Rapid Sequencing Kit V14 - gDNA (SQK-RAD114)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Rapid Sequencing Kit V14 - gDNA (SQK-RAD114) V RSE_9177_v114_revM_16Nov2022

Este es el protocolo más sencillo y rápido para secuenciar ADN genómico; consiste en:

  • ~10 mins de preparación de la biblioteca
  • Fragmentación
  • No es necesario usar ligasa de otros fabricantes
  • Sin PCR

Producto de acceso anticipado Para tener más información sobre nuestros programas de acceso anticipado, consultar este artículo sobre las fases de lanzamiento del producto.

Para uso exclusivo en investigación

*Este documento es una traducción del protocolo inglés, versión L, publicado el 8 de diciembre de 2023.

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

Este es el protocolo más sencillo y rápido para secuenciar ADN genómico; consiste en:

  • ~10 mins de preparación de la biblioteca
  • Fragmentación
  • No es necesario usar ligasa de otros fabricantes
  • Sin PCR

Producto de acceso anticipado Para tener más información sobre nuestros programas de acceso anticipado, consultar este artículo sobre las fases de lanzamiento del producto.

Para uso exclusivo en investigación

*Este documento es una traducción del protocolo inglés, versión L, publicado el 8 de diciembre de 2023.

Document version: RSE_9177_v114_revM_16Nov2022

1. Aspectos generales

IMPORTANTE

Este es un producto de acceso anticipado

Para tener más información sobre los programas de acceso anticipado, consulte este artículo sobre las fases de lanzamiento de productos.

Procure usar siempre la versión más reciente del protocolo.

Introducción al Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)

Este protocolo contiene instrucciones para completar paso a paso la secuenciación rápida de ADN genómico usando el kit Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114). Este kit usa la novísima química del kit 14, que está optimizada para preparar la biblioteca rápidamente, con un material de laboratorio mínimo.

Antes de empezar, se recomienda hacer un experimento de control con lambda para familiarizarse con la tecnología.

Pasos en el proceso de secuenciación:

Preparación del experimento

Pasos:

  • Extraer el ADN, evaluar su longitud, cantidad y pureza. Para ello, dispone del protocolo Input DNA/RNA QC.
    Los controles de calidad realizados durante el protocolo son fundamentales para garantizar el éxito del experimento.
  • Contar con el kit de secuenciación, el instrumental adecuado y los reactivos de otros fabricantes
  • Si no se ha instalado todavía, descargar el programa MinKNOW, necesario para obtener y analizar los datos
  • Comprobar la(s) celda(s) de flujo para asegurarse de que tiene(n) poros suficientes para realizar una buena secuenciación.

Preparación de la biblioteca

Pasos:

Pasos prep. biblioteca Proceso Duración Parada opcional
Tagmentación Tagmentar el ADN usando el reactivo Fragmentation Mix 5 minutos -
Ligación de los adaptadores Ligar los adaptadores de secuenciación a los extremos de ADN 5 minutos Se recomienda secuenciar la biblioteca tan pronto como se liguen los adaptadores
Cebado y carga de la celda de flujo Cebar la celda de flujo y cargar la biblioteca de ADN en ella 5 minutos -

RAD114 workflow SPANISH

Secuenciación y análisis

Pasos:

  • Empezar el proceso de secuenciación usando el programa MinKNOW, que obtendrá datos crudos del dispositivo y los convertirá en lecturas de bases identificadas.
  • Opcional: Iniciar el programa EPI2ME y seleccionar un proceso de trabajo para realizar análisis complementarios, p. ej., análisis metagenómicos o cartografía de farmacorresistencia
IMPORTANTE

Compatibilidad del protocolo

Este protocolo debería usarse solo en combinación con los siguientes productos:

2. Material y consumibles

Material
  • 100-150 ng de ADN genómico de alto peso molecular
  • Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
  • Microcentrífuga
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Temporizador
  • Termociclador o termobloque
Equipo opcional
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Para este protocolo, necesitará ~100 ng de ADN genómico de alto peso molecular.

Se pueden usar cantidades de muestra menores pero el resultado de la secuenciación será reducido.

Cantidad de muestra inicial de ADN

Cómo realizar un control de calidad de la muestra inicial de ADN

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

Reactivos de otros fabricantes

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000

Contenido del Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)

Nota: Hemos cambiando el formato de algunos de los viales de nuestros kits, de tubos monouso a botellas de mayor cantidad.

Formato en tubos monouso:

RAD114 tubes


Formato en botella:

RAD114 bottle

3. Preparación de la biblioteca

Material
  • 100-150 ng de ADN genómico de alto peso molecular
  • Rapid Adapter (RA)
  • Adapter Buffer (ADB)
  • Fragmentation Mix (FRA)
Consumibles
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
  • Termociclador o termobloque
  • Pipeta y puntas P2
  • Pipeta y puntas P10
CHECKPOINT

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos se verifique la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.

Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.

Descongelar los componentes del kit a temperatura ambiente, centrifugar brevemente y mezclar con la pipeta, como se indica en la tabla a continuación:

Reactivo 1. Descongelar a temperatura ambiente 2. Centrifugar brevemente 3. Mezclar con la pipeta
Fragmentation Mix (FRA) Descongelado ✓ ✓
Rapid Adapter (RA) Descongelado ✓ ✓
Adapter Buffer (ADB) Descongelado ✓ ✓

Una vez descongelado, colocar todos los viales del kit en hielo.

