Ligation sequencing V14 - Direct cDNA sequencing (SQK-LSK114)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Ligation sequencing V14 - Direct cDNA sequencing (SQK-LSK114) V DCS_9187_v114_revJ_12Dec2024

The PCR-free protocol for full-length cDNA offers:

  • Higher yields than traditional cDNA synthesis
  • Analysis of splice variants & fusion transcripts
  • Compatibility with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

概要

The PCR-free protocol for full-length cDNA offers:

  • Higher yields than traditional cDNA synthesis
  • Analysis of splice variants & fusion transcripts
  • Compatibility with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: DCS_9187_v114_revJ_12Dec2024

1. Overview of the protocol

Direct cDNA Sequencing V14 with SQK-LSK114 features

This protocol is recommended for users who:

  • Are interested in exploring novel RNA biology.
  • Are looking for splice variant and fusion transcript analysis.
  • Do not wish to use PCR.
  • Wish to preserve quantitative information in samples likely to be impacted by PCR bias.
  • Would like full-length cDNA strands.
  • Want to achieve median raw read accuracy of Q20+ (99%) and above.
  • Want to optimise their sequencing experiment for output.

Introduction to the Direct cDNA sequencing protocol

This protocol describes how to carry out sequencing of cDNA using a reverse transcription and stand-switching method and the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114).

This protocol requires the use of three oligo primers to be ordered from a third-party (e.g. IDT):

Oligo Sequence (5' to 3')
VN Primer /5phos/ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Strand-switching Primer TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCTmGmGmG
PR2 Primer /5Phos/TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC
Note: mG = 2' O-Methyl RNA bases.
  • The VN Primer will anchor to the RNA Poly(A)+ tail and prime the first strand synthesis.
  • The Strand-switching Primer will anneal to the non-template nucleotides (C’s) of the novel cDNA strand generated from the first strand synthesis, enabling strand switching.
  • Following RNA degradation, the PR2 Primer will prime the second strand synthesis of the cDNA sample.

Using this strand-switching method allows for high yields of cDNA library generation from RNA, while also selecting for full-length transcripts.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Order the three oligo primers from a third-party
  • Extract your RNA, and check its length, quantity and purity. Alternatively, you can start with already-prepared cDNA. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

You will need to:

  • Using the strand-switching protocol, prepare full-length cDNAs from Poly(A)+ RNA
  • Ligate sequencing adapters to the cDNA
  • Prime the flow cell, and load your cDNA library into the flow cell

DCS109

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
  • (Optional): Start the EPI2ME software and select a workflow for further analysis, e.g. Fastq yeast transcriptome analysis
注意

Data ananlysis for the Ligation sequencing V14 - Direct cDNA sequencing (SQK-LSK114) is currently incompatible with the default setup for wf-transcriptomes.

Data ananlysis for the Ligation sequencing V14 - Direct cDNA sequencing (SQK-LSK114) is currently incompatible with the default setup for wf-transcriptomes. Pychopper currently miss-classsifies The reads generated with Direct cDNA Sequencing are not being classified correctly in the analysis workflow, leading to ≥80% data loss of full-read transcripts following analysis with wf-transcriptomes.

Note: Experienced users may be able to disable Pychopper during wf-transcriptomes analysis setup to circumvent this issue using the infomation available in the wf-transcriptomes GitHub page and the Pychopper GitHub page. Please note that deviating from the standard analysis settings can result in changes to the analysis output.

重要

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

  • Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
  • R10.4.1 flow cells (FLO-MIN114)
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

2. Equipment and consumables

材料
  • 100 ng Poly(A)+ RNA OR 1 µg of total RNA
  • Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
消耗品
  • User-supplied VN Primer, 2 µM
  • User-supplied Strand-Switching Primer, 10 µM
  • User-supplied PR2 Primer, 10 µM
  • NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L). Alternatively, you can use the NEBNext® products below:
  • NEBNext® Ultra II End Repair / dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • nuclease-free waterで調整した 80% エタノール溶液
  • 10 mM dNTP solution (e.g. NEB N0447)
  • LongAmp Taq 2X Master Mix (e.g. NEB M0287)
  • Maxima H Minus Reverse Transcriptase (200 U/µl) with 5x RT Buffer (ThermoFisher, cat # EP0751)
  • RNaseOUT™, 40 U/μl (Life Technologies, cat # 10777019)
  • RNase Cocktail Enzyme Mix (ThermoFisher, cat # AM2286)
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
装置
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • 1.5 mlエッペンドルフチューブに最適のマグネット式ラック
  • 小型遠心機
  • ボルテックスミキサー
  • Thermal cycler
  • アイスバケツ（氷入り）
  • タイマー
  • Pre-chilled freezer block at -20° C for 200 µl tubes (e.g. Eppendorf cat # 022510509)
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットとチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 ピペットとチップ
オプション装置
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）

For this protocol, you will need 100 ng Poly(A)+ RNA or 1 µg of total RNA.

If using alternative cDNA preparation methods, start the protocol with 70–200 fmol of pre-prepared cDNA at the cDNA repair and end-prep step.

This protocol requires primer oligos to be ordered separately:

Oligo Sequence (5' to 3') Purity recommended Dilution required
VN Primer /5phos/ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN HPLC 2 µM
Strand-switching Primer TTTCTGTTGGTGCTGATATTGCTmGmGmG HPLC 10 µM
PR2 Primer /5Phos/TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC HPLC 10 µM
Note: mG = 2' O-Methyl RNA bases.

Note: Please ensure your primer oligos are ordered at HPLC purity level for optimal results. If ordering from IDT, the primer oligos will need to be ordered at a minimum scale of 100 nmole to enable HPLC purification.

