Ligation sequencing V14 — Human cfDNA multiplex (SQK-NBD114.24)

Oxford Nanopore Technologies
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PromethION: Protocol

Ligation sequencing V14 — Human cfDNA multiplex (SQK-NBD114.24) V CFM_9208_v114_revD_20Nov2024

Method outlining sample extraction, library preparation, sequencing and data analysis. This protocol:

  • uses human cfDNA
  • enables multiplexing of 12 samples
  • is compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

Method outlining sample extraction, library preparation, sequencing and data analysis. This protocol:

  • uses human cfDNA
  • enables multiplexing of 12 samples
  • is compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: CFM_9208_v114_revD_20Nov2024

1. Overview of the protocol

Introduction to the multiplex human cfDNA sequencing protocol

This protocol describes how to carry out preparation and sequencing of 12 human cell-free DNA (cfDNA) samples using the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24). Typically, we obtain ~3 Gb of aligned data (1x coverage) for each of the 12 human cfDNA samples processed with this protocol.

Please note: This method has been developed for multiplexing 12 samples. We do not recommend deviating from the outlined method.
Reducing the number of samples multiplexed may lead to an increase in coverage, but increasing the number of samples multiplexed will lead to a reduction in coverage of aligned data per sample.

Prior to library preparation, the sample extraction is carried out using the QIAGEN QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit and following our Human blood cell-free DNA (cfDNA) extraction for multiplex sequencing method.

Note: We recommend that blood samples are processed while fresh, as we have observed potential gDNA contamination arising from blood that has been stored in certain types of collection tubes.

For more information on the development and performance of this method, please refer to our Updated method for cell-free DNA (cfDNA) methylation profiling know-how document. An additional know-how document is also available for the optimisation of library preparation for longer cell-free DNA (cfDNA).

Steps in the workflow

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Sample preparation

Using the outlined extraction method, extract the cfDNA from your human blood samples, and quantify the DNA:


Library preparation

The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and optional stopping points.

Library preparation Process Time Stop option
DNA repair and end-prep Repair the cfDNA and prepare the DNA ends for adapter attachment 125 minutes 4°C overnight
Native barcode ligation Ligate the native barcodes to the DNA ends 60 minutes 4°C overnight
Adapter ligation and clean-up Attach the sequencing adapters to the DNA ends 50 minutes 4°C short-term storage or for repeated use, such as re-loading your flow cell
-80°C for single-use, long-term storage.
We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software which will collect raw data from the device and basecall reads.
  • (Optional) Raw sequencing data can be basecalled and aligned to a reference using dorado.
  • (Optional) Start the EPI2ME software and select a bioinformatics workflow to analyse your data. Alternatively, external tools can be used to further analyse and explore your data.
IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

Material
  • (FOR EXTRACTION) ≥3.5 ml blood in EDTA K2 vacuum tube or ≥1ml plasma, per sample
  • (FOR LIBRARY PREPARATION) ≥6 ng of recovered human cfDNA per sample
  • Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
Consumibles
  • Celda de flujo PromethION
  • QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit (QIAGEN, 55284)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module (NEB, E7360)
  • NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (NEB E7546) (Módulo de reparación de extremos/Adición de dA)
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056) (Módulo de ligación rápida)
  • Ethanol, 100% (e.g. Fisher, 16606002)
  • Isopropanol
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • 5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 15 ml Falcon tubes
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
  • PromethION device
  • PromethION Flow Cell Light Shield
  • Centrifuge with capacity for 5 ml and 15 ml tubes, and a swing out and fixed angle rotors
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Magnetic rack for 15 ml tubes
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Thermomixer, or other shaker for microcentrifuge tubes, with capacity to heat at 56°C
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Termociclador
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Cubeta con hielo
  • Temporizador
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
IMPORTANTE

The above list of materials, consumables, and equipment is for the extraction method in the sample preparation section, as well as the library preparation section of the protocol. If you have pre-extracted sample(s), you will only require the materials for the library preparation section of this protocol.

This protocol has been developed to process and sequence 12 samples. The following inputs are required:

Input requirements per sample for the extraction method:

  • ≥3.5 ml of fresh blood in EDTA K2 vacuum tube or ≥1ml plasma, per sample

Note: We recommend that blood samples are processed while fresh, as we have observed potential gDNA contamination arising from blood that has been stored in certain types of collection tubes.

