Secuenciación directa de ARN (SQK-RNA004)
MinION: Protocol
Secuenciación directa de ARN (SQK-RNA004) V DRS_9195_v4_revF_11Dec2024
Este protocolo:
- sirve para secuenciar ARN natural.
- puede utilizarse con ARN total o una muestra enriquecida —por ejemplo, poli(A) o reducción de ARNr—, como material de entrada inicial.
- no precisa fragmentación
- se tardan 2 horas ~ en preparar la biblioteca.
De uso exclusivo en investigación
Este es un producto de acceso anticipado.
Para más información sobre programas de acceso anticipado, consulte este artículo sobre las fases de lanzamiento de producto (EN)
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introducción
Preparación de la biblioteca
Secuenciación y análisis de datos (1)
- 5. Adquisición de datos e identificación de bases
- 6. Reutilización y devoluciones de celdas de flujo
- 7. Análisis posterior
Troubleshooting
Descripción general
Este protocolo:
- sirve para secuenciar ARN natural.
- puede utilizarse con ARN total o una muestra enriquecida —por ejemplo, poli(A) o reducción de ARNr—, como material de entrada inicial.
- no precisa fragmentación
- se tardan 2 horas ~ en preparar la biblioteca.
De uso exclusivo en investigación
Este es un producto de acceso anticipado.
Para más información sobre programas de acceso anticipado, consulte este artículo sobre las fases de lanzamiento de producto (EN)
1. Aspectos generales del protocolo
IMPORTANTE
Este es un producto de acceso anticipado
Para tener más información sobre los programas de acceso anticipado, consulte este artículo sobre las fases de lanzamiento de productos.
Procure usar siempre la versión más reciente del protocolo.
Características del kit Direct RNA Sequencing Kit
Este kit se recomienda a usuarios que:
- Estén explorando características del ARN como bases modificadas.
- A los que les gustaría eliminar sesgos creados por la retrotranscriptasa o la PCR.
- Tienen transcritos que son difíciles de retrotranscribir.
Introducción al protocolo de secuenciación directa de ARN
Este protocolo describe cómo llevar a cabo la secuenciación de una muestra de ARN utilizando el kit de secuenciación Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004). A partir de ARN con un apéndice de poli(A) o de ARN total, se sintentiza una segunda cadena de ADNc para ganar estabilidad mediante retrotranscripción. Entonces, se ligan los adaptadores de secuenciación al híbrido ADNc-ARN para secuenciar en celdas de flujo para ARN MinION o PromethION (FLO- MIN004RA / FLO-PRO004RA respectivamente). Nótese, la cadena complementaria de ADNc no se secuencia, pero mejora el resultado de la secuenciación del ARN.
Antes de empezar, se recomienda hacer un experimento de control con RNA Control Strand (RCS) para familiarizarse con la tecnología.
Pasos del proceso de secuenciación:
Preparación del experimento
Pasos:
- Extraer el ARN, evaluar su longitud, cantidad y pureza. Los controles de calidad realizados durante el protocolo son esenciales para garantizar el éxito del experimento.
- Tener a disposición el kit de secuenciación, el instrumental adecuado y los reactivos de otros fabricantes.
- Descargar el programa para obtener y analizar los datos
- Verificar que la(s) celda(s) de flujo tiene(n) suficientes poros para realizar una buena secuenciación.
Preparación de la biblioteca
La tabla siguiente es un resumen de los pasos necesarios en la preparación de la biblioteca.
| Preparación de la biblioteca | Proceso | Tiempo | Parada opcional |
|---|---|---|---|
| Retrotranscripción | Sintetizar la cadena complementaria de ARN | 85 minutos ~ | En esta fase, el ARN retrotranscrito se puede guardar a -80 °C para utilizarse posteriormente. Nótese, esta es la única pausa de este protocolo. |
| Ligación del adaptador y lavado | Ligar los adaptadores de secuenciación a los extremos del híbrido ARN-ADNc | 45 minutos | Ligar los adaptadores de secuenciación a los extremos del híbrido ARN-ADNc. Recomendamos secuenciar la biblioteca tan pronto como se liguen los adaptadores. |
| Cebar la celda de flujo y cargar la biblioteca | Cebar la celda de flujo y cargar la biblioteca | 5 minutos |
Secuenciación y análisis
Pasos:
- Empezar el proceso de secuenciación usando el programa MinKNOW, que obtendrá datos brutos del dispositivo e identificará las bases.
IMPORTANTE
A diferencia del ADN, el ARN se transloca a través del nanoporo en dirección 3'-5'. Sin embargo, los algoritmos de identificación de bases invierten los datos automáticamente y las lecturas se muestran en dirección 5'-3'.
