の場合、どのようなサイズのDNA断片でもクリーンアップ中に失われます。
低回収率 DNA断片が予想よりも短い サンプルに対するAMPureビーズの比率が低いほど、短い断片に対する選択が厳しくなります。 アガロースゲル(または他のゲル電気泳動法)上でインプットDNAの長さを設定してから、使用するAMPureビーズの適切な量を計算してください。 SPRI cleanup
エンドプレップ後の収率が低い 洗浄ステップで使用したエタノール濃度が低い(70%未満)。 エタノールが70%未満の場合、DNAは洗浄中にビーズから溶出されます。必ず正しい濃度(%)のエタノールを使用してください。

9. Issues during the sequencing run using a Rapid-based sequencing kit

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

シークエンス開始時のポアがフローセルチェック後よりも少ない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ナノポアアレイに気泡が入ってしまった。 フローセルチェックをした後、フローセルをプライミングする前に、プライミングポート付近の気泡を取り除くことが必要です。 気泡を取り除かないと、気泡がナノポアアレイに移動し、空気に触れたたナノポアが不可逆的なダメージを負った可能性がある。これを防ぐための最適な方法が、 this videoで紹介されています。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 フローセルがデバイスに正しく挿入されていない。 シークエンスランを停止し、フローセルをシークエンス装置から取り出します。次に再度フローセルを挿入し、装置にしっかりと固定され、目標温度に達していることを確認します。GridIONやPromethIONの場合は別のフローセルの位置をお試しください。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ライブラリー内の汚染物質がポアを失活させたり塞いだりしている。 フローセルチェックの際のポア数は、フローセル保存バッファー中のQC用のDNA分子を用いて計測されます。シークエンシングの開始時は、ライブラリ自体を使用してアクティブなポア数を推定します。このため、フローセルチェックとRun開始時のポア数は、約10%程度の変動が起こります。シークエンシング開始時に報告されたポアの数が大幅に減少している場合は、ライブラリー中の汚染物質がメンブレンを損傷していたり、ポアをブロックしている可能性があります。インプット材料の純度を向上させるために、別のDNA/RNA抽出または精製方法が必要となる場合があります。コンタミネーションの影響は、Contaminants Know-how pieceを参照にして下さい。夾雑物を除去するために別の抽出方法extraction method をお試しください。

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
MinKNOW に 「Script failed」と表示されている"
コンピューターを再起動し、MinKNOWを再起動します。問題が解決しない場合は MinKNOW log files MinKNOWログファイルを収集し 、テクニカルサポートにご連絡ください。他のシークエンシングデバイスをお持ちでない場合は、 フローセルとロードしたライブラリーを4℃で保管することをお勧めします。詳細な保管方法については、テクニカルサポートにお問い合わせください。

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell Ensure the correct concentration of good quality library is loaded on to a MinION/GridION flow cell. To check the concentration, please refer to the library preparation protocol. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Rapid Sequencing Kit V14/Rapid Barcoding Kit V14 was used, and sequencing adapters did not attach to the DNA Make sure to closely follow the protocol and use the correct volumes and incubation temperatures. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of reagents.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming.

予想より短いリード長

問題点 予想される原因 解決策とコメント
予想より短いリード長 DNAサンプルの不要な断片化 読み取り長はサンプルDNA断片の長さを反映します。サンプルDNAは、抽出およびライブラリー調製中の操作で断片化した可能性があります。

1. 抽出の最適な方法については、Extraction Methods の抽出方法を参照してください。

2. ライブラリー調製に進む前に、アガロースゲル電気泳動で、サンプルDNAのフラグメント長の分布を確認してください。 DNA gel2 上の画像では、サンプル1は高分子量ですが、サンプル2は断片化されています。

3. ライブラリー調製中は、試薬を混合するためのピペッティングやボルテックス操作は、プロトコルで指示がないかぎり行わないでください。

利用できないポアの割合が多い場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
利用できないポアの割合が大きい(チャンネルパネルとポアのアクティブポートで青く表示されています)

image2022-3-25 10-43-25 上のアクティブなポアの図は、時間の経過とともに「利用できない」ポアの割合が増加していることを示しています。
サンプル内に不純物が含まれている 一部のポアに吸着する不純物は、MinKNOWに組み込まれたポアのブロック解除機能によって、ポアから除去することができます。 このステップが完了すると、ポアの状態が「sequencing pore」に戻ります。利用できないポアの部分が多いか、増加した場合:

1.Flow Cell Wash Kit nuclease flush using the Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) を用いて、ヌクレアーゼ洗浄を 行うことができます。又は
2. PCRを数サイクル実行してサンプルDNAの量を増やし、サンプルDNAに含まれる問題の不純物が相対的に減る(希釈される)ようにします。

Inactiveのポアの割合が高い

問題点 予想される原因 解決策とコメント
利用できない(inactive/unavailable)ポアの割合が高い(チャネルパネルとポアアクティブポートでは水色で表示されています)ポアまたは膜に損傷が起きてしまった。 気泡がフローセルに混入した。 フローセルのプライミングやライブラリーのロードで気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。 推奨の操作方法については、Priming and loading your flow cell のビデオをご覧ください。
利用できないポアの割合が多い場合 サンプルDNAに含まれる不純物 既知の化合物問題で、サンプルDNAに多糖類が含まれた事で、植物のゲノムDNAと結合しポアをブロックした。

1. 植物葉DNA抽出法 Plant leaf DNA extraction methodをご参照ください。
2. QIAGEN PowerClean Pro キットを使用してクリーンアップして下さい。
3. QIAGEN REPLI-g kit.キットを使用して、元のgDNAサンプルで全ゲノム増幅を実行します。
利用できないポアの割合が多い場合 サンプル内に不純物が含まれている 不純物の影響は、 Contaminants の ノウハウを参照して下さい。 サンプルDNAに不純物を残留させないために別の抽出方法をお試しください。

温度変動

問題点 予想される原因 解決策とコメント
温度変動 フローセルとデバイスの接続が途切れている。 フローセルの背面にある金属プレートを覆っているヒートパッドがあることを確認してください。 フローセルを再度挿入し、コネクターピンがデバイスにしっかりと接触していることを確認するために軽く押してください。問題が解決しない場合は、テクニカルサービスにご連絡してください。

目標温度に到達しない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目標温度に達しなかった)と表示する。" 装置が通常の室温より低い場所、または風通しの悪い場所(排気が出来ない場所)に置かれた時にフローセルが過熱してします。 MinKNOWでは、フローセルが目標温度に到達するまでの既定の時間枠があります。時間枠を超えると、エラーメッセージが表示され、シークエンシング実験が続行されます。しかし、不適切な温度でシークエンスを行うと、スループットが低下し、qスコアが低下する可能性があります。シークエンシングデバイスが風通しの良い室温に置かれていることを確認して、MinKNOW再スタートしてください。MinION Mk 1Bの温度制御の詳細については、FAQ を参照してください。

Last updated: 11/11/2024

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