Input requirements per sample for the library preparation:

  • Use ≥6 ng of recovered cfDNA, per sample as input. Inputs should be normalised so the same mass of sample is used in each reaction.

Note: This method has been developed for multiplexing 12 samples. We do not recommend deviating from the outlined method.

Cantidad de muestra inicial de ADN

Cómo realizar un control de calidad del ADN de la muestra inicial

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

Reactivos de otros fabricantes

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000
IMPORTANTE

We do not recommend mixing barcoded libraries with non-barcoded libraries prior to sequencing.

IMPORTANTE

The Native Adapter (NA) included in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) contents

Note: We are in the process of reformatting the barcodes provided in this kit into a plate format. This will reduce plastic waste and will facilitate automated applications.

Plate format

SQK-NBD114.24 plate format

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
DNA Control Sample DCS Yellow 2 35
Native Adapter NA Green 1 40
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Elution Buffer EB Black 2 500
AMPure XP Beads AXP Clear cap, light teal label 1 6,000
Long Fragment Buffer LFB Orange 1 1,800
Short Fragment Buffer SFB Clear 1 1,800
EDTA EDTA Blue 1 700
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200
Native Barcode plate NB01-24 - 2 plates, 3 sets of barcodes per plate 5 µl per well

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.


Vial format

SQK-NBD114.24 bottle format

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
Native Barcodes NB01-24 Clear 24 (one per barcode) 20
DNA Control Sample DCS Yellow 2 35
Native Adapter NA Green 1 40
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Elution Buffer EB Black 2 500
AMPure XP Beads AXP Clear cap, light teal label 1 6,000
Long Fragment Buffer LFB Orange 1 1,800
Short Fragment Buffer SFB Clear 1 1,800
EDTA EDTA Blue 1 700
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.

3. Sample extraction method for multiplex sequencing of human cfDNA

Material
  • ≥3.5 ml fresh human blood in EDTA K2 vacuum tube or ≥1ml plasma, per sample
Consumibles
  • QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit (QIAGEN, 55284)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • Ethanol, 100% (e.g. Fisher, 16606002)
  • Isopropanol
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat # AM9937)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • 5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 15 ml Falcon tubes
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
Instrumental
  • Centrifuge with capacity for 5 ml and 15 ml tubes, and a swing out and fixed angle rotors
  • Microfuge
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Magnetic rack for 15 ml tubes
  • Magnetic rack
  • Mezclador vórtex
  • P1000 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P100
  • Termociclador
  • Ice bucket with ice
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Equipo opcional
  • Agilent Femto Pulse System (or equivalent for read length QC)

Optimised extraction: Human blood cell-free DNA (cfDNA) extraction for multiplex sequencing

This extraction method can also be found in the Extraction Protocols tab in the Documentation space on the Nanopore Community: Human blood cell-free DNA (cfDNA) extraction for multiplex sequencing.

These instructions describe a method to extract cell-free DNA (cfDNA) from 12 human blood samples collected in EDTA K2 vacuum tubes (step 1), or human plasma (step 3). The extraction is performed using the QIAGEN QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit.

Note: The yield, DIN and sequencing read length of extracted DNA may vary depending on initial sample quality. Please ensure you are following the correct method and using high-quality sample inputs.

MEDIDA OPCIONAL

Alternatively, if you have previously extracted and stored your cfDNA sample(s), this can be used directly in the Library preparation section of this protocol.

IMPORTANTE

We recommend that blood samples are processed while fresh, as we have observed potential gDNA contamination arising from blood that has been stored in certain types of collection tubes.

Preparation of plasma from fresh blood

Centrifuge ≥3.5 ml of fresh blood (overnight chilled delivery) in the EDTA K2 vacuum tube at 1900 x g for 10 minutes at 4°C in a swing out rotor centrifuge.

Pipette and transfer the supernatant (this is the plasma fraction) to a fresh 5 ml DNA LoBind Eppendorf tube.

We recommend a minimum plasma volume of 1 ml is used, although volumes up to 4 ml have been validated.

To remove residual cells from the plasma, centrifuge the plasma at 16,000 x g for 10 minutes (or 6,000 x g for 30 minutes depending on the spin capacity of the centrifuge) at 4°C, in a fixed angle rotor.

IMPORTANTE

It is important to remove residual cells from the sample when the blood/plasma is still fresh (from an overnight chilled delivery). Failing to do so will result in increased amounts of gDNA contamination in the sequencing library.