Input RNA

It is important that the input RNA meets the quantity and quality requirements. Using too little or too much RNA, or RNA of poor quality (e.g. fragmented or containing chemical contaminants) can affect your library preparation.

For instructions on how to perform quality control of your RNA sample, please read the Input DNA/RNA QC protocol.

For further information on using RNA as input, please read the links below.

These documents can also be found in the DNA/RNA Handling page.

NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing

For customers new to nanopore sequencing, we recommend buying the NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (catalogue number E7180S or E7180L), which contains all the NEB reagents needed for use with the Ligation Sequencing Kit.

Please note, for this protocol, NEBNext FFPE DNA Repair Mix and NEBNext FFPE DNA Repair Buffer are not required.

サードパーティー試薬

このプロトコールで使用されているすべてのサードパーティー試薬は、当社が検証し、使用を推奨しているものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以外の試薬を用いたテストは行っていません。

すべてのサードパーティ製試薬については、製造元の指示に従って使用の準備をすることをお勧めします。

重要

ライゲーションアダプター（LA）のライゲーション効率を高めるため、NEBNext Quick Ligation Module に付属しているリガーゼバッファーではなく、Ligation Sequencing Kit V14 に付属のライゲーションバッファー（LNB）のご使用を強くお勧めします。

Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) のコンテンツ

（注： 現在のキットの容器を変更しています。今までは実験毎に使い捨てのシングルユーズチューブを使用していましたが、バッファー単位のボトル容器に変更しています。

シングルユースチューブの場合: SQK-LSK114 v2

ボトル容器の場合: SQK-LSK114 v3

（注： 本製品には、Beckman Coulter、Inc.製のAMPure XP試薬が含まれており、試薬の安定性を損なうことなくキットと共に-20 ° Cで保存することができます。

（注： DNA Control Sample（DCS）は3.6kbのアンプリコンで、Lambda genomeの3'末端をマッピングしたプレップコントロールです。

3. Computer requirements and software

MinION Mk1B IT requirements

Sequencing on a MinION Mk1B requires a high-spec computer or laptop to keep up with the rate of data acquisition. For more information, refer to the MinION Mk1B IT requirements document.

MinION Mk1C IT requirements

The MinION Mk1C contains fully-integrated compute and screen, removing the need for any accessories to generate and analyse nanopore data. For more information refer to the MinION Mk1C IT requirements document.

MinION Mk1D IT requirements

Sequencing on a MinION Mk1D requires a high-spec computer or laptop to keep up with the rate of data acquisition. For more information, refer to the MinION Mk1D IT requirements document.

Software for nanopore sequencing

MinKNOW

The MinKNOW software controls the nanopore sequencing device, collects sequencing data and basecalls in real time. You will be using MinKNOW for every sequencing experiment to sequence, basecall and demultiplex if your samples were barcoded.

For instructions on how to run the MinKNOW software, please refer to the MinKNOW protocol.

EPI2ME (optional)

The EPI2ME cloud-based platform performs further analysis of basecalled data, for example alignment to the Lambda genome, barcoding, or taxonomic classification. You will use the EPI2ME platform only if you would like further analysis of your data post-basecalling.

For instructions on how to create an EPI2ME account and install the EPI2ME Desktop Agent, please refer to this link.

フローセルのチェックをしてください

シークエンシング実験を開始する前に、フローセルのポアの数を確認することを強くお勧めします。このフローセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの場合は代理店への到着から１２週間以内に行ってください。またはFlongle Flow Cellの場合は代理店への到着から4週間以内に行う必要があります。Oxford Nanopore Technologiesは、フローセルチェックの実施から2日以内に結果が報告され、推奨される保管方法に従っていた場合に、以下の表に記載されているナノポアの有効数に満たさない場合には、フローセルを交換します。 フローセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指示に従ってください。

Flow cell 保証する最小有効ポア数（以下の数未満のフローセルが交換対象となります）
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000

4. Reverse transcription and strand-switching

材料
  • 100 ng Poly(A)+ RNA OR 1 µg of total RNA
消耗品
  • User-supplied VN Primer, 2 µM
  • User-supplied Strand-Switching Primer, 10 µM
  • 10 mM dNTP solution (e.g. NEB cat # N0447)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat # AM9937)
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes
  • Maxima H Minus Reverse Transcriptase (200 U/µl) with 5x RT Buffer (ThermoFisher, cat # EP0751)
  • RNaseOUT™, 40 U/μl (Life Technologies, cat # 10777019)
装置
  • Pre-chilled freezer block at -20° C for 200 µl tubes (e.g. Eppendorf cat # 022510509)
  • 小型遠心機
  • Thermal cycler
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットとチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 ピペットとチップ
重要

If you have already prepared your cDNA, use 70–200 fmol cDNA (~70–200 ng if your sample is 1.5 kb) and start from the cDNA repair and end-prep step.

Thaw the following reagents and spin down briefly using a microfuge, before mixing as indicated in the table below, and place on ice.

