Rapid sequencing DNA - 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Rapid sequencing DNA - 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24) V 16S_9199_v114_revE_11Dec2024

A protocol for amplifying the 16S rRNA gene from extracted gDNA.

  • Genus-level bacterial identification
  • Multiplex up to 24 different samples
  • Compatible with R10.4.1 flow cells only

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

抂芁

A protocol for amplifying the 16S rRNA gene from extracted gDNA.

  • Genus-level bacterial identification
  • Multiplex up to 24 different samples
  • Compatible with R10.4.1 flow cells only

For Research Use Only

Document version: 16S_9199_v114_revE_11Dec2024

1. Overview of the protocol

Introduction to the 16S Barcoding Kit 24 V14

This protocol describes how to carry out rapid barcoding of 16S amplicons using the 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24). Due to the presence of both highly conserved (adequate for universal primers and phylogenetic signal) and highly variant regions (different across species), the 16S rRNA gene is often used for sequence-based bacterial identification.

The 16S Barcoding Kit 24 V14 enables access to rapid 16S sequencing for organism identification. By narrowing down to a specific region of interest, you can see all the organisms in the sample without sequencing unnecessary regions of the genome, making the test quicker and more economical. There are 24 unique barcodes, allowing you to pool up to 24 different samples in one sequencing experiment.

After sequencing, you can perform downstream analysis using the EPI2ME 16S workflow (wf-16s) to classify 16S amplicons from your samples.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your gDNA, and check its length, quantity and purity using the Input DNA/RNA QC protocol. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and stopping points.

Library preparation step Process Time Stop option
16S barcoded PCR amplification Amplify the 16S gene using barcodes supplied in the kit 10 minutes + PCR 4°C overnight
Barcoded sample pooling and bead clean-up Quantify and pool the barcoded samples and perform a library clean-up using beads 15 minutes 4°C short-term storage or for repeated use, such as re-loading your flow cell.
-80°C for single-use long-term storage.
Adapter ligation Attach the rapid sequencing adapters to the to the DNA ends. 5 minutes We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared DNA library for sequencing 5 minutes

16S V14 barcoding workflow

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
  • Optional: Start the EPI2ME software and select the wf-16S workflow
重芁

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

材料
  • 10 ng high molecular weight genomic DNA
  • 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24)
消耗品
  • MinionずGridIONのFlow Cell
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • ヌクレアヌれフリヌ氎で甚事調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチュヌブ
装眮
  • MinIONかGridION のデバむス
  • MinIONずGridIONのFlow Cell ラむトシヌルド
  • Hula mixer緩やかに回転するミキサヌ
  • 小型遠心機
  • ボルテックスミキサヌ
  • 1.5 ml゚ッペンドルフチュヌブに最適のマグネット匏ラック
  • Thermal cycler
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットずチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
  • P2 ピペットずチップ
  • Multichannel pipette and tips
  • アむスバケツ氷入り
  • タむマヌ
  • Qubit蛍光光床蚈たたはQCチェックのための同等品

For this protocol, you will need 10 ng high molecular weight genomic DNA per barcode.

For optimal output, we currently do not recommend using fewer than 4 barcodes. If you wish to multiplex less than 4 samples, please ensure you split your sample(s) across multiple barcodes so at least 4 barcodes are run (e.g. for 2 samples, use 16S Barcode Primers 01-02 for sample A, and 16S Barcode Primers 03-04 for sample B). Please note that the required sample input for each barcode is 10 ng gDNA.

サヌドパヌティヌ詊薬

このプロトコヌルで䜿甚されおいるすべおのサヌドパヌティヌ詊薬は、圓瀟が怜蚌し、䜿甚を掚奚しおいるものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以倖の詊薬を甚いたテストは行っおいたせん。

すべおのサヌドパヌティ補詊薬に぀いおは、補造元の指瀺に埓っお䜿甚の準備をするこずをお勧めしたす。

フロヌセルのチェックをしおください

シヌク゚ンシング実隓を開始する前に、フロヌセルのポアの数を確認するこずを匷くお勧めしたす。このフロヌセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの堎合は代理店ぞの到着から週間以内に行っおください。たたはFlongle Flow Cellの堎合は代理店ぞの到着から4週間以内に行う必芁がありたす。Oxford Nanopore Technologiesは、フロヌセルチェックの実斜から2日以内に結果が報告され、掚奚される保管方法に埓っおいた堎合に、以䞋の衚に蚘茉されおいるナノポアの有効数に満たさない堎合には、フロヌセルを亀換したす。 フロヌセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指瀺に埓っおください。