Aspirate the supernatant and transfer it to a fresh 15 ml tube.

Purification of cfDNA from 1–5 ml serum or plasma Using the QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit

Before starting the extraction:

  • Prepare a shaker for microcentrifuge tubes at room temperature for use in step 14.
  • Preheat a second shaker at 56°C for use in step 26. (Alternatively, equilibrate the first shaker to 56°C after step 14).
  • Resuspend Magnetic Bead Suspension (from the QIAGEN QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit) by pulse-vortexing for 1 min.
    Note: Do not let the suspension settle for more than 2 min before use. Pipette from the centre of the suspension.

Prepare the buffers for extraction:

  • Add 8 ml isopropanol (100%) to 12 ml Buffer ACB concentrate to obtain 20 ml Buffer ACB. Mix well after adding isopropanol.
  • Add 30 ml ethanol (96–100%) to 13 ml Buffer ACW2 concentrate to obtain 43 ml Buffer ACW2. Mix well after adding ethanol.

Mix the following components according to the instructions below in a 15 ml tube:

Component Volume for 1 ml plasma (µl) Volume for 2 ml plasma (µl) Volume for 3 ml plasma (µl) Volume for 4 ml plasma (µl) Volume for 5 ml plasma (µl)
Plasma 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000
Magnetic Bead Suspension 30 60 90 120 150
Proteinase K 55 110 165 220 275
Bead Binding Buffer 150 300 450 600 750
Total volume 1,235 2,470 3,705 4,940 6,175

Incubate the reaction for 10 min at room temperature while shaking (at a slow speed) end-over-end.

Spin the tube down briefly (30 seconds at 200 x g) to remove any solution in the cap.

Place the tube containing bead solution into a magnetic rack for 15 ml tubes. Let the tube stand for at least 1 min, until the solution is clear.

Remove and discard supernatant.

Remove the tube from the magnetic rack and add 200 µl of Bead Elution Buffer to the bead pellet. Vortex to resuspend beads, and pipette up and down to mix and rinse residual beads from the tube wall.

Transfer the full volume of mixture (including the beads) into a Bead Elution Tube.

Incubate for 5 min on a shaker for microcentrifuge tubes at room temperature and 300 rpm.

Note: If the same shaker for microcentrifuge tubes is to be used in step 26, remove the tubes after the room temperature incubation and equilibrate the shaker to 56°C

Place the Bead Elution Tube containing the bead solution into a magnetic rack for 2 ml tubes. Let the tube stand for at least 1 min, until the solution is clear.

Transfer the supernatant into a new Bead Elution tube. Discard the bead pellet.

Avoid transferring any magnetic beads in this step. Carryover may result in reduced cfDNA yield.

Add 300 µl Buffer ACB to the Bead Elution tube containing the supernatant, and vortex to mix. Briefly centrifuge the tube to remove drops from inside the lid.

Pipet the supernatant–Buffer ACB mixture from the previous step into a QIAamp UCP MinElute column.

Centrifuge for 1 min at 6,000 x g.

Place the QIAamp UCP MinElute column into a clean 2 ml collection tube, and discard the flow-through.

Add 500 µl Buffer ACW2 to the QIAamp UCP MinElute column.

Centrifuge for 1 min at 6,000 x g.

Place the QIAamp UCP MinElute column into a clean 2 ml collection tube, and discard the flow-through.

Centrifuge the QIAamp UCP MinElute column at 20,000 x g for 3 min.

Place the QIAamp UCP MinElute column into a new 1.5 ml elution tube and discard the 2 ml collection tube.

Open the lid of the tube and incubate the assembly in a shaker for microcentrifuge tubes at 56°C for 3 min to dry the membrane completely.

Carefully pipet 23 µl of ultra-clean water into the centre of the membrane. Close the lid and incubate at room temperature for 1 min.

Centrifuge at 20,000 x g for 1 min to elute the DNA.

To maximise yield from the elution: Place the QIAamp UCP MinElute column in a clean 1.5 ml elution tube. Aspirate the eluate from the previous step and reload it onto the centre of the membrane. Close the lid and incubate 1 min at room temperature.

Centrifuge at 20,000 x g for 1 min to elute the DNA.

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

From 1 ml of plasma, you can expect a yield of ≥ 6 ng cfDNA.

