Rapid sequencing DNA - 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Rapid sequencing DNA - 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24) V 16S_9199_v114_revE_11Dec2024

A protocol for amplifying the 16S rRNA gene from extracted gDNA.

  • Genus-level bacterial identification
  • Multiplex up to 24 different samples
  • Compatible with R10.4.1 flow cells only

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

概要

A protocol for amplifying the 16S rRNA gene from extracted gDNA.

  • Genus-level bacterial identification
  • Multiplex up to 24 different samples
  • Compatible with R10.4.1 flow cells only

For Research Use Only

Document version: 16S_9199_v114_revE_11Dec2024

1. Overview of the protocol

Introduction to the 16S Barcoding Kit 24 V14

This protocol describes how to carry out rapid barcoding of 16S amplicons using the 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24). Due to the presence of both highly conserved (adequate for universal primers and phylogenetic signal) and highly variant regions (different across species), the 16S rRNA gene is often used for sequence-based bacterial identification.

The 16S Barcoding Kit 24 V14 enables access to rapid 16S sequencing for organism identification. By narrowing down to a specific region of interest, you can see all the organisms in the sample without sequencing unnecessary regions of the genome, making the test quicker and more economical. There are 24 unique barcodes, allowing you to pool up to 24 different samples in one sequencing experiment.

After sequencing, you can perform downstream analysis using the EPI2ME 16S workflow (wf-16s) to classify 16S amplicons from your samples.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your gDNA, and check its length, quantity and purity using the Input DNA/RNA QC protocol. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and stopping points.

Library preparation step Process Time Stop option
16S barcoded PCR amplification Amplify the 16S gene using barcodes supplied in the kit 10 minutes + PCR 4°C overnight
Barcoded sample pooling and bead clean-up Quantify and pool the barcoded samples and perform a library clean-up using beads 15 minutes 4°C short-term storage or for repeated use, such as re-loading your flow cell.
-80°C for single-use long-term storage.
Adapter ligation Attach the rapid sequencing adapters to the to the DNA ends. 5 minutes We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared DNA library for sequencing 5 minutes

16S V14 barcoding workflow

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
  • Optional: Start the EPI2ME software and select the wf-16S workflow
重要

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

材料
  • 10 ng high molecular weight genomic DNA
  • 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24)
消耗品
  • MinionとGridIONのFlow Cell
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチューブ
装置
  • MinIONかGridION のデバイス
  • MinIONとGridIONのFlow Cell ライトシールド
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • 小型遠心機
  • ボルテックスミキサー
  • 1.5 mlエッペンドルフチューブに最適のマグネット式ラック
  • Thermal cycler
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットとチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 ピペットとチップ
  • Multichannel pipette and tips
  • アイスバケツ（氷入り）
  • タイマー
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）

For this protocol, you will need 10 ng high molecular weight genomic DNA per barcode.

For optimal output, we currently do not recommend using fewer than 4 barcodes. If you wish to multiplex less than 4 samples, please ensure you split your sample(s) across multiple barcodes so at least 4 barcodes are run (e.g. for 2 samples, use 16S Barcode Primers 01-02 for sample A, and 16S Barcode Primers 03-04 for sample B). Please note that the required sample input for each barcode is 10 ng gDNA.

サードパーティー試薬

このプロトコールで使用されているすべてのサードパーティー試薬は、当社が検証し、使用を推奨しているものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以外の試薬を用いたテストは行っていません。

すべてのサードパーティ製試薬については、製造元の指示に従って使用の準備をすることをお勧めします。

フローセルのチェックをしてください

シークエンシング実験を開始する前に、フローセルのポアの数を確認することを強くお勧めします。このフローセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの場合は代理店への到着から１２週間以内に行ってください。またはFlongle Flow Cellの場合は代理店への到着から4週間以内に行う必要があります。Oxford Nanopore Technologiesは、フローセルチェックの実施から2日以内に結果が報告され、推奨される保管方法に従っていた場合に、以下の表に記載されているナノポアの有効数に満たさない場合には、フローセルを交換します。 フローセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指示に従ってください。

Flow cell 保証する最小有効ポア数（以下の数未満のフローセルが交換対象となります）
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000

