Direct RNA sequencing (SQK-RNA004)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Direct RNA sequencing (SQK-RNA004) V DRS_9195_v4_revF_11Dec2024

This protocol:

  • is for sequencing native RNA.
  • can use total RNA or an enriched sample (e.g. poly(A)+ or ribodepleted) as starting input material.
  • requires no fragmentation.
  • takes ~2 hours for library preparation.

For Research Use Only

This is an Early Access product.

For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

FOR RESEARCH USE ONLY

概要

This protocol:

  • is for sequencing native RNA.
  • can use total RNA or an enriched sample (e.g. poly(A)+ or ribodepleted) as starting input material.
  • requires no fragmentation.
  • takes ~2 hours for library preparation.

For Research Use Only

This is an Early Access product.

For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

Document version: DRS_9195_v4_revF_11Dec2024

1. Overview of the protocol

重要

This is an Early Access product

For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

Please ensure you always use the most recent version of the protocol.

Direct RNA Sequencing Kit features

This kit is highly recommended for users who:

  • are exploring attributes of native RNA such as modified bases.
  • would like to remove RT or PCR bias.
  • have transcripts that are difficult to reverse transcribe.

Introduction to the Direct RNA Sequencing protocol

This protocol describes how to carry out sequencing of native RNA using the Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004). Starting from either poly(A) tailed RNA or total RNA, a second complementary cDNA strand is synthesised for stability by reverse transcription. Sequencing adapters are then attached to the RNA-cDNA hybrid for sequencing on either MinION or PromethION RNA Flow Cells (FLO-MIN004RA / FLO-PRO004RA respectively). Please note, the complementary cDNA strand is not sequenced, but improves the RNA sequencing output.

It is recommend that a control experiment using the RNA Control Strand (RCS) is completed first to become familiar with the technology.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your RNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell(s) to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and stopping points.

Library preparation Process Time Stop option
Reverse transcription Synthesise the complementary strand of the RNA ~85 minutes At this stage the RT-RNA can be stored at -80°C for later use.

Please note, this is the only pause point in this protocol.
Adapter ligation and clean-up Attach the sequencing adapters to the RNA-cDNA hybrid ends 45 minutes Attach sequencing adapters to the ends of the RNA-cDNA hybrid.

We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes

Direct RNA004 workflow resize

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and basecall the reads.
重要

Unlike DNA, RNA is translocated through the nanopore in the 3'-5' direction. However, the basecalling algorithms automatically flip the data, and the reads are displayed 5'-3'.

重要

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

材料
  • 300 ng of poly(A) tailed RNA or 1 µg of total RNA in 8 µl
  • Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004)
消耗品
  • Induro® Reverse Transcriptase (NEB, M0681)
  • 10 mM dNTP solution (e.g. NEB, cat # N0447)
  • NEBNext® Quick Ligation Reaction Buffer (NEB, B6058)
  • T4 DNA Ligase 2M U/ml (NEB, cat # M0202M)
  • Murine RNase Inhibitor (NEB, M0314)
  • Agencourt RNAClean XP beads (Beckman Coulter™, cat # A63987)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチューブ
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit RNA HS Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q32852)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q32851)
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • 1.5 mlエッペンドルフチューブに最適のマグネット式ラック
  • 小型遠心機
  • ボルテックスミキサー
  • アイスバケツ（氷入り）
  • タイマー
  • Thermal cycler
  • Qubit fluorometer (or equivalent for QC check)
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットとチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 ピペットとチップ
  • Eppendorf 5424 centrifuge (or equivalent)

For this protocol, you will need 300 ng of poly(A) tailed RNA or 1 µg of total RNA in 8 µl.

It is possible to start the protocol from a lower sample input, however this will likely yield a lower output.

Please refer to the following input titration graphs for guidance:

Poly(A) tailed RNA

Input titration RNA004 Poly A

Total RNA

Input titration RNA004 Total

Input RNA

It is important that the input RNA meets the quantity and quality requirements. Using too little or too much RNA, or RNA of poor quality (e.g. fragmented or containing chemical contaminants) can affect your library preparation.