IMPORTANTE
Compatibilidad del protocolo
Este protocolo debería usarse solo en combinación con los siguientes productos:
- Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004)
- MinION RNA Flow Cell (FLO-MIN004RA)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) - Este kit es adecuado para retirar la biblioteca entre lavados, pero no eliminará el bloqueo de los nanoporos relacionado con el ARN.
- MinION Mk1B - Requisitos informáticos MinION Mk1B
- MinION Mk1C - Requisitos informáticos MinION Mk1C
- GridION - Requisitos informáticos GridION
2. Material y consumibles
Material
- 300 ng de ARN con apéndice de poli(A) o 1 µg de ARN total en 8 µl
- Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004)
Consumibles
- Induro® Reverse Transcriptase (NEB, M0681)
- 10 mM de solución dNTP (p. ej. NEB, N0447)
- NEBNext® Quick Ligation Reaction Buffer (NEB, B6058)
- T4 DNA Ligase 2M U/ml (NEB, M0202M)
- Murine RNase Inhibitor (NEB, M0314)
- Microesferas Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter™, A63987)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Etanol al 70 % recién preparado en agua sin nucleasas
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Qubit RNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32852)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32851)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
- Microcentrífuga
- Mezclador vórtex
- Cubeta con hielo
- Temporizador
- Termociclador
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Centrifuga Eppendorf 5424 (o equivalente)
En este protocolo necesitará 300 ng de ARN con apéndice de poli(A) o 1 µg de ARN total en 8 µl.
Es posible empezar el protocolo con una cantidad de muestra reducida, aunque tal vez se obtenga un resultado inferior.
Consulte los siguientes gráficos de valoración de muestra inicial a modo de orientación:
ARN con apéndice de poli(A)
ARN total
Muestra inicial de ARN
Es importante que la muestra inicial de ARN posea la cantidad y calidad requerida. Usar demasiado ARN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado o que contenga contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.
Para más información sobre cómo utilizar ARN como muestra inicial, consulte los enlaces a continuación.
- Polyadenylation of non-poly(A) transcripts using E. coli poly(A) polymerase
- RNA contaminants
- RNA stability
- RNA Integrity Number (RIN)
- Enrichment of polyadenylated RNA molecules
Estos documentos pueden encontrarse en la página DNA/RNA Handling page.
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
Contenido del kit Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004):
Nota: Hemos aumentado la concentración de los viales RNA CS (RCS) que se encuentran en los nuevos lotes de SQK-RNA004. Compruebe que sigue el método e indicaciones adecuadas a la concentración de RCS:
| Lote RNA004.20.xxxx o anterior | Lote RNA004.30.0001 o posterior |
|---|---|
| Vial de RNA CS (RCS) de concentración reducida: 15 ng/µl | Vial de RNA CS (RCS) de concentracion aumentada: 50 ng/µl |
| Nombre | Sigla | Color del tapón | No. de viales | Volumen (μl) |
|---|---|---|---|---|
| RT Adapter | RTA | Azul | 1 | 10 |
| RNA Ligation Adapter | RLA | Verde | 1 | 45 |
| RNA CS | RCS | Amarillo | 1 | 25 |
| Wash Buffer | WSB | Naranja | 2 | 1 200 |
| RNA Elution Buffer | REB | Negro | 1 | 300 |
| Library Solution | LIS | tapón blanco, etiqueta rosa | 1 | 600 |
| Sequencing Buffer | SB | Rojo | 1 | 700 |
| RNA Flush Tether | RFT | Rosa | 1 | 200 |
| Flow Cell Flush | FCF | Blanco | 1 | 8 000 |
Nota: El RNA CS (RCS) es la cadena de calibración y contiene enolasa II, del gen YHR174W, extraído de la levadura saccharomyces cerevisiae. Los archivos de referencia FASTA, correspondientes a las levaduras, están disponibles aquí.
3. Preparación de la biblioteca
Material
- 300 ng de ARN con apéndice de poli(A) o 1 µg de ARN total en 8 µl
- RT Adapter (RTA)
- RNA CS (RCS)
- Wash Buffer (WSB)
- RNA Ligation Adapter (RLA)
- RNA Elution Buffer (REB)
Consumibles
- Microesferas Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter™, A63987)
- Induro Reverse Transcriptase y 5 Induro RT Reaction Buffer (NEB, M0681)
- 10 mM de solución dNTP (p. ej. NEB, N0447)
- NEBNext® Quick Ligation Reaction Buffer (NEB, B6058)
- T4 DNA Ligase 2M U/ml (NEB, M0202M)
- Murine RNase Inhibitor (NEB, M0314)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Etanol al 70 % recién preparado en agua sin nucleasas
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
- Qubit RNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32852)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Termociclador
- Gradilla magnética
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
- Cubeta con hielo
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
Preparar los reactivos NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer y T4 DNA Ligase de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y colocar en hielo:
Descongelar los reactivos a temperatura ambiente.