16S Barcoding Kit 24 V14 contents

SQK-16S114.24 Kit content

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (μl)
16S Barcode Primers 01-24 1-24 - 2 plates, 3 sets of barcodes per plate 15 μl per well
Rapid Adapter RA Green 1 15
Adapter Buffer ADB Clear 1 100
AMPure XP Beads AXP Clear cap, light teal label 1 6,000
Elution buffer EB Black 1 1,500
EDTA EDTA Blue 1 700
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200

Note: This product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

3. Library preparation

材料
  • 10 ng high molecular weight genomic DNA
  • 16S Barcodes in 96-well plate, at 1 μM each
  • EDTA (EDTA)
  • AMPure XP Beads (AXP)
  • Elution Buffer (EB)
  • Rapid Adapter (RA)
  • Adapter Buffer (ADB)
消耗品
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチューブ
装置
  • Thermal cycler
  • 小型遠心機
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • Magnetic rack
  • アイスバケツ（氷入り）
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）
  • P1000 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • P100 pipette and tips
  • P20 pipette and tips
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 ピペットとチップ
  • Multichannel pipette and tips

Minimum 16S Barcode Primers use requirements

For optimal output, we currently do not recommend using fewer than 4 barcodes. If you wish to multiplex less than 4 samples, please ensure you split your sample(s) across barcodes so a minimum of 4 barcodes are run:

  • For 1 sample, run your sample across 4 barcodes (e.g. 16S Barcode Primers 01-04 using 10 ng of sample A per barcode)
  • For 2 samples, run each sample across two barcodes. (e.g. 16S Barcode Primers 01-02 for sample A, and 16S Barcode Primers 03-04 for sample B)
  • For 3 samples, run two samples individually and one across 2 barcodes. (e.g. 16S Barcode Primer 01 and 16S Barcode Primer 02 for sample A and B respectively, and 16S Barcode Primers 03-04 for sample C)

Please note that the required sample input for each barcode is 10 ng gDNA.

CHECKPOINT

フローセルのチェックを行ってください。

ライブラリー調製を開始する前にフローセルチェックを行い、良好なシークエンスランに十分なポアを持つフローセルを使用することをお勧めします。

詳細については、MinKNOWプロトコルのflow cell check instructions を参照してください。

Take one 96-well plate containing 16S barcodes. Break one set of barcodes (1-24, or as desired) away from the plate and return the rest to storage.

16S barcode plate layout:

16S barcode plate layout

重要

The 96-well plates are designed to break in one direction only. Strips, or multiple strips, of eight wells/barcodes can be removed from the plate at any one time.

Thaw the desired barcodes at room temperature.

Briefly centrifuge barcodes in a microfuge to make sure the liquid is at the bottom of the tubes and place on ice.

Thaw the LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix, spin down briefly, mix well by pipetting and place on ice.

Prepare the DNA in nuclease-free water.

  • Transfer 10 ng of each genomic DNA sample into a 0.2 ml thin-walled PCR tube
  • Adjust the volume to 15 μl with nuclease-free water
  • Mix thoroughly by flicking avoiding unwanted shearing
  • Spin down briefly in a microfuge

In each 0.2 ml thin-walled PCR tube containing a sample to be tested, prepare the following mixture:

Reagent Volume
10 ng input DNA (from previous step) 15 μl
LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix 25 μl
Total 40 μl

Note: If the amount of input material is altered, the number of PCR cycles may need to be adjusted to produce the same yield.

Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting and spin down briefly.

Using clean pipette tips, carefully pierce the foil surface of the required barcodes. Use a new tip for each barcode to avoid cross-contamination. Make a note of which barcode numbers will be run for each sample.

Using a multichannel pipette, mix the 16S barcodes by pipetting up and down 10 times. Transfer 10 μl of each 16S Barcode into respective sample-containing tubes.

Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting the contents of the tubes 10 times and spin down.

Note: Mix gently to minimise introducing air bubbles to the reactions.