Reagent 1. Thaw at room temperature 2. Briefly spin down 3. Mix well by pipetting
User-supplied VN Primer diluted to 2 µM ✓ ✓ ✓
User-supplied Strand-Switching Primer diluted to 10 µM ✓ ✓ ✓
10 mM dNTP solution ✓ ✓ ✓
RNaseOUT Not frozen ✓ ✓
Maxima H Minus Reverse Transcriptase Not frozen ✓ ✓
Maxima H Minus 5x RT Buffer ✓ ✓ Mix by vortexing

Prepare the RNA in nuclease-free water

  • Transfer 100 ng Poly(A)+ RNA or 1 μg of total RNA into a 0.2 ml PCR tube
  • Adjust the volume to up to 7.5 μl with nuclease-free water
  • Mix by flicking the tube to avoid unwanted shearing
  • Spin down briefly in a microfuge

Prepare the following reaction in the 0.2 ml PCR tube containing the prepared RNA input:

Reagent Volume
RNA input (100 ng Poly(A)+ RNA or 1 μg of total RNA) from step above 7.5 μl
VN Primer diluted to 2 μM 2.5 μl
10 mM dNTPs 1 μl
Total volume 11 μl

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Incubate at 65°C for 5 minutes and then snap cool on a pre-chilled freezer block for 1 minute.

In a separate tube, mix together the following:

Reagent Volume
5x RT Buffer 4 μl
RNaseOUT 1 μl
Nuclease-free water 1 μl
Strand-Switching Primer diluted to 10 µM 2 μl
Total 8 μl

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Add the 8 μl of strand-switching reagents (prepared in steps 6-7) to the 11 μl of snap-cooled mRNA (from steps 2-5). Mix by flicking the tube and spin down.

Incubate at 42°C for 2 minutes in the thermal cycler.

Add 1 µl of Maxima H Minus Reverse Transcriptase. The total volume is now 20 µl.

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Incubate using the following protocol using a thermal cycler:

Cycle step Temperature Time No. of cycles
Reverse transcription and strand-switching 42°C 90 mins 1
Heat inactivation 85°C 5 mins 1
Hold 4°C ∞

5. RNA degradation and second strand synthesis

材料
  • AMPure XP Beads (AXP)
消耗品
  • User-supplied PR2 Primer, 10 µM
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat # AM9937)
  • LongAmp Taq 2X Master Mix (e.g. NEB cat # M0287)
  • RNase Cocktail Enzyme Mix (ThermoFisher, cat # AM2286)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装置
  • Thermal cycler
  • ボルテックスミキサー
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • 1.5 mlエッペンドルフチューブに最適のマグネット式ラック
  • アイスバケツ（氷入り）
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットとチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 ピペットとチップ
オプション装置
  • DNA QC equipment, e.g. Qubit fluorometer, NanoDrop spectrophotometer, Agilent Bioanalyzer or Tapestation, Agilent FEMTO Pulse

Thaw the following reagents and spin down briefly using a microfuge, before mixing as indicated in the table below, and place on ice.

Reagent 1. Thaw at room temperature 2. Briefly spin down 3. Mix well by pipetting
User-supplied PR2 Primer diluted to 10 µM ✓ ✓ ✓
RNase Cocktail Enzyme Mix Not frozen ✓ ✓
LongAmp Taq 2X Master Mix ✓ ✓ ✓

Thaw the AMPure XP Beads (AXP) at room temperature and mix by vortexing. Keep the beads at room temperature.

Add 1 µl RNase Cocktail Enzyme Mix (ThermoFisher, cat # AM2286) to the reverse transcription reaction.

Incubate the reaction for 10 minutes at 37° C in a thermal cycler.

Resuspend the AMPure XP beads (AXP) by vortexing.

Transfer the sample to a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Add 17 µl of resuspended AMPure XP beads (AXP) to the reaction and mix by flicking the tube.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 5 minutes at room temperature.

新鮮な80％エタノールをヌクレアーゼフリー水で500μl用意します。

Spin down the sample and pellet on a magnet. Keep the tube on the magnet, and pipette off the supernatant.

Keep the tubes on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.

前のステップを繰り返します。

スピンダウンし、チューブをマグネットの上に戻します。残ったエタノールをピペットで取り除きます。ペレットを30 秒間程乾かします。 ただし、 ペレットにひびが入るまでは乾燥させないでください。

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 20 µl nuclease-free water.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Briefly spin down the tube and pellet the beads on the magnet until the eluate is clear and colourless, for at least 1 minute.

Remove and retain 20 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Prepare the following reaction in a 0.2 ml thin-walled PCR tube:

Reagent Volume
2x LongAmp Taq Master Mix 25 μl
PR2 Primer diluted to 10 μM 2 μl
Reverse-transcribed sample from above 20 μl
Nuclease-free water 3 μl
Total 50 μl

Incubate using the following protocol:

Cycle step Temperature Time No. of cycles
Denaturation 94 °C 1 mins 1
Annealing 50 °C 1 mins 1
Extension 65 °C 15 mins 1
Hold 4 °C ∞

Resuspend the AMPure XP beads (AXP) by vortexing.

Transfer the sample to a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Add 40 µl of resuspended AMPure XP beads (AXP) to the reaction and mix by flicking the tube.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 5 minutes at room temperature.

Prepare 500 μl of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

Spin down the sample and pellet on a magnet. Keep the tube on the magnet, and pipette off the supernatant.

Keep the tubes on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.

前のステップを繰り返します。

スピンダウンし、チューブをマグネットの上に戻します。残ったエタノールをピペットで取り除きます。ペレットを30 秒間程乾かします。 ただし、 ペレットにひびが入るまでは乾燥させないでください。

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 21 µl nuclease-free water.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Briefly spin down the tube and pellet the beads on the magnet until the eluate is clear and colourless, for at least 1 minute.

Remove and retain 21 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Analyse 1 µl of the strand-switched DNA for size, quantity and quality using an Agilent Bioanalyzer and Qubit fluorometer (or equivalent).

最終ステップ

Take forward the full volume of your sample into the cDNA repair and end-prep stage of the protocol.