Centrifugar los viales durante 5 segundos.
Mezclar los reactivos con la pipeta completamente, al menos 10 veces. Note: NO mezclar en vórtex la T4 DNA Ligase.
El tampón, NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer, quizás tenga un poco de precipitado. Dejar que alcance la temperatura ambiente y mezclar con la pipeta varias veces para romper el precipitado; agitar en vórtex durante varios segundos hasta tener la certeza de que el reactivo está completamente mezclado.
IMPORTANTE
En este protocolo, no recomendamos usar Quick T4 Ligase. Hemos descubierto que la ligasa T4 DNA Ligase (2M U/ml NEB M0202M) funciona mejor. Debe utilizarse junto al reactivo Quick Ligation Reaction Buffer (NEB B6058).
Centrifugar brevemente los viales RT Adapter (RTA), RNA CS (RCS) –si se utiliza– y RNA Ligation Adapter (RLA), mezclar con la pipeta y poner en hielo.
Descongelar a temperatura ambiente los tampones Wash Buffer (WSB) y RNA Elution Buffer (REB) y mezclar en vórtex. Centrifugar brevemente y poner en hielo.
Preparar el ARN en agua sin nucleasas:
- Transferir 300 ng de ARN con apéndice de poli(A) o 1 μl de ARN total en un tubos de PCR, de pared fina (0,2 ml).
- Ajustar el volumen a un total de 8 μl con agua sin nucleasas.
- Mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo para evitar cizalladuras indeseadas.
- Centrifugar brevemente.
MEDIDA OPCIONAL
El uso de RNA CS (RCS) es una medida de control opcional, adecuada en el control de calidad de la preparación de bibliotecas y la resolución de problemas.
Recomendamos incluir RNA CS (RCS) en la preparación de la biblioteca, por motivos de diagnóstico y resolucion de problemas.
No obstante, si no se usa RNA CS (RCS), sustituir el volumen con agua sin nucleasas.
Nótese, Este método varía ligeramente dependiendo de la concentración de RNA CS (RCS) presente en el kit. Compruebe que sigue el método e indicaciones adecuado para la concentración de RCS:
Hemos aumentado la concentración de los viales RNA CS (RCS), que se encuentran en los nuevos lotes de SQK-RNA004 y EXP-RCS001.
| Lotes RNA004.20.xxxx o anterior | Lotes RNA004.30.0001 o posterior |
|---|---|
| Vial de RNA CS (RCS) de concentracion baja: 15 ng/µl | Vial de RNA CS (RCS) de concentracion aumentada: 50 ng/µl |
| Lotes RCS001.10.xxxx o anterior | Lotes RCS001.20.0001 o posterior |
|---|---|
| Vial de RNA CS (RCS) de concentracion baja: 15 ng/µl | Vial de RNA CS (RCS) de concentracion aumentada: 50 ng/µl |
Preparar la reacción del adaptador —RT Adapter (RTA)— de la siguiente manera:
Uso de RNA CS de concentracion aumentada: disponible en lotes RNA004.30.0001 o posterior:
1. En un tubo de PCR de pared fina (0,2 ml), diluir al RNA CS (RCS) de entrada como se indica a continuación:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| RNA CS (RCS) | 1 µl |
| Agua sin nucleasas | 2 µl |
| Total | 3 µl |
2. Mezclar con la pipeta al menos 10 veces hasta asegurarse de que esté bien mezclado.
3. En el tubo de PCR de pared fina (0,2 ml) que contiene la muestra de ARN, combinar los reactivos en el siguiente orden:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| ARN del paso anterior | 8 µl |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer | 3 µl |
| RNA CS (RCS) diluido | 0.5 µl |
| Murine RNase Inhibitor | 1 µl |
| RT Adapter (RTA) | 1 µl |
| T4 DNA Ligase | 1.5 µl |
| Total | 15 µl |
Uso de RNA CS de concentracion reducida: disponible en lotes RNA004.20.xxxx o posterior:
1. En el tubo de PCR que contiene la muestra de ARN, combinar los reactivos en el siguiente orden:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| ARN | 8 µl |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer | 3 µl |
| RNA CS (RCS) | 0,5 µl |
| Murine RNase Inhibitor | 1 µl |
| RT Adapter (RTA) | 1 µl |
| T4 DNA Ligase | 1,5 µl |
| Total | 15 µl |
Mezclar con la pipeta y centrifugar brevemente.
Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.
En un tubo nuevo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml, combinar los siguientes reactivos para obtener la mezcla de reacción de transcripción inversa:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| Agua sin nucleasas | 13 µl |
| 10 mM de dNTPs | 2 µl |
| 5 tampón de reacción Induro RT | 8 µl |
| Total | 23 µl |
Transferir la mezcla de reacción con la transcriptasa inversa al tubo de PCR de 0,2 ml, que contiene el ARN ligado con adaptador y mezclar con la pipeta.
Añadir 2 μl de Induro Reverse Transcriptase a la reacción y meclar con la pipeta.
Colocar el tubo en el termociclador e incubar a 60 °C durante 30 min, a 70 °C durante 10 min y poner a 4 °C antes de proceder con el paso siguiente.
Transferir la muestra a un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA Lobind.
Resuspender las microesferas Agencourt RNAClean XP agitando en vórtex.
Añadir 72 μl de microesferas resuspendidas Agencourt RNAClean XP, a la reacción de transcripción inversa y mezclar con la pipeta.
Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Preparar 200 µl de etanol al 70 %, con agua sin nucleasas.
Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.
Sin retirar el tubo del imán, lavar las microesferas con 150 μl de etanol al 70 % recién preparado, tal y como se describe a continuación:
- Añadir 150 µl de etanol al 70 %, recién preparado, y esperar a que las microesferas se desplacen hacia el imán y formen un precipitado.
- Girar el tubo 180 °C. Esperar a que las microesferas se desplacen hacia el imán y formen un precipitado.
- Girar el tubo 180 °C de nuevo (hasta el punto de partida) y esperar a que las microesferas precipiten de nuevo.
Retirar cuidadosamente el etanol con una pipeta y desechar.
Centrifugar brevemente y poner el tubo de nuevo en el imán hasta que el eluído esté claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol.
Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 23 µl de agua sin nucleasas. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Extraer 23 µl de eluido y guardarlo en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.
MEDIDA OPCIONAL
En este momento, la muestra de ARN-RT puede guardarse a -80 °C y utilizarse más adelante.
Nótese, en este protocolo, este es el único punto donde es posible hacer una pausa.
En el mismo tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml, combinar los reactivos en el siguiente orden:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| Muestra ARN-RT | 23 µl |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer | 8 µl |
| RNA Ligation Adapter (RLA) | 6 µl |
| T4 DNA Ligase | 3 µl |
| Total | 40 µl |
Mezclar con la pipeta.
Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Resuspender las microesferas Agencourt RNAClean XP agitando en vórtex.
Añadir 16 μl de microesferas resuspendidas Agencourt RNAClean XP, a la reacción de transcripción inversa y mezclar con la pipeta.
Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar brevemente la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán durante 5 minutos y cuando el sobrenadante esté claro e incoloro, retirarlo con una pipeta.
Añadir 150 μl de Wash Buffer (WSB) a las microesferas. Cerrar la tapa del tubo y resuspender las microesferas golpeando suavemente el tubo con el dedo. Volver a colocar el tubo en el imán, dejar que las microesferas precipiten durante 5 minutos y cuando el sobrenadante esté claro e incoloro, retirarlo con una pipeta.
Repetir el paso anterior.
IMPORTANTE
Al agitar las microesferas se obtiene una eliminación más eficaz del adaptador que al añadir el tampón y aspirarlo inmediatamente.
Centrifugar brevemente el tubo y volver a colocarlo en la gradilla magnética hasta que las microesferas hayan precipitado. A continuación, retirar cualquier resto de Wash Buffer (WSB) con la pipeta.
Retirar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 13 μl de RNA Elution Buffer (REB), golpeando suavemente el tubo con el dedo. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Precipitar las microesferas en un imán durante 5 minutos, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Extraer 13 µl de eluido y guardarlo en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.
Cuantificar 1 μl de ARN retrotranscrito y adaptado, con ayuda del ensayo de ADN HS y el fluorímetro qubit.
La cantidad de eluido final que se desea recuperar es > 30 ng.
Las cantidades recogidas varían según las diferentes cantidades de muestra y las preparaciones de bibliotecas. No obstante, recomendamos utilizar el volumen completo de ARN para obtener los mejores resultados en la secuenciación.
FIN DEL PROCESO
El ARN retranscrito y adaptado está listo para cargar la celda de flujo.
IMPORTANTE
La biblioteca de ARN debe secuenciarse inmediatamente y no se puede guardar para utilizarse más adelante.
