Rapid Sequencing Kit V14 - gDNA (SQK-RAD114) (kit de secuenciación rápido)
Protocol
Rapid Sequencing Kit V14 - gDNA (SQK-RAD114) (kit de secuenciación rápido) VRSE_9177_v114_revM_16Nov2022
Este es el protocolo más sencillo y rápido para secuenciar ADN genómico; consiste en:
- ~10 mins de preparación de la biblioteca
- Fragmentación
- No es necesario usar ligasa de otros fabricantes
- Sin PCR
Producto de acceso anticipado Para tener más información sobre nuestros programas de acceso anticipado, consultar este artículo sobre las fases de lanzamiento del producto.
Para uso exclusivo en investigación
*Este documento es una traducción del protocolo inglés, versión L, publicado el 8 de diciembre de 2023.
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introducción al protocolo
Preparación de la biblioteca
Secuenciación y análisis de datos
- 5. Adquisición de datos e identificación de bases
- 6. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo
- 7. Análisis posterior
Resolución de problemas
Overview
Este es el protocolo más sencillo y rápido para secuenciar ADN genómico; consiste en:
- ~10 mins de preparación de la biblioteca
- Fragmentación
- No es necesario usar ligasa de otros fabricantes
- Sin PCR
Producto de acceso anticipado Para tener más información sobre nuestros programas de acceso anticipado, consultar este artículo sobre las fases de lanzamiento del producto.
Para uso exclusivo en investigación
*Este documento es una traducción del protocolo inglés, versión L, publicado el 8 de diciembre de 2023.
1. Aspectos generales
IMPORTANTE
Este es un producto de acceso anticipado
Para tener más información sobre los programas de acceso anticipado, consulte este artículo sobre las fases de lanzamiento del producto.
Procure usar la versión más reciente del protocolo.
Introducción al Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)
Este protocolo contiene instrucciones para completar paso a paso la secuenciación rápida de ADN genómico usando el kit Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114). Este kit usa la novísima química del kit 14, que está optimizada para preparar la biblioteca rápidamente, con un material de laboratorio mínimo.
Antes de empezar, se recomienda hacer un experimento de control con lambda para familiarizarse con la tecnología.
Pasos en el proceso de secuenciación:
Preparación del experimento
Pasos:
- Extraer el ADN, evaluar su longitud, cantidad y pureza. Para ello, dispone del protocolo Input DNA/RNA QC.
Los controles de calidad realizados durante el protocolo son fundamentales para garantizar el éxito del experimento. - Contar con el kit de secuenciación, el instrumental adecuado y los reactivos de otros fabricantes
- Si no se ha instalado todavía, descargar el programa MinKNOW, necesario para obtener y analizar los datos
- Comprobar la(s) celda(s) de flujo para asegurarse de que tiene(n) poros suficientes para realizar una buena secuenciación.
Preparación de la biblioteca
Pasos:
| Pasos prep. biblioteca | Proceso | Duración | Parada opcional |
|---|---|---|---|
| Tagmentación | Tagmentar el ADN usando el reactivo Fragmentation Mix | 5 minutos | - |
| Ligación de los adaptadores | Ligar los adaptadores de secuenciación a los extremos de ADN | 5 minutos | Se recomienda secuenciar la biblioteca tan pronto como se liguen los adaptadores |
| Cebado y carga de la celda de flujo | Cebar la celda de flujo y cargar la biblioteca de ADN en ella | 5 minutos | - |
Secuenciación y análisis
Pasos:
- Empezar el proceso de secuenciación usando el programa MinKNOW, que obtendrá datos crudos del dispositivo y los convertirá en lecturas de bases identificadas.
- Opcional: Iniciar el programa EPI2ME y seleccionar un proceso de trabajo para realizar análisis complementarios, p. ej., análisis metagenómicos o cartografía de farmacorresistencia
IMPORTANTE
Compatibilidad del protocolo
Este protocolo debería usarse solo en combinación con los siguientes productos:
- Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)
- Control Expansion (EXP-CTL001) (material complementario de control)
- R10.4.1 MinION flow cells (FLO-MIN114) (celdas de flujo MinION R10.4.1)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celdas de flujo)
- MinION Mk1C - Requisitos informáticos MinION Mk1C (inglés)
- MinION Mk1B - Requisitos informáticos MinION Mk1B (inglés)
- GridION - Requisitos informáticos GridION (inglés)
2. Material y consumibles
Material
- 100-150 ng de ADN genómico de alto peso molecular
- Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora para celdas de flujo MinION
- Microcentrífuga
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Temporizador
- Termociclador o termobloque
Equipo opcional
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Para este protocolo, necesitará ~100 ng de ADN genómico de alto peso molecular.