Recovery aim for the samples after RNA degradation and second strand synthesis is 70–200 fmol (~70–200 ng if your sample is 1.5 kb).

6. cDNA repair and end-prep

材料
  • Strand-switched cDNA in 20 µl
  • AMPure XP Beads (AXP)
消耗品
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチューブ
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • NEBNext® Ultra II End Repair / dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
装置
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • Thermal cycler
  • 小型遠心機
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • マグネットラック
  • アイスバケツ（氷入り）
オプション装置
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）
重要

If you have prepared your own cDNA instead of performing reverse transcription using the method outlined in this protocol, start this step with 70–200 fmol cDNA (~70–200 ng if your sample is 1.5 kb) in 20 µl nuclease-free water.

Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Ensure the reagents are well mixed.
    Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.

Combine the following reagents in a 0.2 ml PCR tube:

Reagent Volume
cDNA sample 20 µl
Nuclease-free water 30 µl
Ultra II End-prep reaction buffer 7 µl
Ultra II End-prep enzyme mix 3 µl
Total 60 µl

反応液を完全に混合するために、ゆっくりとピペッティングし短時間スピンダウンして下さい。

サーマルサイクラーを使用して、初めに20℃で5分間インキュベートした後に、65℃で5分間インキュベートしてください。

AMPure XP ビーズ（AXP）をボルテックスで懸濁します。

DNA サンプルを清潔な 1.5 ml エッペンドルフ DNA LoBind チューブに移してください。

再懸濁したAMPure XP Beads (AXP) 60 µlをエンドプレップ反応に加え、チューブをフリッ クして混和します。

Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）で5分間インキュベートします（常温）。

新鮮な80％エタノールをヌクレアーゼフリー水で500μl用意します。

チューブをスピンダウンした後、マグネットラック上で、上清が無色透明になるまで置きます。チューブを磁石の上に置いたまま、上清をピペットで取り除いていきます。ピペットを使用してエタノールを除去し 、 廃棄してください。

チューブをマグネットの上に置き、ペレットを乱さないように、200 µl の新しく調製した 80% エタノールでビーズを洗浄します。

前のステップを繰り返します。

スピンダウンし、チューブをマグネットの上に戻します。残ったエタノールをピペットで取り除きます。ペレットを30 秒間程乾かします。 ただし、 ペレットにひびが入るまでは乾燥させないでください。

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 61 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

溶出液が無色透明になるまで、少なくとも1分間マグネット上でビーズをペレット化します。

Remove and retain 61 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Qubit蛍光光度計を使用して、溶出したサンプル1 µlを定量します。

最終ステップ

Take forward the 60 µl of repaired and end-prepped cDNA into the adapter ligation step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

7. Adapter ligation and clean-up

材料
  • Ligation Adapter (LA)
  • Ligation Buffer (LNB)
  • Short Fragment Buffer (SFB)
  • AMPure XP Beads (AXP)
  • Elution Buffer (EB)
消耗品
  • NEBNext® Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
装置
  • マグネットラック
  • 小型遠心機
  • ボルテックスミキサー
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）
重要

推奨の他社製リガーゼ（ligase）には専用のバッファーが付属していますが、Ligation Sequencing Kitに付属のLigation Buffer (LNB)を使用した方が、Ligation Adapter (LA)のライゲーション効率が高くなります。

重要

本キットおよびプロトコールに含まれるライゲーションアダプター（LA）は、他のシークエンシングアダプターとの互換性はありません。

Spin down the Ligation Adapter (LA) and Quick T4 Ligase, and place on ice.

ライゲーションバッファー(LNB)を室温で融解し、スピンダウンしてピペッティングで混合します。粘性が高い為、この緩衝液をボルテックスするのは効果的ではないです。解凍して混ぜたら、すぐに氷の上に置いてください。

溶出バッファー（EB）を室温で融解し、ボルテックスで混合します。その後、スピンダウンして氷の上に置きます。

Thaw the Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

In a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, mix in the following order:

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent Volume
cDNA sample from the previous step 60 µl
Ligation Adapter (LA) 5 µl
Ligation Buffer (LNB) 25 µl
NEBNext Quick T4 DNA Ligase 10 µl
Total 100 µl

反応液を完全に混合するために、ゆっくりとピペッティングし短時間スピンダウンして下さい。

反応液を室温で10分間インキュベートします。

AMPure XP ビーズ（AXP）をボルテックスで懸濁します。

再懸濁したAMPure XP Beads (AXP) 40 µlを加え、チューブをフリッ クして混和します。

Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）で5分間インキュベートします（常温）。

サンプルをスピンダウンし、マグネット上でペレット化します。チューブをマグネットの上に置き、無色透明になったら上清をピペットで取り除きます。

Wash the beads by adding 250 μl of Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.

Note: Take care when removing the supernatant, the viscosity of the buffer can contribute to loss of beads from the pellet.

前のステップを繰り返します。

スピンダウンし、チューブをマグネットの上に戻します。残った上清をピペットで取り除きます。ペレットを30 秒間程乾かします。 ただし、 ペレットにひびが入るまでは乾燥させないでください。

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 15 µl Elution Buffer (EB). Spin down and incubate for 10 minutes at room temperature.

溶出液が無色透明になるまで、少なくとも1分間マグネット上でビーズをペレット化します。

DNA ライブラリーを含む 15 µl の溶出液を取り出し、清潔な 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube に移し替えます。

ペレット化したビーズを廃棄します。

CHECKPOINT

Qubit蛍光光度計を使用して、溶出したサンプル1 µlを定量します。

Depending on your DNA library fragment size, prepare your final library in 12 µl of Elution Buffer (EB).