For instructions on how to perform quality control of your RNA sample, please read the Input DNA/RNA QC protocol.

For further information on using RNA as input, please read the links below.

These documents can also be found in the DNA/RNA Handling page.

サードパーティー試薬

このプロトコールで使用されているすべてのサードパーティー試薬は、当社が検証し、使用を推奨しているものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以外の試薬を用いたテストは行っていません。

すべてのサードパーティ製試薬については、製造元の指示に従って使用の準備をすることをお勧めします。

フローセルのチェックをしてください (1)

シークエンシング実験を開始する前に、フローセルのポアの数を確認することを強くお勧めします。このフローセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの場合は代理店への到着から１２週間以内に行ってください。またはFlongle Flow Cellの場合は代理店への到着から4週間以内に行う必要があります。Oxford Nanopore Technologiesは、フローセルチェックの実施から2日以内に結果が報告され、推奨される保管方法に従っていた場合に、以下の表に記載されているナノポアの有効数に満たさない場合には、フローセルを交換します。 フローセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指示に従ってください。

Flow cell 保証する最小有効ポア数（以下の数未満のフローセルが交換対象となります）
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000

Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004) contents:

Note: We have increased the concentration of the RNA CS (RCS) vials found in newer batches of SQK-RNA004. Please ensure you are following the correct method and inputs for your RCS concentration:

Batch RNA004.20.xxxx or older Batch RNA004.30.0001 or newer
Lower concentration of the RNA CS (RCS) vial:

15 ng/µl		 Increased concentration of the RNA CS (RCS) vial:

50 ng/µl

SQK-RNA004 tubes LH edit

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (μl)
RT Adapter RTA Blue 1 10
RNA Ligation Adapter RLA Green 1 45
RNA CS RCS Yellow 1 25
Wash Buffer WSB Orange 2 1,200
RNA Elution Buffer REB Black 1 300
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Sequencing Buffer SB Red 1 700
RNA Flush Tether RFT Pink 1 200
Flow Cell Flush FCF White 1 8,000

Note: The RNA CS (RCS) is the calibration strand and contains the Enolase II from YHR174W, extracted from the yeast saccharomyces cerevisiae. The reference FASTA files for the yeast is available here.

3. Library preparation

材料
  • 300 ng of poly(A) tailed RNA or 1 µg of total RNA in 8 µl
  • RT Adapter (RTA)
  • RNA CS (RCS)
  • Wash Buffer (WSB)
  • RNA Ligation Adapter (RLA)
  • RNA Elution Buffer (REB)
消耗品
  • Agencourt RNAClean XP beads (Beckman Coulter™, cat # A63987)
  • Induro Reverse Transcriptase and 5 Induro RT Reaction Buffer (NEB, M0681)
  • 10 mM dNTP solution (e.g. NEB, cat # N0447)
  • NEBNext® Quick Ligation Reaction Buffer (NEB, B6058)
  • T4 DNA Ligase 2M U/ml (NEB, cat # M0202M)
  • Murine RNase Inhibitor (NEB, M0314)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチューブ
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
  • Qubit RNA HS Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q32852)
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • Thermal cycler
  • Magnetic rack
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）
  • Ice bucket with ice
  • P1000 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • P100 pipette and tips
  • P20 pipette and tips
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 pipette and tips

Prepare the NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer and T4 DNA Ligase according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes. Note: Do NOT vortex the T4 DNA Ligase.

The NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for several seconds to ensure the reagent is thoroughly mixed.

重要

We do not recommend using the Quick T4 Ligase for this protocol. We have found that the T4 DNA Ligase (2M U/ml - NEB M0202M) works better. It needs to be used in combination with the Quick Ligation Reaction Buffer (NEB B6058).

Spin down the RT Adapter (RTA), RNA CS (RCS) (if using), and RNA Ligation Adapter (RLA), pipette mix and place on ice.