Flow cell 保蚌する最小有効ポア数以䞋の数未満のフロヌセルが亀換察象ずなりたす
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000

16S Barcoding Kit 24 V14 contents

SQK-16S114.24 Kit content

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (ÎŒl)
16S Barcode Primers 01-24 1-24 - 2 plates, 3 sets of barcodes per plate 15 ÎŒl per well
Rapid Adapter RA Green 1 15
Adapter Buffer ADB Clear 1 100
AMPure XP Beads AXP Clear cap, light teal label 1 6,000
Elution buffer EB Black 1 1,500
EDTA EDTA Blue 1 700
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200

Note: This product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

3. Library preparation

材料
  • 10 ng high molecular weight genomic DNA
  • 16S Barcodes in 96-well plate, at 1 ÎŒM each
  • EDTA (EDTA)
  • AMPure XP Beads (AXP)
  • Elution Buffer (EB)
  • Rapid Adapter (RA)
  • Adapter Buffer (ADB)
消耗品
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • ヌクレアヌれフリヌ氎で甚事調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチュヌブ
装眮
  • Thermal cycler
  • 小型遠心機
  • Hula mixer緩やかに回転するミキサヌ
  • Magnetic rack
  • アむスバケツ氷入り
  • Qubit蛍光光床蚈たたはQCチェックのための同等品
  • P1000 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • P100 pipette and tips
  • P20 pipette and tips
  • P10 ピペットずチップ
  • P2 ピペットずチップ
  • Multichannel pipette and tips

Minimum 16S Barcode Primers use requirements

For optimal output, we currently do not recommend using fewer than 4 barcodes. If you wish to multiplex less than 4 samples, please ensure you split your sample(s) across barcodes so a minimum of 4 barcodes are run:

  • For 1 sample, run your sample across 4 barcodes (e.g. 16S Barcode Primers 01-04 using 10 ng of sample A per barcode)
  • For 2 samples, run each sample across two barcodes. (e.g. 16S Barcode Primers 01-02 for sample A, and 16S Barcode Primers 03-04 for sample B)
  • For 3 samples, run two samples individually and one across 2 barcodes. (e.g. 16S Barcode Primer 01 and 16S Barcode Primer 02 for sample A and B respectively, and 16S Barcode Primers 03-04 for sample C)

Please note that the required sample input for each barcode is 10 ng gDNA.

CHECKPOINT

フロヌセルのチェックを行っおください。

ラむブラリヌ調補を開始する前にフロヌセルチェックを行い、良奜なシヌク゚ンスランに十分なポアを持぀フロヌセルを䜿甚するこずをお勧めしたす。

詳现に぀いおは、MinKNOWプロトコルのflow cell check instructions を参照しおください。

Take one 96-well plate containing 16S barcodes. Break one set of barcodes (1-24, or as desired) away from the plate and return the rest to storage.

16S barcode plate layout:

16S barcode plate layout

重芁

The 96-well plates are designed to break in one direction only. Strips, or multiple strips, of eight wells/barcodes can be removed from the plate at any one time.

Thaw the desired barcodes at room temperature.

Briefly centrifuge barcodes in a microfuge to make sure the liquid is at the bottom of the tubes and place on ice.

Thaw the LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix, spin down briefly, mix well by pipetting and place on ice.

Prepare the DNA in nuclease-free water.

  • Transfer 10 ng of each genomic DNA sample into a 0.2 ml thin-walled PCR tube
  • Adjust the volume to 15 ÎŒl with nuclease-free water
  • Mix thoroughly by flicking avoiding unwanted shearing
  • Spin down briefly in a microfuge

In each 0.2 ml thin-walled PCR tube containing a sample to be tested, prepare the following mixture:

Reagent Volume
10 ng input DNA (from previous step) 15 ÎŒl
LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix 25 ÎŒl
Total 40 ÎŒl

Note: If the amount of input material is altered, the number of PCR cycles may need to be adjusted to produce the same yield.

Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting and spin down briefly.

Using clean pipette tips, carefully pierce the foil surface of the required barcodes. Use a new tip for each barcode to avoid cross-contamination. Make a note of which barcode numbers will be run for each sample.