Fragment library length Flow cell loading amount
Very short (<1 kb) 100 fmol
Short (1-10 kb) 35–50 fmol
Long (>10 kb) 300 ng

Note: If the library yields are below the input recommendations, load the entire library.

If required, we recommend using a mass to mol calculator such as the NEB calculator.

重要

We recommend loading 35-50 fmol of this final prepared library onto the R10.4.1 flow cell.

This is to ensure high pore occupancy of >95% is reached. How to calculate pore occupancy can be found here.

最終ステップ

調製されたライブラリーは、フローセルへのロードに使用されます。ライブラリーは、ロードの準備ができるまで氷上、または4℃で保存して下さい。

ヒント

推奨のライブラリー保存方法

短期間の保存や繰り返し使用する場合は__（例　フローセルをウオッシュして再度ロードする場合）は、ライブラリーをEppendorf DNA LoBindチューブに入れ、__4℃で保存 することをお勧めします。 __3か月以上の長期保存の場合は、____ライブラリーをEppendorf DNA LoBindチューブに -80 ° Cで保存 することをお勧めします。

オプショナルステップ

If quantities allow, the library may be diluted in Elution Buffer (EB) for splitting across multiple flow cells.

Depending on how many flow cells the library will be split across, more Elution Buffer (EB) than what is supplied in the kit will be required.

8. MinIONおよびGridIONフローセルのプライミングとローディング

材料
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB)
  • Sequencing Buffer (SB)
消耗品
  • MinionとGridIONのFlow Cell
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
装置
  • MinIONかGridION のデバイス
  • MinIONとGridIONのFlow Cell ライトシールド
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
重要

注意：本キットはR10.4.1フローセル（FLO-MIN114）のみに対応しています。

ヒント

フローセルのプライミングとローディング

新規ユーザーは、 初回使用前に'Priming and loading your flow cell' のビデオをご覧いただくことをお勧めします。

Sequencing Buffer（SB）、Library Beads（LIB）またはLibrary Solution（LISを使用する場合のみ）、Flow Cell Tether（FCT）およびFlow Cell Flush（FCF）を室温で融解してから、ボルテックスで混合します。その後、スピンダウンして氷上で保存します。

重要

MinION R10.4.1フローセル（FLO-MIN114）での最適なシークエンス性能と出力向上のために、フローセルのプライミングミックスに最終濃度0.2 mg/mlでBovine Serum Albumin (BSA) を添加することを推奨します。

(注： その他のアルブミンの種類（組換えヒト血清アルブミンなど）の使用は推奨しません。

BSA入りのフローセルプライミングミックスを調製するには、Flow Cell Flush （FCF）とFlow Cell Tether（FCT）を以下の指示に従って組み合わせます。室温でピペッティングして混合します。

(注： キットの容器を変更している最中です。今までは実験の後に使い捨てるシングルユーズチューブを使用していましたが、バッファー単位のボトル容器に変更しています。お手持ちのキットの使用方法に従ってください。

シングルユースチューブの場合: 50 mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA）5 µlとFlow Cell Tether （FCT）30 µlをFlow Cell Flush （FCF）チューブに直接加えます。

ボトル容器の場合：: フローセルの数に適したチューブに以下の試薬を組み合わせます。

試薬 １フローセルあたりの容量
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
合計 1,205 µl

MinIONまたはGridIONデバイスの蓋を開け、フローセルをクリップの下にスライドさせます。 フローセルをしっかりと押さえ、サーマルプレートと電気接触が密着しているかを確認してください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b_JP

オプショナルステップ

ライブラリーをロードする前にフローセルチェックを行い、使用可能なポアの数を把握して下さい。

フローセルが以前にチェックされている場合は、このステップを省略できます。

詳細については、MinKNOWプロトコルのフローセルチェックの手順 flow cell check instructionsを参照してください。

フローセルのプライミングポートカバーを時計方向にスライドさせ、プライミングポートを開きます。

Flow Cell Loading Diagrams Step 2_JP

重要

フローセルからバッファーを引き上げる際には注意してください。20～30μl以上は除去せず、ポアのアレイ全体が常にバッファーで覆われていることを確認して下さい。アレイに気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。

プライミングポートを開けた後に、カバーの下に小さな気泡がないかを確認して下さい。気泡を取り除くために少量の液を引き上げます。

  1. P1000ピペットを200 µ Lに設定して下さい。
  2. ピペットの先端をプライミングポートに差し込みます。
  3. 目盛りが220-230 ulと表示されるまでダイヤルを回して、20-30 ulを吸い上げるか、少量のバッファーがピペットの先端に入るのが見えるまでダイヤルを回します。

(注： プライミングポートからセンサーアレイ全体にバッファーがあることを確認してください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5_JP

気泡が混入しないように、プライミングポートからフローセルにプライミングミックスを800µl注入し、 5分間待ちます。この５分間の間に、以下の手順でライブラリーをロードする準備をして下さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5_JP

Library Beads(LIB)の液をピペッティングすることで十分に混合して下さい。

重要

Library Beads（LIB）チューブにはビーズの懸濁液が入っています。このビーズはすぐに沈殿するので、使用直前に混合することが重要です。

ほとんどのシークエンシング実験には、Library Beads （LIB）を使用することをお勧めします。しかし、より粘性の高いライブラリーをご使用の場合はLibrary Solution （LIS）の使用をお勧めします。