Thaw the Wash Buffer (WSB) and RNA Elution Buffer (REB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

Prepare the RNA in nuclease-free water:

  • Transfer 300 ng of poly(A) tailed RNA or 1 µg of total RNA into a 0.2 ml thin-walled PCR tube.
  • Adjust the volume to 8 μl with nuclease-free water.
  • Mix thoroughly by flicking the tube to avoid unwanted shearing.
  • Spin down briefly in a microfuge.
オプショナルステップ

The use of the RNA CS (RCS) in this preparation is an optional control measure for library preparation QC and troubleshooting.

We recommend the inclusion of the RNA CS (RCS) in the library preparation for troubleshooting purposes.

However, if users chose to not use the RNA CS (RCS) input, replace the volume in the reaction with nuclease-free water.


Please note: This method differs slightly depending on the concentration of RNA CS (RCS) in your kit. Please ensure you are following the correct method and inputs for your RNA CS (RCS) concentration:

We have increased the concentration of the RNA CS (RCS) vials found in newer batches of SQK-RNA004 and EXP-RCS001.

Batch RNA004.20.xxxx or older Batch RNA004.30.0001 or newer
Lower concentration of the RNA CS (RCS) vial:

15 ng/µl		 Increased concentration of the RNA CS (RCS) vial:

50 ng/µl

Batch RCS001.10.xxxx or older Batch RCS001.20.0001 or newer
Lower concentration of the RNA CS (RCS) vial:

15 ng/µl		 Increased concentration of the RNA CS (RCS) vial:

50 ng/µl

Prepare the RT Adapter (RTA) reaction as follows:

For higher concentration RNA CS (RCS): kit batch RNA004.30.0001 or newer:

1. In a separate clean 0.2 ml thin-walled PCR tube, dilute the RNA CS (RCS) input as follows:

Reagent Volume
RNA CS (RCS) 1 µl
Nuclease-free water 2 µl
Total 3 µl

2. Ensure the sample is thoroughly mixed by pipette mixing 10 times.

3. In the 0.2 ml thin-walled PCR tube containing your RNA sample, combine the reagents in the following order:

Reagent Volume
RNA from previous step 8 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer 3 µl
Diluted RNA CS (RCS) 0.5 µl
Murine RNase Inhibitor 1 µl
RT Adapter (RTA) 1 µl
T4 DNA Ligase 1.5 µl
Total 15 µl

For lower concentration RNA CS (RCS): kit batch RNA004.20.xxxx or older

1. In the 0.2 ml thin-walled PCR tube containing your RNA sample, combine the reagents in the following order:

Reagent Volume
RNA 8 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer 3 µl
RNA CS (RCS) 0.5 µl
Murine RNase Inhibitor 1 µl
RT Adapter (RTA) 1 µl
T4 DNA Ligase 1.5 µl
Total 15 µl

Mix by pipetting and spin down.

Incubate the reaction for 10 minutes at room temperature.

In a clean 1.5 ml DNA LoBind Eppendorf tube, combine the following reagents together to make the reverse transcription master mix:

Reagent Volume
Nuclease-free water 13 µl
10 mM dNTPs 2 µl
5x Induro RT reaction buffer 8 µl
Total 23 µl

Transfer the reverse transcriptase master mix to the 0.2 ml PCR tube containing your adapter-ligated RNA and mix by pipetting.

Add 2 µl of Induro Reverse Transcriptase to the reaction and mix by pipetting.

Place the tube in a thermal cycler and incubate at 60°C for 30 minutes, then 70°C for 10 minutes, and bring the sample to 4°C before proceeding to the next step.

Transfer the sample to a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Resuspend the stock of Agencourt RNAClean XP beads by vortexing.

Add 72 µl of resuspended Agencourt RNAClean XP beads to the reverse transcription reaction and mix by pipetting.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 5 minutes at room temperature.

Prepare 200 μl of fresh 70% ethanol in nuclease-free water.