MEDIDA OPCIONAL

We recommend that the fragment length profiles of extracted cfDNA samples are analysed using a Femto Pulse (Agilent), or equivalent:

Frag length femtopulse cfDNA singleplex extract

Fragment length profile of extracted cfDNA, run on a Femto Pule (Agilent). This example shows the characteristic nucleosome peaks with minimal gDNA contamination.

FIN DEL PROCESO

Take forward ≥6 ng of recovered cfDNA, for each of the 12 samples, to the library preparation stage of the protcol.

4. Reparación del ADN y preparación de los extremos (2)

Material
  • ≥6 ng of recovered human cfDNA per sample (12 samples)
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
Consumibles
  • NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module (NEB, E7360)
  • NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB E7546)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P10
  • Microcentrífuga
  • Termociclador
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Gradilla magnética
  • Cubeta con hielo
Equipo opcional
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Preparar los reactivos NEBNext FFPE DNA Repair Mix y NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module siguiendo las instrucciones del fabricante y poner en hielo. (1)

Para obtener un rendimiento óptimo, NEB recomienda lo siguiente:

  1. Descongelar todos los reactivos en hielo.

  2. Golpear suavemente los tubos de reactivos con el índice o invertirlos, para asegurarse de que estén bien mezclados.
    Nota: No mezclar en vórtex las mezclas FFPE DNA Repair Mix, ni Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Centrifugar los tubos antes de abrirlos.

  4. Los tampones Ultra II End Prep Buffer y FFPE DNA Repair Buffer pueden tener un poco de precipitado. Dejar que la mezcla alcance la temperatura ambiente y mezclar pipeteando varias veces para romper el precipitado; para solubilizarlo, agitar el tubo en vórtex durante 30 s.
    Nota: Es importante mezclar bien los tampones mediante vórtex.

  5. El tampón FFPE DNA Repair Buffer puede tener un matiz amarillo; no importa si está así; se puede utilizar.

Use ≥6 ng of recovered cfDNA, per sample as input. Inputs should be normalised so the same mass of sample is used in each reaction.

Preparación del ADN en agua sin nucleasas: (2)

  1. Transferir 1 μg (o 100-200 fmol) de muestra de ADN a un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.

  2. Ajustar el volumen a un total de 47 μl con agua sin nucleasas.

  3. Mezclar minuciosamente con la pipeta o golpear el tubo suavemente con el índice.

  4. Centrifugar brevemente

En un tubo de PCR de pared fina (0,2 ml), mezclar lo siguiente: (2)

Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.

Reactivo Volumen
ADN del paso anterior 47 µl
(opcional) DNA Control Sample (DCS) 1 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer 3,5 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix 2 µl
Ultra II End-prep Reaction Buffer 3,5 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
Total 60 µl

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.

Using a thermal cycler with a heated lid set to 50°C, incubate the reaction at 37°C for 15 minutes and hold at 4°C.

Remove the reaction from the thermal cycler and place the tube on ice.

Keeping the tubes on ice, add 0.9 µl of NEBNext Thermolabile Proteinase K directly to each of the repaired reaction mixtures.

Mix by pipetting 10 times, followed by spinning down quickly to collect all liquid from the sides of the tube.

Using a thermal cycler with a heated lid set to 75°C, incubate at 37°C for 15 minutes and 65°C for 5 minutes, then hold at 4°C.

Remove the reaction from the thermal cycler and place the tube on ice.

Keeping the tube on ice, add 1.3 µl of NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix directly to the reaction mixture for a total volume of 26.1 µl.

Mix by pipetting 10 times, followed by spinning down quickly to collect all liquid from the sides of the tube.

Using a thermal cycler with a heated lid set to 75°C, incubate at 20°C for 30 minutes and 65°C for 30 minutes, then hold at 4°C.

Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.

Transferir la muestra de ADN a un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml. (1)

Add 80 µl of resuspended the AMPure XP Beads (AXP) to each end-prep reaction and mix by flicking the tube.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Prepare 5 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

Note: Ensure you prepare sufficient 80% ethanol for your 12 samples.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 61 µl de agua sin nucleasas. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente. (1)

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 61 µl de eluido y guardar en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml. (1)

Note: Ensure your samples are processed separately. At this stage they are not yet barcoded.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit. (2)

Note: You should expect to recover approximately 75% of your input mass. For example, from 6 ng of cfDNA, a yield of approximately 4.5 ng is expected.