新しい1.5mlのEppendorf DNA LoBindチューブにてライブラリーをロードする準備をします。（詳細は以下に記載されています。）

試薬 １フローセルあたりの容量
Sequencing Buffer (SB) 37.5 µl
Library Beads （LIB）またはLibrary Solution（LIS）（使用する場合）は、使用直前に混合して下さい。 25.5 µl
DNA library 12 µl
合計 75 µl

フローセルのプライミングを完了させます。

  1. SpotON サンプルポートカバーをゆっくりと持ち上げ、SpotON サンプルポートにアクセスできるようにします。
  2. 200μlのプライミングミックスをフローセルのプライミングポート（SpotONサンプルポートではありません）に気泡が入らないように注入します。

Flow Cell Loading Diagrams Step 5_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5_JP

調製したライブラリーは、ロードする直前にピペッティング混合して下さい。

調製したライブラリー75μlをSpotONサンプルポートからフローセルに滴下します。次の一滴を追加する前に各一滴がポートに入っていることを確認して下さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 07 V5_JP

SpotONサンプルポートカバーをゆっくりと元に戻し、バング（カバーの先）がSpotONポートに入ることを確認し、プライミングポートを閉じます。

Step 8 update_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 9_JP

重要

最適なシークエンス出力を得るために、ライブラリーがロードされたすぐにライトシールドをフローセルに取り付けてください。

ライブラリーがフローセル上にある状態では（ウォッシングやリロードのステップを含める）、フローセルにライトシールドを付けたままにしておくことを推奨します。ライトシールドは、ライブラリーがフローセルから除去された時点で取り外すことができます。

ライトシールドを以下のようにフローセルに設置して下さい。

  1. ライトシールドの先端を慎重にクリップに当てます。 (注： ライトシールドをクリップの下に無理に押し込まないでください。

  2. ライトシールドをフローセルにゆっくりと下ろします。ライトシールドは、フローセルの上部全体を覆うようにSpotONカバーの周囲に取り付けます。

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised-Japanese step10

注意

MinIONフローセルライトシールドは、フローセルに固定されていないため、取り付け後の取り扱いには注意が必要です。

最終ステップ

デバイスの蓋を閉め、MinKNOWでシークエンスランをセットします。

9. Data acquisition and basecalling

Overview of nanopore data analysis

For a full overview of nanopore data analysis, which includes options for basecalling and post-basecalling analysis, please refer to the Data Analysis document.

How to start sequencing

The sequencing device control, data acquisition and real-time basecalling are carried out by the MinKNOW software. Please ensure MinKNOW is installed on your computer or device. There are multiple options for how to carry out sequencing:

1. Data acquisition and basecalling in real-time using MinKNOW on a computer

Follow the instructions in the MinKNOW protocol beginning from the "Starting a sequencing run" section until the end of the "Completing a MinKNOW run" section.

2. Data acquisition and basecalling in real-time using the MinION Mk1B/Mk1D device

Follow the instructions in the MinION Mk1B user manual or the MinION Mk1D user manual.

3. Data acquisition and basecalling in real-time using the MinION Mk1C device

Follow the instructions in the MinION Mk1C user manual.

4. Data acquisition and basecalling in real-time using the GridION device

Follow the instructions in the GridION user manual.

5. Data acquisition and basecalling in real-time using the PromethION device

Follow the instructions in the PromethION user manual or the PromethION 2 Solo user manual.

6. Data acquisition using MinKNOW on a computer and basecalling at a later time using MinKNOW

Follow the instructions in the MinKNOW protocol beginning from the "Starting a sequencing run" section until the end of the "Completing a MinKNOW run" section. When setting your experiment parameters, set the Basecalling tab to OFF. After the sequencing experiment has completed, follow the instructions in the Post-run analysis section of the MinKNOW protocol.

10. Downstream analysis

注意

Data ananlysis for the Ligation sequencing V14 - Direct cDNA sequencing (SQK-LSK114) is currently incompatible with the default setup for wf-transcriptomes.

Data ananlysis for the Ligation sequencing V14 - Direct cDNA sequencing (SQK-LSK114) is currently incompatible with the default setup for wf-transcriptomes. Pychopper currently miss-classsifies The reads generated with Direct cDNA Sequencing are not being classified correctly in the analysis workflow, leading to ≥80% data loss of full-read transcripts following analysis with wf-transcriptomes.

Note: Experienced users may be able to disable Pychopper during wf-transcriptomes analysis setup to circumvent this issue using the infomation available in the wf-transcriptomes GitHub page and the Pychopper GitHub page. Please note that deviating from the standard analysis settings can result in changes to the analysis output.

ベースコール後の分析

ベースコールされたデータをさらに解析するには、いくつかの方法があります。

1. EPI2ME workflows

詳細なデータ解析のために、オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズは、EPI2MEで利用可能な様々なバイオインフォマティクスのチュートリアルとワークフローを提供しています。このプラットフォームでは、研究チームとアプリケーションチームがGitHubに保存しているワークフローを記載しています。このプラットフォーム内にはバイオインフォマティクスのコードと説明をしているコメント、およびサンプルデータを使ってコードを試すことが出来ます。

2. 研究分析ツール

Oxford Nanopore Technologiesの研究部門では、Oxford Nanopore GitHub repositoryで多数の分析ツールを公開しています。これらのツールは上級ユーザー向けであり、ソフトウェアのインストールと実行方法の説明が含まれています。これらのツールは最低限のサポートしかしていません。