サンプルをスピンダウンし、マグネット上でペレット化します。チューブをマグネットの上に置き、無色透明になったら上清をピペットで取り除きます。

Keeping the tube on magnet, wash the beads with 150 µl of freshly prepared 70% ethanol, as described below:

  1. Add 150 µl of freshly prepared 70% ethanol to the tube and ensure the beads are pelleted on one side of the tube.
  2. Keeping the magnetic rack on the benchtop, rotate the tube by 180°. Wait for the beads to migrate towards the magnet and to form a pellet.
  3. Rotate the tube 180° again (back to the starting position), and wait for the beads to pellet again.

Carefully remove the 70% ethanol using a pipette and discard.

Spin down and place the tube back on the magnet until the eluate is clear and colourless. Keep the tube(s) on the magnet and pipette off any residual ethanol.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 23 µl nuclease-free water. Incubate for 5 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 23 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

オプショナルステップ

At this stage the RT-RNA sample can be stored at -80°C for later use.

Please note, this is the only pause point in this protocol.

In the same 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, combine the reagents in the following order:

Reagent Volume
RT-RNA sample 23 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer 8 µl
RNA Ligation Adapter (RLA) 6 µl
T4 DNA Ligase 3 µl
Total 40 µl

Mix by pipetting.

Incubate the reaction for 10 minutes at room temperature.

Resuspend the stock of Agencourt RNAClean XP beads by vortexing.

Add 16 µl of resuspended Agencourt RNAClean XP beads to the reaction and mix by pipetting.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 5 minutes at room temperature.

Spin down the sample and pellet on a magnet. Keep the tube on the magnet for 5 minutes, and pipette off the supernatant when clear and colourless.

Add 150 μl of the Wash Buffer (WSB) to the beads. Close the tube lid and resuspend the beads by flicking the tube. Return the tube to the magnetic rack, allow the beads to pellet for 5 minutes and pipette off the supernatant when clear and colourless.

前のステップを繰り返します。

重要

Agitating the beads results in a more efficient removal of free adapter, compared to adding the wash buffer and immediately aspirating.

Spin down the tube and replace onto the magnetic rack until the beads have pelleted to pipette off any remaining Wash Buffer (WSB).

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 13 µl RNA Elution Buffer (REB) by the gently flicking the tube. Incubate for 10 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet for 5 minutes until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 13 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Quantify 1 µl of reverse-transcribed and adapted RNA using the Qubit fluorometer DNA HS assay.

The recovery aim in the final eluate is > 30 ng.

Recovery quantities can vary between different inputs and library preparations. However, we always recommend taking forward the full volume of RNA library for the best sequencing results.

最終ステップ

The reverse-transcribed and adapted RNA is now ready for loading into the flow cell.

重要

The RNA library must be sequenced immediately and cannot be stored for later use.

4. Priming and loading the MinION and GridION flow cell

材料
  • Library Solution (LIS)
  • Sequencing Buffer (SB)
  • RNA Flush Tether (RFT)
  • Flow Cell Flush (FCF)
消耗品
  • MinIONとGridIONのFlow Cell
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装置
  • MinIONかGridION のデバイス
  • MinIONとGridIONのFlow Cell ライトシールド
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
重要

Please note, this kit is only compatible with RNA flow cells (FLO-MIN004RA).

ヒント

フローセルのプライミングとローディング

新規ユーザーは、 初回使用前に'Priming and loading your flow cell' のビデオをご覧いただくことをお勧めします。

Thaw the Sequencing Buffer (SB), Library Solution (LIS), RNA Flush Tether (RFT) and Flow Cell Flush (FCF) at room temperature. Mix by vortexing and spin down.

To prepare the flow cell priming mix in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, combine the following reagents. Mix by vortexing and spin down at room temperature.