FIN DEL PROCESO

Una vez el ADN está reparado y con los extremos preparados, se puede proceder a la ligación del adaptador. En este punto, también se puede guardar la muestra a 4 ⁰C hasta el día siguiente. (2)

5. Native barcode ligation

Material
  • Native Barcodes (NB01-24)
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
  • EDTA (EDTA)
Consumibles
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Eppendorf™, cat # 0030129504) with heat seals
  • OR 0.2 ml thin-walled PCR tubes
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32851)
Instrumental
  • Gradilla magnética
  • Mezclador vórtex
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Microfuge
  • Termociclador
  • Cubeta con hielo
  • Multichannel pipette and tips
  • Pipeta y puntas P1000
  • P200 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • P2 pipette and tips
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Prepare the NEB Blunt/TA Ligase Master Mix according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes.

Thaw the EDTA at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

Thaw the Native Barcodes (NB01-24) at room temperature. Briefly spin down, individually mix the barcodes required for your number of samples by pipetting, and place them on ice.

IMPORTANTE

Sample inputs should be normalised so the same mass of sample is used in each reaction.

Use the Qubit quantification results from the end of the "DNA repair and end-prep" stage of this protocol to ensure you are taking forward an equivalent mass for each sample.

Normalise and prepare your end-prepped cfDNA samples in nuclease-free water:

Inputs should be normalised so the same mass of sample is used in each reaction.

  1. For each sample, take forward an equivalent mass of sample into a separate clean 0.2 ml thin-walled PCR tube.
    Note: To take forward the maximum amount of DNA possible, we recommend taking the full volume of your lowest concentration sample and normalising the other samples to to this.

  2. Adjust the volume of each sample to 7.5 μl with nuclease-free water.

  3. Mix thoroughly by pipetting up and down, or by flicking the tube(s).

  4. Spin down briefly in a microfuge.

Select a unique barcode for each sample to be run together on the same flow cell. 12 samples should be barcoded and combined in one experiment.

Please note: Only use one barcode per sample.

In the 0.2 ml PCR-tubes containing your normalised sample inputs, add the reagents in the following order for each sample:

Reagent Volume
End-prepped DNA 7.5 µl
Native Barcode (NB01-24) 2.5 µl
Blunt/TA Ligase Master Mix 10 µl
Total 20 µl

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.

Incubate for 20 minutes at room temperature.

Add the following volume of EDTA to each well and mix thoroughly by pipetting and spin down briefly.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

EDTA cap colour Volume per well
For clear cap EDTA 2 µl
For blue cap EDTA 4 µl
CONSEJO

EDTA is added at this step to stop the reaction.

Pool all the barcoded samples in a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

. For 12 samples
Total volume for preps using clear cap EDTA 264 µl
Total volume for preps using blue cap EDTA 288 µl
CONSEJO

We recommend checking the base of your tubes/plate are all the same volume before pooling and after to ensure all the liquid has been taken forward.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

Add 1.2X AMPure XP Beads (AXP) to the pooled reaction, and mix by pipetting.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

. For 12 samples
Volume of AXP for preps using clear cap EDTA 317 µl
Volume of AXP for preps using blue cap EDTA 346 µl

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Prepare 2 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

Spin down the sample and pellet on a magnet for 5 minutes. Keep the tube on the magnetic rack until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnetic rack and wash the beads with 700 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.

Repetir el paso anterior.

Spin down and place the tube back on the magnetic rack. Pipette off any residual ethanol. Allow the pellet to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 32 µl nuclease-free water by gently flicking.

Incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.

Pellet the beads on a magnetic rack until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 32 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit. (1)

Note: You should expect to recover between 40–60 % of the input DNA mass. For example, if starting with 6 ng per sample and using 12x barcodes (72 ng total), a yield of approximately 30–40 ng, is expected.

FIN DEL PROCESO

Take forward the barcoded DNA library to the adapter ligation and clean-up step. However, you may store the sample at 4°C overnight.

6. Adapter ligation and clean-up

Material
  • Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
  • Elution Buffer (EB)
  • Native Adapter (NA)
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
Consumibles
  • NEBNext® Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32851)
Instrumental
  • Microcentrífuga
  • Gradilla magnética
  • Mezclador vórtex
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Termociclador
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Ice bucket with ice
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
IMPORTANTE

The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Prepare the NEBNext Quick Ligation Reaction Module according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes. Note: Do NOT vortex the Quick T4 DNA Ligase.

The NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5x) may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for several seconds to ensure the reagent is thoroughly mixed.

IMPORTANTE

Do not vortex the Quick T4 DNA Ligase.

Spin down the Native Adapter (NA) and Quick T4 DNA Ligase, pipette mix and place on ice.

Thaw the Elution Buffer (EB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

Thaw the Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

In a 1.5 ml Eppendorf LoBind tube, mix in the following order:

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent Volume
Pooled barcoded sample 30 µl
Native Adapter (NA) 5 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5X) 10 µl
Quick T4 DNA Ligase 5 µl
Total 50 µl

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.

Incubate the reaction for 20 minutes at room temperature.

IMPORTANTE

The next clean-up step uses Short Fragment Buffer (SFB) rather than 80% ethanol to wash the beads. The use of ethanol will be detrimental to the sequencing reaction.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

Add 60 µl (1.2x) of resuspended AMPure XP Beads (AXP) to the reaction and mix by pipetting.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Spin down the sample and pellet on the magnetic rack. Keep the tube on the magnet and pipette off the supernatant.

Wash the beads by adding 250 μl of Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.

Note: Take care when removing the supernatant, the viscosity of the buffer can contribute to loss of beads from the pellet.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 33 µl of Elution Buffer (EB).

Spin down and incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Remove and retain 33 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Dispose of the pelleted beads

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit. (1)

Note: You should expect to recover approximately 20% of input mass. For example, if starting with 6 ng per sample and using 12x barcodes (72 ng total), a yield of approximately 15 ng is expected.

FIN DEL PROCESO

La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo o a 4 °C hasta el momento de cargar.

CONSEJO

Recomendaciones de guardado de la biblioteca

Se recomienda guardar las bibliotecas en tubos Eppendorf DNA LoBind a 4 ⁰C, durante periodos de tiempo cortos o en caso de uso repetido, por ejemplo, para recargar celdas de flujo entre lavados. Para uso individual y para conservar a largo plazo por periodos de más de 3 meses, se recomienda guardar las bibliotecas a -80 ⁰C en tubos Eppendorf DNA LoBind.

7. Priming and loading the PromethION Flow Cell

Material
  • Sequencing Buffer (SB)
  • Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
  • Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
  • Flow Cell Flush (FCF)
Consumibles
  • Celda de flujo PromethION
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
  • PromethION 2 Solo device
  • Dispositivo PromethION 24/48
  • PromethION Flow Cell Light Shield
  • P1000 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P20
IMPORTANTE

This method is only compatible with R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M).

Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo. (1)

To prepare the flow cell priming mix, combine Flow Cell Tether (FCT) and Flow Cell Flush (FCF), as directed below. Mix by vortexing at room temperature.

Note: We are in the process of reformatting our kits with single-use tubes into a bottle format. Please follow the instructions for your kit format.

Single-use tubes format: Add 30 µl Flow Cell Tether (FCT) directly to a tube of Flow Cell Flush (FCF).

Bottle format: In a clean suitable tube for the number of flow cells, combine the following reagents:

Reagent Volume per flow cell
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Total volume 1,200 µl
IMPORTANTE

Una vez sacadas de la nevera, esperar 20 minutos antes de insertar las celdas de flujo en el dispositivo y así darles tiempo a que estén a temperatura ambiente. En entornos húmedos se puede formar condensación. Inspeccione las clavijas doradas del conector, situadas en la parte superior e inferior de la celda de flujo, en busca de condensación y si la hubiera, límpiela con una toallita sin pelusa. Procure que la almohadilla térmica (color gris oscuro) esté enganchada en la parte posterior.

For PromethION 2 Solo, load the flow cell(s) as follows:

  1. Place the flow cell flat on the metal plate.

  2. Slide the flow cell into the docking port until the gold pins or green board cannot be seen.

J2068 FC-into-P2-animation V5

For the PromethION 24/48, load the flow cell(s) into the docking ports:

  1. Line up the flow cell with the connector horizontally and vertically before smoothly inserting into position.
  2. Press down firmly onto the flow cell and ensure the latch engages and clicks into place.

Step 1a V3

Step 1B

IMPORTANTE

Insertion of the flow cells at the wrong angle can cause damage to the pins on the PromethION and affect your sequencing results. If you find the pins on a PromethION position are damaged, please contact support@nanoporetech.com for assistance.