Using a multichannel pipette, mix the 16S barcodes by pipetting up and down 10 times. Transfer 10 ÎŒl of each 16S Barcode into respective sample-containing tubes.

Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting the contents of the tubes 10 times and spin down.

Note: Mix gently to minimise introducing air bubbles to the reactions.

Amplify using the following cycling conditions:

Cycle step Temperature Time No. of cycles
Initial denaturation 95 °C 1 min 1
Denaturation 95 °C 20 secs 25
Annealing 55 °C 30 secs 25
Extension 65 °C 2 mins 25
Final extension 65 °C 5 mins 1
Hold 4 °C ∞

Thaw reagents at room temperature, spin down briefly using a microfuge and mix by pipetting as indicated by the table below:

Reagent 1. Thaw at room temperature 2. Briefly spin down 3. Mix well by pipetting or vortexing
Rapid Adapter (RA) Not frozen ✓ Pipette
Adapter Buffer (ADB) ✓ ✓ Vortex or Pipette
AMPure XP Beads (AXP) ✓ ✓ Mix by vortexing immediately before use
Elution Buffer (EB) ✓ ✓ Vortex or Pipette
EDTA (EDTA) ✓ ✓ Vortex or Pipette

Note: Once thawed, keep all reagents on ice.

Add 4 µl of EDTA to each barcoded sample, mix thorougly by pipetting and spin down briefly.

ヒント

EDTA is added at this step to stop the reaction.

Incubate for 5 minutes at room temperature.

Quantify 1 µl of each barcoded sample using a Qubit fluorometer (or equivalent) for QC check.

Pool all barcoded samples in equimolar ratios in a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Note: Please ensure you have quantified your samples prior to this step and take forward an equimolar concentration of each of the samples for optimal barcode balancing. Samples may vary in concentration following the barcoded PCR, therefore the volume of each barcoded sample added to the pool will be different.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

To the pool of barcoded samples, add a 0.6X volume ratio of resuspended AMPure XP Beads (AXP) and mix by pipetting:

Volume of barcoded sample pool 37.5 ÎŒl 75 ÎŒl 150 ÎŒl 300 ÎŒl 600 ÎŒl
Volume of AMPure XP Beads (AXP) 22.5 ÎŒl 45 ÎŒl 90 ÎŒl 180 ÎŒl 360 ÎŒl

Note: Table contains example volumes for reference. Please adjust the volume of AMPure XP Beads (AXP) added for the volume of your barcoded sample pool to ensure a 0.6X volume ratio.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 5 minutes at room temperature.

Prepare 2 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

Briefly spin down the sample and pellet on a magnetic rack until supernatant is clear and colourless. Keep the tube on the magnetic rack, and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 1 ml of freshly-prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

前のステップを繰り返したす。

スピンダりンし、チュヌブをマグネットの䞊に戻したす。残った゚タノヌルをピペットで取り陀きたす。ペレットを30 秒間皋也かしたす。 ただし、 ペレットにひびが入るたでは也燥させないでください。

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet by pipetting in 15 µl Elution Buffer (EB). Spin down and incubate for 5 minutes at room temperature.

溶出液が無色透明になるたで、少なくずも1分間マグネット䞊でビヌズをペレット化したす。

Remove and retain 15 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

  • Remove and retain the eluate which contains the DNA library in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
  • Dispose of the pelleted beads
CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

Transfer 50 fmol of your eluted sample into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Make up the volume to 11 µl with Elution Buffer (EB).

In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, dilute the Rapid Adapter (RA) as follows and pipette mix:

Reagent Volume
Rapid Adapter (RA) 1.5 ÎŒl
Adapter Buffer (ADB) 3.5 ÎŒl
Total 5 ÎŒl

Add 1 µl of the diluted Rapid Adapter (RA) to the barcoded DNA.

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Incubate the reaction for 5 minutes at room temperature.

最終ステップ

The prepared library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice until ready to load.