Se pueden usar cantidades de muestra menores pero el resultado de la secuenciación será reducido.
Cantidad de muestra inicial de ADN
Cómo realizar un control de calidad de la muestra inicial de ADN
Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.
Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC
Contaminantes químicos
Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Se recomienda preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en los primeros tres meses desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| Flongle | 50 |
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
Contenido del Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)
Nota: Hemos cambiando el formato de algunos de los viales de nuestros kits, de tubos monouso a botellas de mayor cantidad.
Formato en tubos monouso:
Formato en botella:
3. Preparación de la biblioteca
Material
- 100-150 ng de ADN genómico de alto peso molecular
- Rapid Adapter (RA)
- Adapter Buffer (ADB)
- Fragmentation Mix (FRA)
Consumibles
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
- Termociclador o termobloque
- Pipeta y puntas P2
- Pipeta y puntas P10
CHECKPOINT
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos se verifique la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.
Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.
Descongelar los componentes del kit a temperatura ambiente, centrifugar brevemente y mezclar con la pipeta, como se indica en la tabla a continuación:
| Reactivo | 1. Descongelar a temperatura ambiente | 2. Centrifugar brevemente | 3. Mezclar con la pipeta |
|---|---|---|---|
| Fragmentation Mix (FRA) | Descongelado | ✓ | ✓ |
| Rapid Adapter (RA) | Descongelado | ✓ | ✓ |
| Adapter Buffer (ADB) | Descongelado | ✓ | ✓ |
Una vez descongelado, colocar todos los viales del kit en hielo.
Preparar el ADN en agua sin nucleasas.
- Transferir 100-150 ng de ADN genómico a un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Ajustar el volumen a un total de 10 µl con agua sin nucleasas
- Mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo para evitar cizalladuras indeseadas
- Centrifugar brevemente
En un tubo de PCR de pared fina (0,2 ml), mezclar lo siguiente:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| 100-150 ng de plantilla de ADN | 10 μl |
| Fragmentation Mix (FRA) | 1 μl |
| Total | 11 μl |
Mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo y centrifugar brevemente.
Incubar el tubo a 30 ⁰C durante 2 minutos y a continuación a 80 ⁰C durante 2 minutos. Colocar el tubo en hielo unos instantes para enfriarlo.
CHECKPOINT
Una vez tagmentado el ADN, proceder a la ligación del adaptador.
En un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, diluir el adaptador, Rapid Adapter (RA), como se indica a continuación y mezclar con la pipeta:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| Rapid Adapter (RA) | 1,5 μl |
| Adapter Buffer (ADB) | 3,5 μl |
| Total | 5 μl |
Añadir 1 μl de Rapid Adapter (RA) diluido al ADN tagmentado.
Mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo y centrifugar brevemente.
Incubar la reacción durante 5 minutos a temperatura ambiente.
FIN DEL PROCESO
La biblioteca de ADN preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo hasta el momento de cargar.
4. Cebado y carga de la celda de flujo MinION/GridION
Material
- Flow Cell Flush (FCF) (enjuague de celda de flujo)
- Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
- Library Solution (LIS)
- Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
- Sequencing Buffer (SB) (tampón de secuenciación)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora para celdas de flujo MinION
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE
Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).
CONSEJO
Cebado y carga de la celda de flujo
Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
IMPORTANTE
Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.
Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).
Para preparar la mezcla de cebado con seroalbúmina bovina, mezclar Flow Cell Flush (FCF) y Flow Cell Tether (FCT) como se indica a continuación. Mezclar con la pipeta a temperatura ambiente.
Nota: Hemos cambiando el formato de algunos de los viales de nuestros kits, de tubos monouso a botellas de mayor cantidad.
Formato en tubos monouso En el tubo de Flow Cell Flush (FCF), añadir directamente 5 µl de seroalbúmina bovina (BSA), a una concentración de 50 mg/ml y 30 µl de Flow Cell Tether (FCT).
Formato en botella: En un tubo proporcionado a la cantidad de celdas de flujo que se vayan a utilizar, mezclar los siguientes reactivos:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Flow Cell Flush (FCF) | 1 170 µl |
| Bovine Serum Albumin (BSA) a una concentración de 50 mg/ml | 5 µl |
| Flow Cell Tether (FCT) | 30 µl |
| Volumen total | 1 205 µl |
Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.
MEDIDA OPCIONAL
Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.
Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.
Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.