Screenshot 2021-04-08 at 12.08.37

Slide the inlet port cover clockwise to open.

Prom loading 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

After opening the inlet port, draw back a small volume to remove any air bubbles:

  1. Set a P1000 pipette tip to 200 µl.
  2. Insert the tip into the inlet port.
  3. Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, or until you see a small volume of buffer entering the pipette tip.

Step 3 v1

Load 500 µl of the priming mix into the flow cell via the inlet port, avoiding the introduction of air bubbles. Wait five minutes. During this time, prepare the library for loading using the next steps in the protocol.

Step 4 v1

Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).

IMPORTANTE

Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.

En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.

In a new 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare the library for loading as follows:

Reagent Volume per flow cell
Sequencing Buffer (SB) 100 µl
Library Beads (LIB) thoroughly mixed before use 68 µl
DNA library 32 µl
Total 200 µl

Note: The prepared library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice or at 4°C until ready to load.

Complete the flow cell priming by slowly loading 500 µl of the priming mix into the inlet port.

Step 5 v1

Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.

Load 200 µl of library into the inlet port using a P1000 pipette.

Step 6 v1

Close the valve to seal the inlet port.

Step 7 V2

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

If the light shield has been removed from the flow cell, install the light shield as follows:

  1. Align the inlet port cut out of the light shield with the inlet port cover on the flow cell. The leading edge of the light shield should sit above the flow cell ID.
  2. Firmly press the light shield around the inlet port cover. The inlet port clip will click into place underneath the inlet port cover.

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8a FAW

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8b FAW

FIN DEL PROCESO

Close the PromethION lid when ready to start a sequencing run on MinKNOW.

Wait a minimum of 10 minutes after loading the flow cells onto the PromethION before initiating any experiments. This will help to increase the sequencing output.

8. Data acquisition and basecalling

IMPORTANTE

Ensure you are using the most recent version of MinKNOW.

We recommend updating MinKNOW to the latest version prior to starting a sequencing run for the best sequencing results.

For more information on updating MinKNOW, please refer to our MinKNOW protocol.

How to start sequencing

Once you have loaded your flow cell, the sequencing run can be started on MinKNOW, our sequencing software that controls the device, data acquisition and real-time basecalling.

Please ensure MinKNOW is installed on your computer or device. Further instructions for setting up a sequencing run can be found in the MinKNOW protocol.

Please ensure when setting up a sequencing run you are using the recommendations outlined below. All other parameters can be left to their default settings.

MinKNOW can be used and set up to sequence in multiple ways:

  • On a computer either direcly or remotely connected to a sequencing device.
  • Directly on a PromethION 24/48 sequencing device.

For more information on using MinKNOW on a sequencing device, please see the device user manuals:

Open the MinKNOW software using the desktop shortcut and log into the MinKNOW software using your Community credentials.

Click on your connected device.

prom 48

Set up a sequencing run by clicking Start sequencing.

Edit 1

Type in the experiment name, select the flow cell postition and enter sample ID. Choose FLO-PRO114M flow cell type from the drop-down menu.

Click Continue to kit selection.

Flow cell selection

Select the Native Barcoding Sequencing Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24).

An expansion kit does not need to be selected.

Click Continue to Run Options to continue.

Kit selection NBD114 24 cfDNA Multiplex

Set the run options to a 72 hour run length and 20 bp minimum read length.

Click Continue to basecalling to continue.

Set the run options to a 72 hour run length and 20 bp minimum read length cfDNA multiplex

Set up basecalling using the following parameters:

  1. Ensure the basecalling is switched ON.
  2. Next to "Models", click Edit options and choose High accuracy basecaller (HAC) from the drop-down menu.
  3. Ensure barcoding is ON.

Click Continue to output and continue.

Set up basecalling using the following parameters multiplex

Keep the output format and filtering options to their default settings.

Click Continue to final review to continue.

Keep the output format and filtering options to their default settings multiplex

Click Start to start sequencing.

You will be automatically navigated to the Sequencing Overview page to monitor the sequencing run.

Click Start to start sequencing multiplex

Data analysis after sequencing

After sequencing has completed on MinKNOW, the flow cell can be reused or returned, as outlined in the Flow cell reuse and returns section.

After sequencing and basecalling, the data can be analysed, as outlined in the Downstream analysis section.