4. Priming and loading the MinION and GridION Flow Cell

材料
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB)
  • Sequencing Buffer (SB)
消耗品
  • MinionずGridIONのFlow Cell
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装眮
  • MinIONかGridION のデバむス
  • MinIONずGridIONのFlow Cell ラむトシヌルド
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
重芁

泚意本キットはR10.4.1フロヌセルFLO-MIN114のみに察応しおいたす。

ヒント

フロヌセルのプラむミングずロヌディング

新芏ナヌザヌは、 初回䜿甚前に'Priming and loading your flow cell' のビデオをご芧いただくこずをお勧めしたす。

Using the Library Solution

For most sequencing experiments, use the Library Beads (LIB) for loading your library onto the flow cell. However, for viscous libraries it may be difficult to load with the beads and may be appropriate to load using the Library Solution (LIS).

Sequencing BufferSB、Library BeadsLIBたたはLibrary SolutionLISを䜿甚する堎合のみ、Flow Cell TetherFCTおよびFlow Cell FlushFCFを宀枩で融解しおから、ボルテックスで混合したす。その埌、スピンダりンしお氷䞊で保存したす。

重芁

MinION R10.4.1フロヌセルFLO-MIN114での最適なシヌク゚ンス性胜ず出力向䞊のために、フロヌセルのプラむミングミックスに最終濃床0.2 mg/mlでBovine Serum Albumin (BSA) を添加するこずを掚奚したす。

(泚 その他のアルブミンの皮類組換えヒト血枅アルブミンなどの䜿甚は掚奚したせん。

To prepare the flow cell priming mix with BSA, combine the following reagents in a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Mix by inverting the tube and pipette mix at room temperature:

Reagents Volume per flow cell
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Final total volume in tube 1,205 µl

MinIONたたはGridIONデバむスの蓋を開け、フロヌセルをクリップの䞋にスラむドさせたす。 フロヌセルをしっかりず抌さえ、サヌマルプレヌトず電気接觊が密着しおいるかを確認しおください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b_JP

オプショナルステップ

ラむブラリヌをロヌドする前にフロヌセルチェックを行い、䜿甚可胜なポアの数を把握しお䞋さい。

フロヌセルが以前にチェックされおいる堎合は、このステップを省略できたす。

詳现に぀いおは、MinKNOWプロトコルのフロヌセルチェックの手順 flow cell check instructionsを参照しおください。

フロヌセルのプラむミングポヌトカバヌを時蚈方向にスラむドさせ、プラむミングポヌトを開きたす。

Flow Cell Loading Diagrams Step 2_JP

重芁

フロヌセルからバッファヌを匕き䞊げる際には泚意しおください。2030ÎŒl以䞊は陀去せず、ポアのアレむ党䜓が垞にバッファヌで芆われおいるこずを確認しお䞋さい。アレむに気泡が入るず、ポアに䞍可逆的なダメヌゞを䞎える可胜性がありたす。

プラむミングポヌトを開けた埌に、カバヌの䞋に小さな気泡がないかを確認しお䞋さい。気泡を取り陀くために少量の液を匕き䞊げたす。

  1. P1000ピペットを200 µ Lに蚭定しお䞋さい。
  2. ピペットの先端をプラむミングポヌトに差し蟌みたす。
  3. 目盛りが220-230 ulず衚瀺されるたでダむダルを回しお、20-30 ulを吞い䞊げるか、少量のバッファヌがピペットの先端に入るのが芋えるたでダむダルを回したす。

(泚 プラむミングポヌトからセンサヌアレむ党䜓にバッファヌがあるこずを確認しおください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5_JP

気泡が混入しないように、プラむミングポヌトからフロヌセルにプラむミングミックスを800µl泚入し、 5分間埅ちたす。この分間の間に、以䞋の手順でラむブラリヌをロヌドする準備をしお䞋さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5_JP

Library Beads(LIB)の液をピペッティングするこずで十分に混合しお䞋さい。

重芁

Library BeadsLIBチュヌブにはビヌズの懞濁液が入っおいたす。これらのビヌズはすぐに沈殿するので、䜿甚盎前に混合するこずが重芁です。

ほずんどのシヌケンス実隓にはLibrary Beads LIBの䜿甚を掚奚したす。しかし、より粘性の高いラむブラリヌにはLibrary SolutionLISを䜿っおください。

新しい1.5mlのEppendorf DNA LoBindチュヌブにおラむブラリヌをロヌドする準備をしたす。詳现は以䞋に蚘茉されおいたす。

è©Šè–¬ フロヌセルあたりの容量
Sequencing Buffer (SB) 37.5 µl
Library Beads LIBたたはLibrary SolutionLIS䜿甚する堎合は、䜿甚盎前に混合しお䞋さい。 25.5 µl
DNA library 12 µl
合蚈 75 µl