Preparar el ADN en agua sin nucleasas.

  • Transferir 100-150 ng de ADN genómico a un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Ajustar el volumen a un total de 10 µl con agua sin nucleasas
  • Mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo para evitar cizalladuras indeseadas
  • Centrifugar brevemente

En un tubo de PCR de pared fina (0,2 ml), mezclar lo siguiente:

Reactivo Volumen
100-150 ng de plantilla de ADN 10 μl
Fragmentation Mix (FRA) 1 μl
Total 11 μl

Mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo y centrifugar brevemente.

Incubar el tubo a 30 ⁰C durante 2 minutos y a continuación a 80 ⁰C durante 2 minutos. Colocar el tubo en hielo unos instantes para enfriarlo.

CHECKPOINT

Una vez tagmentado el ADN, proceder a la ligación del adaptador.

En un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, diluir el adaptador, Rapid Adapter (RA), como se indica a continuación y mezclar con la pipeta:

Reactivo Volumen
Rapid Adapter (RA) 1,5 μl
Adapter Buffer (ADB) 3,5 μl
Total 5 μl

Añadir 1 μl de Rapid Adapter (RA) diluido al ADN tagmentado.

Mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo y centrifugar brevemente.

Incubar la reacción durante 5 minutos a temperatura ambiente.

FIN DEL PROCESO

La biblioteca de ADN preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo hasta el momento de cargar.

4. Cebado y carga de la celda de flujo MinION/GridION

Material
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
  • Sequencing Buffer (SB)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE

Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).

CONSEJO

Cebado y carga de la celda de flujo

Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

IMPORTANTE

Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.

Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).

Para preparar la mezcla de cebado con seroalbúmina bovina, mezclar Flow Cell Flush (FCF) y Flow Cell Tether (FCT) como se indica a continuación. Mezclar con la pipeta a temperatura ambiente.

Nota: Hemos cambiando el formato de algunos de los viales de nuestros kits, de tubos monouso a botellas de mayor cantidad.

Formato en tubos monouso En el tubo de Flow Cell Flush (FCF), añadir directamente 5 µl de seroalbúmina bovina (BSA), a una concentración de 50 mg/ml y 30 µl de Flow Cell Tether (FCT).

Formato en botella: En un tubo proporcionado a la cantidad de celdas de flujo que se vayan a utilizar, mezclar los siguientes reactivos:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Flow Cell Flush (FCF) 1 170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) a una concentración de 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Volumen total 1 205 µl

Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:

  1. Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
  2. Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
  3. Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5 SPANISH

IMPORTANTE

Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.

En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.

Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).

En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Sequencing Buffer (SB) 37,5 µl
Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere 25,5 µl
Biblioteca de ADN 12 µl
Total 75 µl

Completar el cebado de la celda de flujo:

  1. Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
  2. Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

Flow Cell Loading Diagrams Step 5

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5 SPANISH 2

Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.

Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.

Flow Cell Loading Diagram Step 07 V5 SPANISH

Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.

Step 8 update - SPANISH

Flow Cell Loading Diagrams Step 9 SPANISH

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:

  1. Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.

  2. Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised. SPANISH

ATENCIÓN

La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.

FIN DEL PROCESO

Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.

5. Adquisición de datos e identificación de bases

Cómo empezar a secuenciar

Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.

Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:

  • En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o en remoto.
  • Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.

Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:

Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:

1. Ir a la página de inicio y pulsar "Iniciar secuenciación".

2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de muestra.

3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.

4. Configurar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o dejar la configuración por defecto en la pestaña Configuración del experimento.

Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, se puede activar en MinKNOW en la fase posejecución. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.

5. En la página de Inicio, pulsar Iniciar la secuenciación.

Análisis de datos

Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.

Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y de análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.

En la sección Análisis posterior, se describen otras opciones para analizar los datos.

6. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

7. Análisis posterior

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:

1. Flujos de trabajo de EPI2ME

A fin de realizar un análisis en profundidad de los datos, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales sobre bioinformática y flujos de trabajo, que están disponibles en EPI2ME. La plataforma proporciona un espacio donde los flujos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis para la investigación

Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y flujos de trabajo bioinformáticos, disponibles en EPI2ME Labs, que encontrará en la sección del mismo nombre de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los proyectos que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte el centro de recursos Resource Centre y busque herramientas bioinformáticas para su aplicación. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/programas informáticos.

8. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <70 % Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

9. Problemas durante el experimento al utilizar un kit de secuenciación de base rápida

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Ocupación de poro por debajo del 40 %

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación de poro <40 % No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo Procurar cargar la concentración correcta de una biblioteca de buena calidad en una celda de flujo MinION o GridION. Para comprobar la concentración requerida, consultar la sección Preparación de la biblioteca del protocolo. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular moles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, (opción "dsDNA: μg to pmol").
Ocupación de poro próxima a 0 Se utilizó el kit Rapid Sequencing Kit V14 o Rapid Barcoding Kit V14 y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN Seguir el protocolo paso a paso y utilizar los volúmenes y las temperaturas de incubación correctos. También se puede preparar una biblioteca de control con lambda para valorar la integridad de los reactivos.
Pore occupancy close to 0 No hay anclaje (tether) en la celda de flujo Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (vial FCT). No olvide añadir el anclaje (vial FCT) al tubo de enjuague de la celda de flujo (vial FCF) antes del cebado.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones:

1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Fluctuación de la temperatura

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ.

Last updated: 11/11/2024

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