Reagent Volume per flow cell
RNA Flush Tether (RFT) 30 µl
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Total 1,200 µl

MinIONまたはGridIONデバイスの蓋を開け、フローセルをクリップの下にスライドさせます。 フローセルをしっかりと押さえ、サーマルプレートと電気接触が密着しているかを確認してください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b_JP

オプショナルステップ

ライブラリーをロードする前にフローセルチェックを行い、使用可能なポアの数を把握して下さい。

フローセルが以前にチェックされている場合は、このステップを省略できます。

詳細については、MinKNOWプロトコルのフローセルチェックの手順 flow cell check instructionsを参照してください。

フローセルのプライミングポートカバーを時計方向にスライドさせ、プライミングポートを開きます。

Flow Cell Loading Diagrams Step 2_JP

重要

フローセルからバッファーを引き上げる際には注意してください。20～30μl以上は除去せず、ポアのアレイ全体が常にバッファーで覆われていることを確認して下さい。アレイに気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。

プライミングポートを開けた後に、カバーの下に小さな気泡がないかを確認して下さい。気泡を取り除くために少量の液を引き上げます。

  1. P1000ピペットを200 µ Lに設定して下さい。
  2. ピペットの先端をプライミングポートに差し込みます。
  3. 目盛りが220-230 ulと表示されるまでダイヤルを回して、20-30 ulを吸い上げるか、少量のバッファーがピペットの先端に入るのが見えるまでダイヤルを回します。

(注： プライミングポートからセンサーアレイ全体にバッファーがあることを確認してください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5_JP

気泡が混入しないように、プライミングポートからフローセルにプライミングミックスを800µl注入し、 5分間待ちます。この５分間の間に、以下の手順でライブラリーをロードする準備をして下さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5_JP

In a new 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare the library for loading as follows:

Reagent Volume per flow cell
Sequencing Buffer (SB) 37.5 µl
Library Solution (LIS) 25.5 µl
RNA library 12 µl
Total 75 µl

フローセルのプライミングを完了させます。

  1. SpotON サンプルポートカバーをゆっくりと持ち上げ、SpotON サンプルポートにアクセスできるようにします。
  2. 200μlのプライミングミックスをフローセルのプライミングポート（SpotONサンプルポートではありません）に気泡が入らないように注入します。

Flow Cell Loading Diagrams Step 5_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5_JP

調製したライブラリーは、ロードする直前にピペッティング混合して下さい。

調製したライブラリー75μlをSpotONサンプルポートからフローセルに滴下します。次の一滴を追加する前に各一滴がポートに入っていることを確認して下さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 07 V5_JP

SpotONサンプルポートカバーをゆっくりと元に戻し、バング（カバーの先）がSpotONポートに入ることを確認し、プライミングポートを閉じます。

Step 8 update_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 9_JP

重要

最適なシークエンス出力を得るために、ライブラリーがロードされたすぐにライトシールドをフローセルに取り付けてください。

ライブラリーがフローセル上にある状態では（ウォッシングやリロードのステップを含める）、フローセルにライトシールドを付けたままにしておくことを推奨します。ライトシールドは、ライブラリーがフローセルから除去された時点で取り外すことができます。

ライトシールドを以下のようにフローセルに設置して下さい。

  1. ライトシールドの先端を慎重にクリップに当てます。 (注： ライトシールドをクリップの下に無理に押し込まないでください。

  2. ライトシールドをフローセルにゆっくりと下ろします。ライトシールドは、フローセルの上部全体を覆うようにSpotONカバーの周囲に取り付けます。

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised-Japanese step10

注意

MinIONフローセルライトシールドは、フローセルに固定されていないため、取り付け後の取り扱いには注意が必要です。

最終ステップ

デバイスの蓋を閉め、MinKNOWでシークエンスランをセットします。

5. Data acquisition and basecalling

シークエンスの開始方法

フローセルをロードしたら、MinKNOWでシークエンシングランを開始できます。MinKNOWは、装置、データ収集、リアルタイムベースコールを制御するシークエンスソフトウェアです。 MinKNOWの設定と使用の詳細については、MinKNOW Protocolを参照してください。

MinKNOWは、複数の方法でシークエンスの設定をすることができます。

  • シークエンシングデバイスに直接かリモートで接続されているコンピューター。
  • GridION、Minion Mk1C、またはPromethion 24/48シークエンシングデバイスで直接使用できます。