Para abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizar la tapa en el sentido de las agujas del reloj.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Cargar 800 μl de mezcla de cebado en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.
IMPORTANTE
Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.
En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.
Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).
En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 37,5 µl |
| Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere | 25,5 µl |
| Biblioteca de ADN | 12 µl |
| Total | 75 µl |
Completar el cebado de la celda de flujo:
- Levantar suavemente la tapa del puerto de muestra SpotON.
- Cargar 200 µl de mezcla de cebado en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.
Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, instale la pantalla protectora justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos poner la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
FIN DEL PROCESO
Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.
5. Adquisición de datos e identificación de bases
Cómo empezar a secuenciar
Una vez cargada la celda de flujo, se puede iniciar el experimento en MinKNOW -el programa de secuenciación que gestiona el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.
MinKNOW se puede configurar y utilizar para secuenciar de diferentes maneras:
- En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o en remoto.
- Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.
Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:
Para empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:
1. Ir a la página de inicio y pulsar "Iniciar secuenciación". 
2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de muestra. 
3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación usado durante la preparación de la biblioteca. 
4. En las pestañas Run Options/Opciones de ejecución y Análisis, es posible configurar los parámetros de secuenciación adaptándolos al experimento o mantener la configuración predeterminada.
Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, se puede activar en MinKNOW en la fase posejecución. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.
5. En la pestaña Output/Datos de salida, es posible elegir entre configurar los parámetros de salida o mantener la configuración predeterminada. 
6. En la pestaña Review/Revisar, revisar las opciones seleccionadas y pulsar Start/Empezar. 
Análisis de datos tras la secuenciación
Una vez la secuenciación ha finalizado, la celda de flujo se puede reutilizar o devolver, como se indica en la sección Reutilización y devoluciones de celdas de flujo.
Tras la secuenciación y la identificación de bases, se puede proceder a analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y de análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.
En la sección Downstream analysis/Análisis posterior, le presentamos otras opciones para analizar los datos.
6. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
CONSEJO
Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.
Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.
IMPORTANTE
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
7. Análisis posterior
Análisis posterior a la identificación de bases
Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:
1. Plataforma EPI2ME
La plataforma EPI2ME es un servicio de análisis de datos, alojado en la red, desarrollado por Metrichor Ltd., filial de Oxford Nanopore Technologies. EPI2ME ofrece una serie de procesos de análisis, p. ej., de identificación metagenómica, identificación de especies a partir de un código (barcoding), alineación e identificación de variantes estructurales. El análisis no requiere equipo ni capacidad computacional extra y proporciona un informe fácil de interpretar con los resultados. Para obtener información sobre cómo realizar un proceso de análisis en EPI2ME, siga las instrucciones del protocolo, empezando por la sección "Starting data analysis".
2. EPI2ME Labs, tutoriales y procesos de trabajo
Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y procesos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, que encontrará en la sección del mismo nombre de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los proyectos que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
3. Herramientas de análisis para la investigación
El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.
4. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad
Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y segmentaciones para analizar datos de secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellos está disponible en GitHub. Nótese que Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.
8. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) | El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI. |
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas. |
Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Escasa recuperación | Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. | 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza. |
| Escasa recuperación | Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado | Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar.  |
| Escasa recuperación tras la preparación de extremos | El paso de lavado utilizó etanol a <70 % | Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto. |
9. Problemas durante el experimento al utilizar un kit de secuenciación de base rápida
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales. |
Ocupación de poro por debajo del 40 %
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Ocupación de poro <40 % | No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo | Procurar cargar la concentración correcta de una biblioteca de buena calidad en una celda de flujo MinION Mk1B o GridION. Para comprobar la concentración requerida, consultar la sección Preparación de la biblioteca del protocolo. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular moles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, (opción "dsDNA: μg to pmol"). |
| Ocupación de poro próxima a 0 | Se utilizó el kit Rapid Sequencing Kit V14 o Rapid Barcoding Kit V14 y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN | Seguir el protocolo paso a paso y utilizar los volúmenes y las temperaturas de incubación correctos. También se puede preparar una biblioteca de control con lambda para valorar la integridad de los reactivos. |
| Pore occupancy close to 0 | No hay anclaje (tether) en la celda de flujo | Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (vial FCT). No olvide añadir el anclaje (vial FCT) al tubo de enjuague de la celda de flujo (vial FCF) antes del cebado. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.  En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)  Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles. | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Fluctuación de la temperatura
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector están bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo de secuenciación para asegurarse de que se encuentra a temperatura ambiente y con buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ. |
Last updated: 3/20/2024
Document options