Amplify using the following cycling conditions:

Cycle step Temperature Time No. of cycles
Initial denaturation 95 °C 1 min 1
Denaturation 95 °C 20 secs 25
Annealing 55 °C 30 secs 25
Extension 65 °C 2 mins 25
Final extension 65 °C 5 mins 1
Hold 4 °C ∞

Thaw reagents at room temperature, spin down briefly using a microfuge and mix by pipetting as indicated by the table below:

Reagent 1. Thaw at room temperature 2. Briefly spin down 3. Mix well by pipetting or vortexing
Rapid Adapter (RA) Not frozen ✓ Pipette
Adapter Buffer (ADB) ✓ ✓ Vortex or Pipette
AMPure XP Beads (AXP) ✓ ✓ Mix by vortexing immediately before use
Elution Buffer (EB) ✓ ✓ Vortex or Pipette
EDTA (EDTA) ✓ ✓ Vortex or Pipette

Note: Once thawed, keep all reagents on ice.

Add 4 µl of EDTA to each barcoded sample, mix thorougly by pipetting and spin down briefly.

ヒント

EDTA is added at this step to stop the reaction.

Incubate for 5 minutes at room temperature.

Quantify 1 µl of each barcoded sample using a Qubit fluorometer (or equivalent) for QC check.

Pool all barcoded samples in equimolar ratios in a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Note: Please ensure you have quantified your samples prior to this step and take forward an equimolar concentration of each of the samples for optimal barcode balancing. Samples may vary in concentration following the barcoded PCR, therefore the volume of each barcoded sample added to the pool will be different.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

To the pool of barcoded samples, add a 0.6X volume ratio of resuspended AMPure XP Beads (AXP) and mix by pipetting:

Volume of barcoded sample pool 37.5 μl 75 μl 150 μl 300 μl 600 μl
Volume of AMPure XP Beads (AXP) 22.5 μl 45 μl 90 μl 180 μl 360 μl

Note: Table contains example volumes for reference. Please adjust the volume of AMPure XP Beads (AXP) added for the volume of your barcoded sample pool to ensure a 0.6X volume ratio.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 5 minutes at room temperature.

Prepare 2 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

Briefly spin down the sample and pellet on a magnetic rack until supernatant is clear and colourless. Keep the tube on the magnetic rack, and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 1 ml of freshly-prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

前のステップを繰り返します。

スピンダウンし、チューブをマグネットの上に戻します。残ったエタノールをピペットで取り除きます。ペレットを30 秒間程乾かします。 ただし、 ペレットにひびが入るまでは乾燥させないでください。

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet by pipetting in 15 µl Elution Buffer (EB). Spin down and incubate for 5 minutes at room temperature.

溶出液が無色透明になるまで、少なくとも1分間マグネット上でビーズをペレット化します。

Remove and retain 15 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

  • Remove and retain the eluate which contains the DNA library in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
  • Dispose of the pelleted beads
CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

Transfer 50 fmol of your eluted sample into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Make up the volume to 11 µl with Elution Buffer (EB).

In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, dilute the Rapid Adapter (RA) as follows and pipette mix:

Reagent Volume
Rapid Adapter (RA) 1.5 μl
Adapter Buffer (ADB) 3.5 μl
Total 5 μl

Add 1 µl of the diluted Rapid Adapter (RA) to the barcoded DNA.

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Incubate the reaction for 5 minutes at room temperature.

最終ステップ

The prepared library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice until ready to load.

4. Priming and loading the MinION and GridION Flow Cell

材料
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB)
  • Sequencing Buffer (SB)
消耗品
  • MinionとGridIONのFlow Cell
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装置
  • MinIONかGridION のデバイス
  • MinIONとGridIONのFlow Cell ライトシールド
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
重要

注意：本キットはR10.4.1フローセル（FLO-MIN114）のみに対応しています。

ヒント

フローセルのプライミングとローディング

新規ユーザーは、 初回使用前に'Priming and loading your flow cell' のビデオをご覧いただくことをお勧めします。

Using the Library Solution

For most sequencing experiments, use the Library Beads (LIB) for loading your library onto the flow cell. However, for viscous libraries it may be difficult to load with the beads and may be appropriate to load using the Library Solution (LIS).