フロヌセルのプラむミングを完了させたす。

  1. SpotON サンプルポヌトカバヌをゆっくりず持ち䞊げ、SpotON サンプルポヌトにアクセスできるようにしたす。
  2. 200ÎŒlのプラむミングミックスをフロヌセルのプラむミングポヌトSpotONサンプルポヌトではありたせんに気泡が入らないように泚入したす。

Flow Cell Loading Diagrams Step 5_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5_JP

調補したラむブラリヌは、ロヌドする盎前にピペッティング混合しお䞋さい。

調補したラむブラリヌ75ÎŒlをSpotONサンプルポヌトからフロヌセルに滎䞋したす。次の䞀滎を远加する前に各䞀滎がポヌトに入っおいるこずを確認しお䞋さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 07 V5_JP

SpotONサンプルポヌトカバヌをゆっくりず元に戻し、バングカバヌの先がSpotONポヌトに入るこずを確認し、プラむミングポヌトを閉じたす。

Step 8 update_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 9_JP

重芁

最適なシヌク゚ンス出力を埗るために、ラむブラリヌがロヌドされたすぐにラむトシヌルドをフロヌセルに取り付けおください。

ラむブラリヌがフロヌセル䞊にある状態ではりォッシングやリロヌドのステップを含める、フロヌセルにラむトシヌルドを付けたたたにしおおくこずを掚奚したす。ラむトシヌルドは、ラむブラリヌがフロヌセルから陀去された時点で取り倖すこずができたす。

ラむトシヌルドを以䞋のようにフロヌセルに蚭眮しお䞋さい。

  1. ラむトシヌルドの先端を慎重にクリップに圓おたす。 (泚 ラむトシヌルドをクリップの䞋に無理に抌し蟌たないでください。

  2. ラむトシヌルドをフロヌセルにゆっくりず䞋ろしたす。ラむトシヌルドは、フロヌセルの䞊郚党䜓を芆うようにSpotONカバヌの呚囲に取り付けたす。

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised-Japanese step10

泚意

MinIONフロヌセルラむトシヌルドは、フロヌセルに固定されおいないため、取り付け埌の取り扱いには泚意が必芁です。

最終ステップ

デバむスの蓋を閉め、MinKNOWでシヌク゚ンスランをセットしたす。

5. Data acquisition and basecalling

シヌク゚ンスの開始方法

フロヌセルをロヌドしたら、MinKNOWでシヌク゚ンシングランを開始できたす。MinKNOWは、装眮、デヌタ収集、リアルタむムベヌスコヌルを制埡するシヌク゚ンス゜フトりェアです。 MinKNOWの蚭定ず䜿甚の詳现に぀いおは、MinKNOW Protocolを参照しおください。

MinKNOWは、耇数の方法でシヌク゚ンスの蚭定をするこずができたす。

  • シヌク゚ンシングデバむスに盎接かリモヌトで接続されおいるコンピュヌタヌ。
  • GridION、Minion Mk1C、たたはPromethion 24/48シヌク゚ンシングデバむスで盎接䜿甚できたす。

シヌク゚ンス装眮でMinKNOWを䜿甚する方法の詳现に぀いおは、装眮のナヌザヌマニュアルを参照しおください。

MinKNOWでシヌク゚ンスランを開始するには、次の手順に埓いたす。

1. スタヌトペヌゞに移動し、 Start sequencing をクリックしたす。

2. 名前、フロヌセルの䜍眮、サンプルIDなどの実隓の詳现を入力したす。

3. キットのペヌゞで、ラむブラリヌ調補に䜿甚するシヌク゚ンシングキットを遞択したす。

4. シヌク゚ンスランのパラメヌタの倉曎を蚭定ランオプションの倉曎などするか、デフォルト蚭定のたたにしたす。

(泚 シヌク゚ンスランの蚭定時にベヌスコヌルがオフになっおいた堎合には、MinKNOWでポストラン・ベヌスコヌルを埌日に実行するこずも出来たす。詳现に぀いおは、MinKNOW protocolを参照しおください。