3. コミュニティーで開発されたツール

研究課題に適したデータ解析方法が上記のリソースのいずれにも記載されていない場合は、 resource centre を参照し、アプリケーションに適したバイオインフォマティクスツールを検索してください。 Nanoporeコミュニティーの多くのメンバーが、 ナノポアシークエンシングデータを解析するための独自のツールやパイプラインを開発しており、そのほとんどはGitHubで利用可能です。これらのツールはOxford Nanopore Technologiesではサポート対象外であり、最新のケミストリーやソフトウェア構成との互換性を保証するものではありませんのでご了承ください。

11. フローセルの再利用と返却

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

シークエンス実験終了後、フローセルを再利用する場合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコールに従い、洗浄したフローセルを2～8℃で保管してください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティーで入手できます。

ヒント

運転を停止したらできるだけ早くフローセルをウォッシュすることをお勧めします。しかし、これが不可能な場合はフローセルをデバイスに入れたまま、翌日にウォッシュをして下さい。

または、返送手順に従って、オックスフォード・ナノポアに返送してください。

フローセルの返却方法は hereをご覧ください。

(注： 製品を返却する前に、すべてのフローセルを脱イオン水で洗浄する必要があります。

重要

シークエンシング実験に関して問題が発生した場合や質問がある場合には、このプロトコルのオンライン版にあるトラブルシューティングガイドを参照してください。

12. DNA/RNA抽出、およびライブラリ調製時の問題点

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

サンプルの品質が低い

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
DNAの純度が低い（DNAのOD 260/280のナノドロップ測定値が1.8未満およびOD 260/230が2.0～2.2未満） DNA抽出で必要な純度が得られていない 夾雑物の影響は、 Contaminants に示されています。コンタミネーションをもたらさないために別の抽出方法extraction method をお試しください。.

追加のSPRIクリーンアップステップの実施を検討して下さい。
低いRNA インテグリティー（RNA Integrity Number: <9.5 RIN、またはrRNAバンドがゲル上でスメアになっている） 抽出中にRNAが分解された 別のRNA抽出方法 RNA extraction methodを試してください。RINの詳細については、 RNA Integrity Number の資料を参照してください。詳細については、 DNA/RNA Handling のページをご覧ください。
RNAのフラグメントが予想より短い 抽出中にRNAが分解された 別のRNA抽出方法 RNA extraction methodを試してください。 RINの詳細については、 RNA Integrity Number の資料を参照してください。詳細については、DNA/RNA Handling のページをご覧ください。

RNAを扱う際には、RNaseフリーの環境で作業し、実験器具もRNaseフリーにしておくことをお勧めします。

AMPureビーズクリーンアップ後のDNA回収率が低い

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
低回収率 AMPureビーズとサンプルの比率が予想していたのよりも低いことによるDNAの損失 1. AMPureビーズはすぐに沈降するため、サンプルに添加する前によく再懸濁させてください。

2. AMPureビーズ対サンプル比が0.4:1未満の場合、どのようなサイズのDNA断片でもクリーンアップ中に失われます。
低回収率 DNA断片が予想よりも短い サンプルに対するAMPureビーズの比率が低いほど、短い断片に対する選択が厳しくなります。 アガロースゲル(または他のゲル電気泳動法)上でインプットDNAの長さを設定してから、使用するAMPureビーズの適切な量を計算してください。 SPRI cleanup
エンドプレップ後の収率が低い 洗浄ステップで使用したエタノール濃度が低い（70%未満）。 エタノールが70%未満の場合、DNAは洗浄中にビーズから溶出されます。必ず正しい濃度（％）のエタノールを使用してください。

13. Issues during the sequencing run

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

シークエンス開始時のポアがフローセルチェック後よりも少ない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ナノポアアレイに気泡が入ってしまった。 フローセルチェックをした後、フローセルをプライミングする前に、プライミングポート付近の気泡を取り除くことが必要です。 気泡を取り除かないと、気泡がナノポアアレイに移動し、空気に触れたたナノポアが不可逆的なダメージを負った可能性がある。これを防ぐための最適な方法が、 this videoで紹介されています。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 フローセルがデバイスに正しく挿入されていない。 シークエンスランを停止し、フローセルをシークエンス装置から取り出します。次に再度フローセルを挿入し、装置にしっかりと固定され、目標温度に達していることを確認します。GridIONやPromethIONの場合は別のフローセルの位置をお試しください。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ライブラリー内の汚染物質がポアを失活させたり塞いだりしている。 フローセルチェックの際のポア数は、フローセル保存バッファー中のQC用のDNA分子を用いて計測されます。シークエンシングの開始時は、ライブラリ自体を使用してアクティブなポア数を推定します。このため、フローセルチェックとRun開始時のポア数は、約10％程度の変動が起こります。シークエンシング開始時に報告されたポアの数が大幅に減少している場合は、ライブラリー中の汚染物質がメンブレンを損傷していたり、ポアをブロックしている可能性があります。インプット材料の純度を向上させるために、別のDNA/RNA抽出または精製方法が必要となる場合があります。コンタミネーションの影響は、Contaminants Know-how pieceを参照にして下さい。夾雑物を除去するために別の抽出方法extraction method をお試しください。

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
MinKNOW に 「Script failed」と表示されている"
コンピューターを再起動し、MinKNOWを再起動します。問題が解決しない場合は MinKNOW log files MinKNOWログファイルを収集し 、テクニカルサポートにご連絡ください。他のシークエンシングデバイスをお持ちでない場合は、 フローセルとロードしたライブラリーを4℃で保管することをお勧めします。詳細な保管方法については、テクニカルサポートにお問い合わせください。

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the sequencing kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents.
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FLT/FCT tube). Make sure FLT/FCT was added to FB/FCF before priming.