Sequencing Buffer（SB）、Library Beads（LIB）またはLibrary Solution（LISを使用する場合のみ）、Flow Cell Tether（FCT）およびFlow Cell Flush（FCF）を室温で融解してから、ボルテックスで混合します。その後、スピンダウンして氷上で保存します。

重要

MinION R10.4.1フローセル（FLO-MIN114）での最適なシークエンス性能と出力向上のために、フローセルのプライミングミックスに最終濃度0.2 mg/mlでBovine Serum Albumin (BSA) を添加することを推奨します。

(注： その他のアルブミンの種類（組換えヒト血清アルブミンなど）の使用は推奨しません。

To prepare the flow cell priming mix with BSA, combine the following reagents in a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Mix by inverting the tube and pipette mix at room temperature:

Reagents Volume per flow cell
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Final total volume in tube 1,205 µl

MinIONまたはGridIONデバイスの蓋を開け、フローセルをクリップの下にスライドさせます。 フローセルをしっかりと押さえ、サーマルプレートと電気接触が密着しているかを確認してください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b_JP

オプショナルステップ

ライブラリーをロードする前にフローセルチェックを行い、使用可能なポアの数を把握して下さい。

フローセルが以前にチェックされている場合は、このステップを省略できます。

詳細については、MinKNOWプロトコルのフローセルチェックの手順 flow cell check instructionsを参照してください。

フローセルのプライミングポートカバーを時計方向にスライドさせ、プライミングポートを開きます。

Flow Cell Loading Diagrams Step 2_JP

重要

フローセルからバッファーを引き上げる際には注意してください。20～30μl以上は除去せず、ポアのアレイ全体が常にバッファーで覆われていることを確認して下さい。アレイに気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。

プライミングポートを開けた後に、カバーの下に小さな気泡がないかを確認して下さい。気泡を取り除くために少量の液を引き上げます。

  1. P1000ピペットを200 µ Lに設定して下さい。
  2. ピペットの先端をプライミングポートに差し込みます。
  3. 目盛りが220-230 ulと表示されるまでダイヤルを回して、20-30 ulを吸い上げるか、少量のバッファーがピペットの先端に入るのが見えるまでダイヤルを回します。

(注： プライミングポートからセンサーアレイ全体にバッファーがあることを確認してください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5_JP

気泡が混入しないように、プライミングポートからフローセルにプライミングミックスを800µl注入し、 5分間待ちます。この５分間の間に、以下の手順でライブラリーをロードする準備をして下さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5_JP

Library Beads(LIB)の液をピペッティングすることで十分に混合して下さい。

重要

Library Beads（LIB）チューブにはビーズの懸濁液が入っています。これらのビーズはすぐに沈殿するので、使用直前に混合することが重要です。

ほとんどのシーケンス実験にはLibrary Beads （LIB）の使用を推奨します。しかし、より粘性の高いライブラリーにはLibrary Solution（LIS）を使ってください。

新しい1.5mlのEppendorf DNA LoBindチューブにてライブラリーをロードする準備をします。（詳細は以下に記載されています。）

試薬 １フローセルあたりの容量
Sequencing Buffer (SB) 37.5 µl
Library Beads （LIB）またはLibrary Solution（LIS）（使用する場合）は、使用直前に混合して下さい。 25.5 µl
DNA library 12 µl
合計 75 µl

フローセルのプライミングを完了させます。

  1. SpotON サンプルポートカバーをゆっくりと持ち上げ、SpotON サンプルポートにアクセスできるようにします。
  2. 200μlのプライミングミックスをフローセルのプライミングポート（SpotONサンプルポートではありません）に気泡が入らないように注入します。

Flow Cell Loading Diagrams Step 5_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5_JP

調製したライブラリーは、ロードする直前にピペッティング混合して下さい。

調製したライブラリー75μlをSpotONサンプルポートからフローセルに滴下します。次の一滴を追加する前に各一滴がポートに入っていることを確認して下さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 07 V5_JP

SpotONサンプルポートカバーをゆっくりと元に戻し、バング（カバーの先）がSpotONポートに入ることを確認し、プライミングポートを閉じます。

Step 8 update_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 9_JP

重要

最適なシークエンス出力を得るために、ライブラリーがロードされたすぐにライトシールドをフローセルに取り付けてください。

ライブラリーがフローセル上にある状態では（ウォッシングやリロードのステップを含める）、フローセルにライトシールドを付けたままにしておくことを推奨します。ライトシールドは、ライブラリーがフローセルから除去された時点で取り外すことができます。