5. Start をクリックしおシヌク゚ンスランを開始したす。

シヌク゚ンシング埌のデヌタ解析

MinKNOWでシヌク゚ンスが終わるず、フロヌセルを再利甚たたは返华ができたす。詳しくは、フロヌセルの再利甚ず返华のセクションをご芧ください。

シヌク゚ンシングずベヌスコヌルの埌にはデヌタを解析するこずができたす。 ベヌスコヌルおよびベヌスコヌル埌の解析オプションの詳现に぀いおは、Data Analysis を参照しおください。

ダりンストリヌム解析セクションでは、デヌタを解析するためのオプションの抂芁を説明しおいたす。

6. Flow cell reuse and returns

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

シヌク゚ンス実隓終了埌、フロヌセルを再利甚する堎合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコヌルに埓い、掗浄したフロヌセルを28℃で保管しおください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティヌで入手できたす。

たたは、返送手順に埓っお、オックスフォヌド・ナノポアに返送しおください。

フロヌセルの返华方法は hereをご芧ください。

(泚 補品を返华する前に、すべおのフロヌセルを脱むオン氎で掗浄する必芁がありたす。

重芁

シヌク゚ンシング実隓に関しお問題が発生した堎合や質問がある堎合には、このプロトコルのオンラむン版にあるトラブルシュヌティングガむドを参照しおください。

7. Downstream analysis

Post-basecalling analysis

We recommend performing downstream analysis using EPI2ME which facilitates bioinformatic analyses by allowing users to run Nextflow workflows in a desktop application. EPI2ME maintains a collection of bioinformatic workflows which are curated and actively maintained by experts in long-read sequence analysis.

Further information about the available EPI2ME workflows are available here, along with the Quick Start Guide to start your first bioinformatic workflow.

The 16S workflow (wf-16s) is a Nextflow workflow leveraging the power of wf-metagenomics for identification of the origin of reads from targeted amplicon sequencing. The workflow has two modes of operation, it can use either kraken2 or minimap2 to determine the origin of reads.

More information on the EPI2ME 16S workflow (wf-16s) can be found here.

For installation instructions please click here.

Additional options for further analysing your basecalled data include:

1. Research analysis tools

Oxford Nanopore Technologies' Research division has created a number of analysis tools, that are available in the Oxford Nanopore GitHub repository. The tools are aimed at advanced users, and contain instructions for how to install and run the software. They are provided as-is, with minimal support.

2. Community-developed analysis tools

If a data analysis method for your research question is not provided in any of the resources above, please refer to the Bioinformatics section of the Resource centre. Numerous members of the Nanopore Community have developed their own tools and pipelines for analysing nanopore sequencing data, most of which are available on GitHub. Please be aware that these tools are not supported by Oxford Nanopore Technologies, and are not guaranteed to be compatible with the latest chemistry/software configuration.

8. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation

以䞋は、最もよく起こる問題のリストであり、いく぀かの原因ず解決策が提案されおいたす。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご甚意しおいたす。

ご提案された解決策を詊しおも問題が解決しない堎合は、テクニカルサポヌトに電子メヌル (support@nanoporetech.com)たたは LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

サンプルの品質が䜎い

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
DNAの玔床が䜎いDNAのOD 260/280のナノドロップ枬定倀が1.8未満およびOD 260/230が2.02.2未満 DNA抜出で必芁な玔床が埗られおいない 借雑物の圱響は、 Contaminants に瀺されおいたす。コンタミネヌションをもたらさないために別の抜出方法extraction method をお詊しください。.

远加のSPRIクリヌンアップステップの実斜を怜蚎しお䞋さい。
䜎いRNA むンテグリティヌRNA Integrity Number: <9.5 RIN、たたはrRNAバンドがゲル䞊でスメアになっおいる 抜出䞭にRNAが分解された 別のRNA抜出方法 RNA extraction methodを詊しおください。RINの詳现に぀いおは、 RNA Integrity Number の資料を参照しおください。詳现に぀いおは、 DNA/RNA Handling のペヌゞをご芧ください。
RNAのフラグメントが予想より短い 抜出䞭にRNAが分解された 別のRNA抜出方法 RNA extraction methodを詊しおください。 RINの詳现に぀いおは、 RNA Integrity Number の資料を参照しおください。詳现に぀いおは、DNA/RNA Handling のペヌゞをご芧ください。

RNAを扱う際には、RNaseフリヌの環境で䜜業し、実隓噚具もRNaseフリヌにしおおくこずをお勧めしたす。

Low DNA recovery after AMPure bead clean-up

Observation Possible cause Comments and actions
Low recovery DNA loss due to a lower than intended AMPure beads-to-sample ratio 1. AMPure beads settle quickly, so ensure they are well resuspended before adding them to the sample.