シークエンス装置でMinKNOWを使用する方法の詳細については、装置のユーザーマニュアルを参照してください。

MinKNOWでシークエンスランを開始するには、次の手順に従います。

1. スタートページに移動し、 Start sequencing をクリックします。

2. 名前、フローセルの位置、サンプルIDなどの実験の詳細を入力します。

3. キットのページで、ライブラリー調製に使用するシークエンシングキットを選択します。

4. シークエンスランのパラメータの変更を設定（ランオプションの変更など）するか、デフォルト設定のままにします。

(注： シークエンスランの設定時にベースコールがオフになっていた場合には、MinKNOWでポストラン・ベースコールを後日に実行することも出来ます。詳細については、MinKNOW protocolを参照してください。

5. Start をクリックしてシークエンスランを開始します。

シークエンシング後のデータ解析

MinKNOWでシークエンスが終わると、フローセルを再利用または返却ができます。詳しくは、フローセルの再利用と返却のセクションをご覧ください。

シークエンシングとベースコールの後にはデータを解析することができます。 ベースコールおよびベースコール後の解析オプションの詳細については、Data Analysis を参照してください。

ダウンストリーム解析セクションでは、データを解析するためのオプションの概要を説明しています。

6. Flow cell reuse and returns

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) or Flow Cell Wash Kit XL (EXP-WSH004-XL)
重要

Our Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004 or EXP-WSH004-XL) is compatible with RNA Flow Cells and the Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004).

However, please be aware that:

  • The wash kit doesn’t work as nuclease flush for Direct RNA sequencing: it won’t recover blocked pores.
  • It works as a flush to reload new sample: it will wash off most of the library from the array and remove all adapter from the remaining sample, preventing it from being captured and sequencing. This will allow subsequent library loads.

シークエンス実験終了後、フローセルを再利用する場合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコールに従い、洗浄したフローセルを2～8℃で保管してください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティーで入手できます。

ヒント

運転を停止したらできるだけ早くフローセルをウォッシュすることをお勧めします。しかし、これが不可能な場合はフローセルをデバイスに入れたまま、翌日にウォッシュをして下さい。

または、返送手順に従って、オックスフォード・ナノポアに返送してください。

フローセルの返却方法は hereをご覧ください。

(注： 製品を返却する前に、すべてのフローセルを脱イオン水で洗浄する必要があります。

重要

シークエンシング実験に関して問題が発生した場合や質問がある場合には、このプロトコルのオンライン版にあるトラブルシューティングガイドを参照してください。

7. Downstream analysis

Post-basecalling analysis

There are several options for further analysing your basecalled data:

1. EPI2ME workflows

For in-depth data analysis, Oxford Nanopore Technologies offers a range of bioinformatics tutorials and workflows available in EPI2ME. The platform provides a vehicle where workflows deposited in GitHub by our Research and Applications teams can be showcased with descriptive texts, functional bioinformatics code and example data.

2. Research analysis tools

Oxford Nanopore Technologies' Research division has created a number of analysis tools, which are available in the Oxford Nanopore GitHub repository. The tools are aimed at advanced users, and contain instructions for how to install and run the software. They are provided as-is, with minimal support.

3. Community-developed analysis tools

If a data analysis method for your research question is not provided in any of the resources above, please refer to the resource centre and search for bioinformatics tools for your application. Numerous members of the Nanopore Community have developed their own tools and pipelines for analysing nanopore sequencing data, most of which are available on GitHub. Please be aware that these tools are not supported by Oxford Nanopore Technologies, and are not guaranteed to be compatible with the latest chemistry/software configuration.

8. Issues during RNA extraction and library preparation

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

Low sample quality

Observation Possible cause Comments and actions
Low RNA integrity (RNA integrity number <9.5 RIN, or the rRNA band is shown as a smear on the gel) The RNA degraded during extraction Try a different RNA extraction method. For more info on RIN, please see the RNA Integrity Number document. Further information can be found in the DNA/RNA Handling page.
RNA has a shorter than expected fragment length The RNA degraded during extraction Try a different RNA extraction method. For more info on RIN, please see the RNA Integrity Number document. Further information can be found in the DNA/RNA Handling page.