ライトシールドを以下のようにフローセルに設置して下さい。

  1. ライトシールドの先端を慎重にクリップに当てます。 (注： ライトシールドをクリップの下に無理に押し込まないでください。

  2. ライトシールドをフローセルにゆっくりと下ろします。ライトシールドは、フローセルの上部全体を覆うようにSpotONカバーの周囲に取り付けます。

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised-Japanese step10

注意

MinIONフローセルライトシールドは、フローセルに固定されていないため、取り付け後の取り扱いには注意が必要です。

最終ステップ

デバイスの蓋を閉め、MinKNOWでシークエンスランをセットします。

5. Data acquisition and basecalling

シークエンスの開始方法

フローセルをロードしたら、MinKNOWでシークエンシングランを開始できます。MinKNOWは、装置、データ収集、リアルタイムベースコールを制御するシークエンスソフトウェアです。 MinKNOWの設定と使用の詳細については、MinKNOW Protocolを参照してください。

MinKNOWは、複数の方法でシークエンスの設定をすることができます。

  • シークエンシングデバイスに直接かリモートで接続されているコンピューター。
  • GridION、Minion Mk1C、またはPromethion 24/48シークエンシングデバイスで直接使用できます。

シークエンス装置でMinKNOWを使用する方法の詳細については、装置のユーザーマニュアルを参照してください。

MinKNOWでシークエンスランを開始するには、次の手順に従います。

1. スタートページに移動し、 Start sequencing をクリックします。

2. 名前、フローセルの位置、サンプルIDなどの実験の詳細を入力します。

3. キットのページで、ライブラリー調製に使用するシークエンシングキットを選択します。

4. シークエンスランのパラメータの変更を設定（ランオプションの変更など）するか、デフォルト設定のままにします。

(注： シークエンスランの設定時にベースコールがオフになっていた場合には、MinKNOWでポストラン・ベースコールを後日に実行することも出来ます。詳細については、MinKNOW protocolを参照してください。

5. Start をクリックしてシークエンスランを開始します。

シークエンシング後のデータ解析

MinKNOWでシークエンスが終わると、フローセルを再利用または返却ができます。詳しくは、フローセルの再利用と返却のセクションをご覧ください。

シークエンシングとベースコールの後にはデータを解析することができます。 ベースコールおよびベースコール後の解析オプションの詳細については、Data Analysis を参照してください。

ダウンストリーム解析セクションでは、データを解析するためのオプションの概要を説明しています。

6. Flow cell reuse and returns

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

シークエンス実験終了後、フローセルを再利用する場合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコールに従い、洗浄したフローセルを2～8℃で保管してください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティーで入手できます。

または、返送手順に従って、オックスフォード・ナノポアに返送してください。

フローセルの返却方法は hereをご覧ください。

(注： 製品を返却する前に、すべてのフローセルを脱イオン水で洗浄する必要があります。

重要

シークエンシング実験に関して問題が発生した場合や質問がある場合には、このプロトコルのオンライン版にあるトラブルシューティングガイドを参照してください。

7. Downstream analysis

Post-basecalling analysis

We recommend performing downstream analysis using EPI2ME which facilitates bioinformatic analyses by allowing users to run Nextflow workflows in a desktop application. EPI2ME maintains a collection of bioinformatic workflows which are curated and actively maintained by experts in long-read sequence analysis.

Further information about the available EPI2ME workflows are available here, along with the Quick Start Guide to start your first bioinformatic workflow.

The 16S workflow (wf-16s) is a Nextflow workflow leveraging the power of wf-metagenomics for identification of the origin of reads from targeted amplicon sequencing. The workflow has two modes of operation, it can use either kraken2 or minimap2 to determine the origin of reads.

More information on the EPI2ME 16S workflow (wf-16s) can be found here.

For installation instructions please click here.

Additional options for further analysing your basecalled data include:

1. Research analysis tools

Oxford Nanopore Technologies' Research division has created a number of analysis tools, that are available in the Oxford Nanopore GitHub repository. The tools are aimed at advanced users, and contain instructions for how to install and run the software. They are provided as-is, with minimal support.

2. Community-developed analysis tools

If a data analysis method for your research question is not provided in any of the resources above, please refer to the Bioinformatics section of the Resource centre. Numerous members of the Nanopore Community have developed their own tools and pipelines for analysing nanopore sequencing data, most of which are available on GitHub. Please be aware that these tools are not supported by Oxford Nanopore Technologies, and are not guaranteed to be compatible with the latest chemistry/software configuration.

8. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

サンプルの品質が低い

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
DNAの純度が低い（DNAのOD 260/280のナノドロップ測定値が1.8未満およびOD 260/230が2.0～2.2未満） DNA抽出で必要な純度が得られていない 夾雑物の影響は、 Contaminants に示されています。コンタミネーションをもたらさないために別の抽出方法extraction method をお試しください。.

追加のSPRIクリーンアップステップの実施を検討して下さい。
低いRNA インテグリティー（RNA Integrity Number: <9.5 RIN、またはrRNAバンドがゲル上でスメアになっている） 抽出中にRNAが分解された 別のRNA抽出方法 RNA extraction methodを試してください。RINの詳細については、 RNA Integrity Number の資料を参照してください。詳細については、 DNA/RNA Handling のページをご覧ください。
RNAのフラグメントが予想より短い 抽出中にRNAが分解された 別のRNA抽出方法 RNA extraction methodを試してください。 RINの詳細については、 RNA Integrity Number の資料を参照してください。詳細については、DNA/RNA Handling のページをご覧ください。

RNAを扱う際には、RNaseフリーの環境で作業し、実験器具もRNaseフリーにしておくことをお勧めします。

Low DNA recovery after AMPure bead clean-up

Observation Possible cause Comments and actions
Low recovery DNA loss due to a lower than intended AMPure beads-to-sample ratio 1. AMPure beads settle quickly, so ensure they are well resuspended before adding them to the sample.

2. When the AMPure beads-to-sample ratio is lower than 0.4:1, DNA fragments of any size will be lost during the clean-up.
Low recovery DNA fragments are shorter than expected The lower the AMPure beads-to-sample ratio, the more stringent the selection against short fragments. Please always determine the input DNA length on an agarose gel (or other gel electrophoresis methods) and then calculate the appropriate amount of AMPure beads to use. SPRI cleanup
Low recovery after end-prep The wash step used ethanol <80% DNA will be eluted from the beads when using ethanol <80%. Make sure to use the correct percentage.

9. Issues during the sequencing run using a Rapid-based sequencing kit

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

シークエンス開始時のポアがフローセルチェック後よりも少ない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ナノポアアレイに気泡が入ってしまった。 フローセルチェックをした後、フローセルをプライミングする前に、プライミングポート付近の気泡を取り除くことが必要です。 気泡を取り除かないと、気泡がナノポアアレイに移動し、空気に触れたたナノポアが不可逆的なダメージを負った可能性がある。これを防ぐための最適な方法が、 this videoで紹介されています。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 フローセルがデバイスに正しく挿入されていない。 シークエンスランを停止し、フローセルをシークエンス装置から取り出します。次に再度フローセルを挿入し、装置にしっかりと固定され、目標温度に達していることを確認します。GridIONやPromethIONの場合は別のフローセルの位置をお試しください。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ライブラリー内の汚染物質がポアを失活させたり塞いだりしている。 フローセルチェックの際のポア数は、フローセル保存バッファー中のQC用のDNA分子を用いて計測されます。シークエンシングの開始時は、ライブラリ自体を使用してアクティブなポア数を推定します。このため、フローセルチェックとRun開始時のポア数は、約10％程度の変動が起こります。シークエンシング開始時に報告されたポアの数が大幅に減少している場合は、ライブラリー中の汚染物質がメンブレンを損傷していたり、ポアをブロックしている可能性があります。インプット材料の純度を向上させるために、別のDNA/RNA抽出または精製方法が必要となる場合があります。コンタミネーションの影響は、Contaminants Know-how pieceを参照にして下さい。夾雑物を除去するために別の抽出方法extraction method をお試しください。

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
MinKNOW に 「Script failed」と表示されている"
コンピューターを再起動し、MinKNOWを再起動します。問題が解決しない場合は MinKNOW log files MinKNOWログファイルを収集し 、テクニカルサポートにご連絡ください。他のシークエンシングデバイスをお持ちでない場合は、 フローセルとロードしたライブラリーを4℃で保管することをお勧めします。詳細な保管方法については、テクニカルサポートにお問い合わせください。

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell 10–50 fmol of good quality library can be loaded on to a MinION Mk1B/GridION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Rapid PCR Barcoding Kit V14 was used, and sequencing adapters did not attach to the DNA Make sure to closely follow the protocol and use the correct volumes and incubation temperatures. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of reagents.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are added during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming.