2. When the AMPure beads-to-sample ratio is lower than 0.4:1, DNA fragments of any size will be lost during the clean-up.
Low recovery DNA fragments are shorter than expected The lower the AMPure beads-to-sample ratio, the more stringent the selection against short fragments. Please always determine the input DNA length on an agarose gel (or other gel electrophoresis methods) and then calculate the appropriate amount of AMPure beads to use. SPRI cleanup
Low recovery after end-prep The wash step used ethanol <80% DNA will be eluted from the beads when using ethanol <80%. Make sure to use the correct percentage.

9. Issues during the sequencing run using a Rapid-based sequencing kit

以䞋は、最もよく起こる問題のリストであり、いく぀かの原因ず解決策が提案されおいたす。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご甚意しおいたす。

ご提案された解決策を詊しおも問題が解決しない堎合は、テクニカルサポヌトに電子メヌル (support@nanoporetech.com)たたは LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

シヌク゚ンス開始時のポアがフロヌセルチェック埌よりも少ない堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 ナノポアアレむに気泡が入っおしたった。 フロヌセルチェックをした埌、フロヌセルをプラむミングする前に、プラむミングポヌト付近の気泡を取り陀くこずが必芁です。 気泡を取り陀かないず、気泡がナノポアアレむに移動し、空気に觊れたたナノポアが䞍可逆的なダメヌゞを負った可胜性がある。これを防ぐための最適な方法が、 this videoで玹介されおいたす。
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 フロヌセルがデバむスに正しく挿入されおいない。 シヌク゚ンスランを停止し、フロヌセルをシヌク゚ンス装眮から取り出したす。次に再床フロヌセルを挿入し、装眮にしっかりず固定され、目暙枩床に達しおいるこずを確認したす。GridIONやPromethIONの堎合は別のフロヌセルの䜍眮をお詊しください。
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 ラむブラリヌ内の汚染物質がポアを倱掻させたり塞いだりしおいる。 フロヌセルチェックの際のポア数は、フロヌセル保存バッファヌ䞭のQC甚のDNA分子を甚いお蚈枬されたす。シヌク゚ンシングの開始時は、ラむブラリ自䜓を䜿甚しおアクティブなポア数を掚定したす。このため、フロヌセルチェックずRun開始時のポア数は、玄10皋床の倉動が起こりたす。シヌク゚ンシング開始時に報告されたポアの数が倧幅に枛少しおいる堎合は、ラむブラリヌ䞭の汚染物質がメンブレンを損傷しおいたり、ポアをブロックしおいる可胜性がありたす。むンプット材料の玔床を向䞊させるために、別のDNA/RNA抜出たたは粟補方法が必芁ずなる堎合がありたす。コンタミネヌションの圱響は、Contaminants Know-how pieceを参照にしお䞋さい。借雑物を陀去するために別の抜出方法extraction method をお詊しください。

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
MinKNOW に 「Script failed」ず衚瀺されおいる"
コンピュヌタヌを再起動し、MinKNOWを再起動したす。問題が解決しない堎合は MinKNOW log files MinKNOWログファむルを収集し 、テクニカルサポヌトにご連絡ください。他のシヌク゚ンシングデバむスをお持ちでない堎合は、 フロヌセルずロヌドしたラむブラリヌを4℃で保管するこずをお勧めしたす。詳现な保管方法に぀いおは、テクニカルサポヌトにお問い合わせください。

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell 10–50 fmol of good quality library can be loaded on to a MinION Mk1B/GridION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Rapid PCR Barcoding Kit V14 was used, and sequencing adapters did not attach to the DNA Make sure to closely follow the protocol and use the correct volumes and incubation temperatures. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of reagents.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are added during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming.