予想より短いリード長

問題点 予想される原因 解決策とコメント
予想より短いリード長 DNAサンプルの不要な断片化 読み取り長はサンプルDNA断片の長さを反映します。サンプルDNAは、抽出およびライブラリー調製中の操作で断片化した可能性があります。

1. 抽出の最適な方法については、Extraction Methods の抽出方法を参照してください。

2. ライブラリー調製に進む前に、アガロースゲル電気泳動で、サンプルDNAのフラグメント長の分布を確認してください。 DNA gel2 上の画像では、サンプル1は高分子量ですが、サンプル2は断片化されています。

3. ライブラリー調製中は、試薬を混合するためのピペッティングやボルテックス操作は、プロトコルで指示がないかぎり行わないでください。

利用できないポアの割合が多い場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
利用できないポアの割合が大きい（チャンネルパネルとポアのアクティブポートで青く表示されています）

image2022-3-25 10-43-25 上のアクティブなポアの図は、時間の経過とともに「利用できない」ポアの割合が増加していることを示しています。		 サンプル内に不純物が含まれている 一部のポアに吸着する不純物は、MinKNOWに組み込まれたポアのブロック解除機能によって、ポアから除去することができます。 このステップが完了すると、ポアの状態が「sequencing pore」に戻ります。利用できないポアの部分が多いか、増加した場合:

1.Flow Cell Wash Kit nuclease flush using the Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) を用いて、ヌクレアーゼ洗浄を 行うことができます。又は
2. PCRを数サイクル実行してサンプルDNAの量を増やし、サンプルDNAに含まれる問題の不純物が相対的に減る（希釈される）ようにします。

Inactiveのポアの割合が高い

問題点 予想される原因 解決策とコメント
利用できない(inactive/unavailable)ポアの割合が高い（チャネルパネルとポアアクティブポートでは水色で表示されています）ポアまたは膜に損傷が起きてしまった。 気泡がフローセルに混入した。 フローセルのプライミングやライブラリーのロードで気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。 推奨の操作方法については、Priming and loading your flow cell のビデオをご覧ください。
利用できないポアの割合が多い場合 サンプルDNAに含まれる不純物 既知の化合物問題で、サンプルDNAに多糖類が含まれた事で、植物のゲノムDNAと結合しポアをブロックした。

1. 植物葉DNA抽出法 Plant leaf DNA extraction methodをご参照ください。
2. QIAGEN PowerClean Pro キットを使用してクリーンアップして下さい。
3. QIAGEN REPLI-g kit.キットを使用して、元のgDNAサンプルで全ゲノム増幅を実行します。
利用できないポアの割合が多い場合 サンプル内に不純物が含まれている 不純物の影響は、 Contaminants の ノウハウを参照して下さい。 サンプルDNAに不純物を残留させないために別の抽出方法をお試しください。

Reduction in sequencing speed and q-score later into the run

Observation Possible cause Comments and actions
Reduction in sequencing speed and q-score later into the run For Kit 9 chemistry (e.g. SQK-LSK109), fast fuel consumption is typically seen when the flow cell is overloaded with library (please see the appropriate protocol for your DNA library to see the recommendation). Add more fuel to the flow cell by following the instructions in the MinKNOW protocol. In future experiments, load lower amounts of library to the flow cell.

温度変動

問題点 予想される原因 解決策とコメント
温度変動 フローセルとデバイスの接続が途切れている。 フローセルの背面にある金属プレートを覆っているヒートパッドがあることを確認してください。 フローセルを再度挿入し、コネクターピンがデバイスにしっかりと接触していることを確認するために軽く押してください。問題が解決しない場合は、テクニカルサービスにご連絡してください。

目標温度に到達しない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目標温度に達しなかった)と表示する。" 装置が通常の室温より低い場所、または風通しの悪い場所（排気が出来ない場所）に置かれた時にフローセルが過熱してします。 MinKNOWでは、フローセルが目標温度に到達するまでの既定の時間枠があります。時間枠を超えると、エラーメッセージが表示され、シークエンシング実験が続行されます。しかし、不適切な温度でシークエンスを行うと、スループットが低下し、qスコアが低下する可能性があります。シークエンシングデバイスが風通しの良い室温に置かれていることを確認して、MinKNOW再スタートしてください。MinION Mk 1Bの温度制御の詳細については、FAQ を参照してください。

Guppy – no input .fast5 was found or basecalled

Observation Possible cause Comments and actions
No input .fast5 was found or basecalled input_path did not point to the .fast5 file location The --input_path has to be followed by the full file path to the .fast5 files to be basecalled, and the location has to be accessible either locally or remotely through SSH.
No input .fast5 was found or basecalled The .fast5 files were in a subfolder at the input_path location To allow Guppy to look into subfolders, add the --recursive flag to the command

Guppy – no Pass or Fail folders were generated after basecalling

Observation Possible cause Comments and actions
No Pass or Fail folders were generated after basecalling The --qscore_filtering flag was not included in the command The --qscore_filtering flag enables filtering of reads into Pass and Fail folders inside the output folder, based on their strand q-score. When performing live basecalling in MinKNOW, a q-score of 7 (corresponding to a basecall accuracy of ~80%) is used to separate reads into Pass and Fail folders.

Guppy – unusually slow processing on a GPU computer

Observation Possible cause Comments and actions
Unusually slow processing on a GPU computer The --device flag wasn't included in the command The --device flag specifies a GPU device to use for accelerate basecalling. If not included in the command, GPU will not be used. GPUs are counted from zero. An example is --device cuda:0 cuda:1, when 2 GPUs are specified to use by the Guppy command.

Last updated: 12/12/2024

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