予想より短いリード長

問題点 予想される原因 解決策とコメント
予想より短いリード長 DNAサンプルの不要な断片化 読み取り長はサンプルDNA断片の長さを反映します。サンプルDNAは、抽出およびライブラリー調製中の操作で断片化した可能性があります。

1. 抽出の最適な方法については、Extraction Methods の抽出方法を参照してください。

2. ライブラリー調製に進む前に、アガロースゲル電気泳動で、サンプルDNAのフラグメント長の分布を確認してください。 DNA gel2 上の画像では、サンプル1は高分子量ですが、サンプル2は断片化されています。

3. ライブラリー調製中は、試薬を混合するためのピペッティングやボルテックス操作は、プロトコルで指示がないかぎり行わないでください。

利用できないポアの割合が多い場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
利用できないポアの割合が大きい（チャンネルパネルとポアのアクティブポートで青く表示されています）

image2022-3-25 10-43-25 上のアクティブなポアの図は、時間の経過とともに「利用できない」ポアの割合が増加していることを示しています。		 サンプル内に不純物が含まれている 一部のポアに吸着する不純物は、MinKNOWに組み込まれたポアのブロック解除機能によって、ポアから除去することができます。 このステップが完了すると、ポアの状態が「sequencing pore」に戻ります。利用できないポアの部分が多いか、増加した場合:

1.Flow Cell Wash Kit nuclease flush using the Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) を用いて、ヌクレアーゼ洗浄を 行うことができます。又は
2. PCRを数サイクル実行してサンプルDNAの量を増やし、サンプルDNAに含まれる問題の不純物が相対的に減る（希釈される）ようにします。

Inactiveのポアの割合が高い

問題点 予想される原因 解決策とコメント
利用できない(inactive/unavailable)ポアの割合が高い（チャネルパネルとポアアクティブポートでは水色で表示されています）ポアまたは膜に損傷が起きてしまった。 気泡がフローセルに混入した。 フローセルのプライミングやライブラリーのロードで気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。 推奨の操作方法については、Priming and loading your flow cell のビデオをご覧ください。
利用できないポアの割合が多い場合 サンプルDNAに含まれる不純物 既知の化合物問題で、サンプルDNAに多糖類が含まれた事で、植物のゲノムDNAと結合しポアをブロックした。

1. 植物葉DNA抽出法 Plant leaf DNA extraction methodをご参照ください。
2. QIAGEN PowerClean Pro キットを使用してクリーンアップして下さい。
3. QIAGEN REPLI-g kit.キットを使用して、元のgDNAサンプルで全ゲノム増幅を実行します。
利用できないポアの割合が多い場合 サンプル内に不純物が含まれている 不純物の影響は、 Contaminants の ノウハウを参照して下さい。 サンプルDNAに不純物を残留させないために別の抽出方法をお試しください。

温度変動

問題点 予想される原因 解決策とコメント
温度変動 フローセルとデバイスの接続が途切れている。 フローセルの背面にある金属プレートを覆っているヒートパッドがあることを確認してください。 フローセルを再度挿入し、コネクターピンがデバイスにしっかりと接触していることを確認するために軽く押してください。問題が解決しない場合は、テクニカルサービスにご連絡してください。

目標温度に到達しない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目標温度に達しなかった)と表示する。" 装置が通常の室温より低い場所、または風通しの悪い場所（排気が出来ない場所）に置かれた時にフローセルが過熱してします。 MinKNOWでは、フローセルが目標温度に到達するまでの既定の時間枠があります。時間枠を超えると、エラーメッセージが表示され、シークエンシング実験が続行されます。しかし、不適切な温度でシークエンスを行うと、スループットが低下し、qスコアが低下する可能性があります。シークエンシングデバイスが風通しの良い室温に置かれていることを確認して、MinKNOW再スタートしてください。MinION Mk 1Bの温度制御の詳細については、FAQ を参照してください。

Last updated: 1/14/2025

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