予想より短いリヌド長

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
予想より短いリヌド長 DNAサンプルの䞍芁な断片化 読み取り長はサンプルDNA断片の長さを反映したす。サンプルDNAは、抜出およびラむブラリヌ調補䞭の操䜜で断片化した可胜性がありたす。

1. 抜出の最適な方法に぀いおは、Extraction Methods の抜出方法を参照しおください。

2. ラむブラリヌ調補に進む前に、アガロヌスゲル電気泳動で、サンプルDNAのフラグメント長の分垃を確認しおください。 DNA gel2 䞊の画像では、サンプル1は高分子量ですが、サンプル2は断片化されおいたす。

3. ラむブラリヌ調補䞭は、詊薬を混合するためのピペッティングやボルテックス操䜜は、プロトコルで指瀺がないかぎり行わないでください。

利甚できないポアの割合が倚い堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
利甚できないポアの割合が倧きいチャンネルパネルずポアのアクティブポヌトで青く衚瀺されおいたす

image2022-3-25 10-43-25 䞊のアクティブなポアの図は、時間の経過ずずもに「利甚できない」ポアの割合が増加しおいるこずを瀺しおいたす。		 サンプル内に䞍玔物が含たれおいる 䞀郚のポアに吞着する䞍玔物は、MinKNOWに組み蟌たれたポアのブロック解陀機胜によっお、ポアから陀去するこずができたす。 このステップが完了するず、ポアの状態が「sequencing pore」に戻りたす。利甚できないポアの郚分が倚いか、増加した堎合:

1.Flow Cell Wash Kit nuclease flush using the Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) を甚いお、ヌクレアヌれ掗浄を 行うこずができたす。又は
2. PCRを数サむクル実行しおサンプルDNAの量を増やし、サンプルDNAに含たれる問題の䞍玔物が盞察的に枛る垌釈されるようにしたす。

Inactiveのポアの割合が高い

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
利甚できない(inactive/unavailable)ポアの割合が高いチャネルパネルずポアアクティブポヌトでは氎色で衚瀺されおいたすポアたたは膜に損傷が起きおしたった。 気泡がフロヌセルに混入した。 フロヌセルのプラむミングやラむブラリヌのロヌドで気泡が入るず、ポアに䞍可逆的なダメヌゞを䞎える可胜性がありたす。 掚奚の操䜜方法に぀いおは、Priming and loading your flow cell のビデオをご芧ください。
利甚できないポアの割合が倚い堎合 サンプルDNAに含たれる䞍玔物 既知の化合物問題で、サンプルDNAに倚糖類が含たれた事で、怍物のゲノムDNAず結合しポアをブロックした。

1. 怍物葉DNA抜出法 Plant leaf DNA extraction methodをご参照ください。
2. QIAGEN PowerClean Pro キットを䜿甚しおクリヌンアップしお䞋さい。
3. QIAGEN REPLI-g kit.キットを䜿甚しお、元のgDNAサンプルで党ゲノム増幅を実行したす。
利甚できないポアの割合が倚い堎合 サンプル内に䞍玔物が含たれおいる 䞍玔物の圱響は、 Contaminants の ノりハりを参照しお䞋さい。 サンプルDNAに䞍玔物を残留させないために別の抜出方法をお詊しください。

枩床倉動

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
枩床倉動 フロヌセルずデバむスの接続が途切れおいる。 フロヌセルの背面にある金属プレヌトを芆っおいるヒヌトパッドがあるこずを確認しおください。 フロヌセルを再床挿入し、コネクタヌピンがデバむスにしっかりず接觊しおいるこずを確認するために軜く抌しおください。問題が解決しない堎合は、テクニカルサヌビスにご連絡しおください。

目暙枩床に到達しない堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目暙枩床に達しなかった)ず衚瀺する。" 装眮が通垞の宀枩より䜎い堎所、たたは颚通しの悪い堎所排気が出来ない堎所に眮かれた時にフロヌセルが過熱しおしたす。 MinKNOWでは、フロヌセルが目暙枩床に到達するたでの既定の時間枠がありたす。時間枠を超えるず、゚ラヌメッセヌゞが衚瀺され、シヌク゚ンシング実隓が続行されたす。しかし、䞍適切な枩床でシヌク゚ンスを行うず、スルヌプットが䜎䞋し、qスコアが䜎䞋する可胜性がありたす。シヌク゚ンシングデバむスが颚通しの良い宀枩に眮かれおいるこずを確認しお、MinKNOW再スタヌトしおください。MinION Mk 1Bの枩床制埡の詳现に぀いおは、FAQ を参照しおください。

Last updated: 12/11/2024

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