We recommend working in an RNase-free environment, and to keep your lab equipment RNase-free when working with RNA.

9. Issues during an RNA sequencing run

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

Fewer pores at the start of sequencing than after Flow Cell Check

Observation Possible cause Comments and actions
MinKNOW reported a lower number of pores at the start of sequencing than the number reported by the Flow Cell Check An air bubble was introduced into the nanopore array After the Flow Cell Check it is essential to remove any air bubbles near the priming port before priming the flow cell. If not removed, the air bubble can travel to the nanopore array and irreversibly damage the nanopores that have been exposed to air. The best practice to prevent this from happening is demonstrated in this video.
MinKNOW reported a lower number of pores at the start of sequencing than the number reported by the Flow Cell Check The flow cell is not correctly inserted into the device Stop the sequencing run, remove the flow cell from the sequencing device and insert it again, checking that the flow cell is firmly seated in the device and that it has reached the target temperature. If applicable, try a different position on the device (GridION/PromethION).
MinKNOW reported a lower number of pores at the start of sequencing than the number reported by the Flow Cell Check Contaminations in the library damaged or blocked the pores The pore count during the Flow Cell Check is performed using the QC DNA molecules present in the flow cell storage buffer. At the start of sequencing, the library itself is used to estimate the number of active pores. Because of this, variability of about 10% in the number of pores is expected. A significantly lower pore count reported at the start of sequencing can be due to contaminants in the library that have damaged the membranes or blocked the pores. Alternative RNA extraction or purification methods may be needed to improve the purity of the input material. The effects of contaminants are shown in the Contaminants Know-how piece. Please try an alternative extraction method that does not result in contaminant carryover.

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
MinKNOW に 「Script failed」と表示されている"
コンピューターを再起動し、MinKNOWを再起動します。問題が解決しない場合は MinKNOW log files MinKNOWログファイルを収集し 、テクニカルサポートにご連絡ください。他のシークエンシングデバイスをお持ちでない場合は、 フローセルとロードしたライブラリーを4℃で保管することをお勧めします。詳細な保管方法については、テクニカルサポートにお問い合わせください。

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the NEBio Calculator, choosing "RNA ss: mass to moles"
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FCT tube). Make sure Flow Cell Tether (FCT) was added to Flow Cell Flush (FCF) before priming.

Large proportion of inactive pores

Observation Possible cause Comments and actions
Large proportion of inactive/unavailable pores (shown as light blue in the channels panel and pore activity plot. Pores or membranes are irreversibly damaged) Air bubbles have been introduced into the flow cell Air bubbles introduced through flow cell priming and library loading can irreversibly damage the pores. Watch the Priming and loading your flow cell video for best practice
Large proportion of inactive/unavailable pores Contaminants are present in the sample The effects of contaminants are shown in the Contaminants Know-how piece. Please try an alternative extraction method that does not result in contaminant carryover.

温度変動

問題点 予想される原因 解決策とコメント
温度変動 フローセルとデバイスの接続が途切れている。 フローセルの背面にある金属プレートを覆っているヒートパッドがあることを確認してください。 フローセルを再度挿入し、コネクターピンがデバイスにしっかりと接触していることを確認するために軽く押してください。問題が解決しない場合は、テクニカルサービスにご連絡してください。

目標温度に到達しない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目標温度に達しなかった)と表示する。" 装置が通常の室温より低い場所、または風通しの悪い場所（排気が出来ない場所）に置かれた時にフローセルが過熱してします。 MinKNOWでは、フローセルが目標温度に到達するまでの既定の時間枠があります。時間枠を超えると、エラーメッセージが表示され、シークエンシング実験が続行されます。しかし、不適切な温度でシークエンスを行うと、スループットが低下し、qスコアが低下する可能性があります。シークエンシングデバイスが風通しの良い室温に置かれていることを確認して、MinKNOW再スタートしてください。MinION Mk 1Bの温度制御の詳細については、FAQ を参照してください。

Last updated: 12/14/2024

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