9. Análisis posterior (2)

Bioinformatics analysis

If basecalling is not performed during live sequencing, raw sequencing data (.POD5 format) can be processed post-sequencing.

This can be achieved using the tool Dorado, which enables basecalling and subsequent alignment to a reference genome.

Dorado can also detect modified bases by using the modified-bases option (e.g. --modified-bases 5mCG_5hmCG). This will integrate methylation tags directly into the aligned BAM file. We also recommend applying a minimum QScore cutoff (--min-Qscore <min_QScore>), which serves as a quality control measure to ensure only high-quality reads are used in downstream processes.


1. The command below demonstrates how to initiate basecalling with Dorado, followed by sorting, and indexing the output using Samtools. Please see the Dorado documentation here for further details. 

Dorado basecaller <model> <input_POD5> --reference <REF> --min-qscore <min_QScore> 
| samtools sort -o <OUTPUT_BAM> - && samtools index <OUTPUT_BAM>

For example to SUP basecall with 5mCG and 5hmCG detected in CpG context, and with a QScore filter of 10 we can use: 

Dorado basecaller sup --modified-bases 5mCG_5hmCG input.pod5 --reference ref.fasta --min-qscore 10 
| samtools sort -o output.bam > - && samtools index output.bam

2. It is also recommended to remove reads that have a poor alignment score i.e. 10. This can be achieved as follows: 

samtools view -q <min_map_q> -bh -o <OUTPUT_BAM> <INPUT_BAM> && samtools index -@ <threads> <OUTPUT_BAM>

3. The output from Dorado basecaller can be demultiplexed into per-barcode BAMs using Dorado demux. E.g. 

Dorado demux --output-dir <output-dir> --no-classify <input-bam>

4. You may optionally omit methylation information from read ends using modkit adjust-mods or modkit tools with --edge-filter option. This may help increase methylation call precision, as the very end of reads, approximately 27 bases, may suffer from loss in methylated bases due to the chemistry used to repair ends in library preparation (see our know-how document for further details). 

modkit adjust-mods --edge-filter 0 27 <IN_BAM> <OUTPUT_BAM>

The modified .bam file can be used with external tools that use a .bam file as input for further data analysis and exploration.

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:

1. Flujos de trabajo de EPI2ME

A fin de realizar un análisis en profundidad de los datos, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales sobre bioinformática y flujos de trabajo, que están disponibles en EPI2ME. La plataforma proporciona un espacio donde los flujos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis para la investigación

Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y flujos de trabajo bioinformáticos, disponibles en EPI2ME Labs, que encontrará en la sección del mismo nombre de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los proyectos que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte el centro de recursos Resource Centre y busque herramientas bioinformáticas para su aplicación. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/programas informáticos.

10. Reutilización y devolución de celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a entre 2 °C y 8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

11. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <70 % Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

12. Problemas durante el experimento de secuenciación

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Ocupación de poro por debajo del 40 %

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación de poro <40 % No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo Procure cargar la biblioteca al volumen y la concentración adecuados, tal como se indica en el protocolo correspondiente. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular fmoles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, (opción "dsDNA: μg to fmol").
Ocupación de poro próxima a 0 Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN En la fase de ligación del adaptador, utilice NEBNext Quick Ligation Module (E6056) y el tampón Ligation Buffer (LNB) de Oxford Nanopore Technologies, suministrado en el kit de secuenciación. Recuerde añadir la cantidad correcta de cada reactivo. Prepare una biblioteca de control con lambda para valorar la integridad de los reactivos de otros fabricantes.
Ocupación de poro próxima a 0 Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y en la fase de lavado, después de la ligación del adaptador, se utilizó etanol en lugar de Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB). El etanol puede desnaturalizar la proteína motor en los adaptadores de secuenciación. Usar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) después de la ligación de los adaptadores.
Ocupación de poro próxima a 0 No hay anclaje en la celda de flujo Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (Flush Tether (FLT) para los kits 9, 10 y 11, y Flow Cell Tether (FCT) para el kit 14). Asegurarse de añadir un anclaje —Flush Tether (FLT) o Flow Cell Tether (FCT)— al tampón antes del cebado; el tampón utilizado es Flush Buffer (FB) para los kits 9, 10 y 11 y Flow cell Flush (FCF) para el Kit 14.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones:

1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Fluctuación de la temperatura

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace.

Last updated: 11/15/2024

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