4. Cebado y carga de la celda de flujo MinION/GridION
Material
- Library Solution (LIS)
- Sequencing Buffer (SB)
- RNA Flush Tether (RFT)
- Flow Cell Flush (FCF)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE
Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo para ARN (FLO-MIN004RA).
CONSEJO
Cebado y carga de la celda de flujo
Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Solution (LIS), RNA Flush Tether (RFT) y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex y centrifugar brevemente.
En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA Lobind mezclar los siguientes reactivos. Agitar en vórtex y centrifugar brevemente.
| Reactivos | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| RNA Flush Tether (RFT) | 30 µl |
| Flow Cell Flush (FCF) | 1 170 µl |
| Total | 1 200 µl |
Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.
MEDIDA OPCIONAL
Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.
Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.
Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.
Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.
En un tubo de 1,5 ml preparar la biblioteca de la siguiente manera:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 37,5 µl |
| Library Solution (LIS) | 25,5 µl |
| Biblioteca de ARN | 12 µl |
| Total | 75 µl |
Completar el cebado de la celda de flujo:
- Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
- Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.
Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
FIN DEL PROCESO
Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.
5. Adquisición de datos e identificación de bases
Cómo empezar a secuenciar
Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.
Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:
- En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o en remoto.
- Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.
Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:
- Manual de usuario MinION Mk1B
- Manual de usuario MinION Mk1C (EN)
- Manual de usuario MinION Mk1D (EN)
- Manual de usuario GridION
Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:
1. Ir a la página de inicio y pulsar "Iniciar secuenciación".
2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de muestra.
3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.
4. Configurar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o dejar la configuración por defecto en la pestaña Configuración del experimento.
Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, se puede activar en MinKNOW en la fase posejecución. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.
5. En la página de Inicio, pulsar Iniciar la secuenciación.
Análisis de datos
Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.
Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y de análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.
En la sección Análisis posterior, se describen otras opciones para analizar los datos.
6. Reutilización y devoluciones de celdas de flujo
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) or Flow Cell Wash Kit XL (EXP-WSH004-XL)
IMPORTANTE
El kit Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004 or EXP-WSH004-XL) es compatible con las celdas de flujo de ARN y el kit Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004).
No obstante, tenga en cuenta que:
- El kit de lavado no es eficaz como enjuague de nucleasas en la secuenciación directa de ARN: no recuperará los poros bloqueados.
- Funciona como un enjuague para cargar una muestra nueva: lavará la mayor parte de la biblioteca de la matriz y eliminará el adaptador de la muestra restante, evitando su captura y secuenciación, lo que permitirá volver a cargar la biblioteca.
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a entre 2 °C y 8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
CONSEJO
Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.
IMPORTANTE
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
7. Análisis posterior
Análisis posterior a la identificación de bases
Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:
1. Flujos de trabajo de EPI2ME
A fin de realizar un análisis en profundidad de los datos, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales sobre bioinformática y flujos de trabajo, que están disponibles en EPI2ME. La plataforma proporciona un espacio donde los flujos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
2. Herramientas de análisis para la investigación
Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y flujos de trabajo bioinformáticos, disponibles en EPI2ME Labs, que encontrará en la sección del mismo nombre de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los proyectos que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad
Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte el centro de recursos Resource Centre y busque herramientas bioinformáticas para su aplicación. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/programas informáticos.
8. Problemas durante la extracción de ARN y preparación de la biblioteca
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
| Observaciones | Possibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel) | El ARN se degradó durante la extracción. | Probar un método de extracción de ARN diferente. Para más información sobre el tema, consulte el documento RNA Integrity Number (NIN). Encontrará más información en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Para más información sobre el tema, consulte el documento RNA Integrity Number (NIN). Encontrará más información en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el ambiente en el que se trabaje, incluido el instrumental de laboratorio, estén libres de ribonucleasas. |
9. Problemas durante la secuenciación de ARN
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que tras la evaluación de la celda de flujo
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo y antes de cebarla, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, las burbujas de aire pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar a colocarla en una posición diferente (GridION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca puede haber dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la evaluación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad (CC) de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada, tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales. |
Ocupación de poros por debajo del 40 %
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Ocupación de poros inferior al 40 % | No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo | Procure cargar la cantidad de biblioteca de buena calidad recomendada en la preparación de la biblioteca del protocolo correspondiente. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular los moles con herramientas como la calculadora NEBio, opción "RNA ss: mass to moles". |
| Ocupación de los poros próxima a 0 | No hay anclaje en la celda de flujo | Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (vial FCT) No olvide añadir Flow Cell Tether (FCT) al Flow Cell Flush (FCF) antes del cebado. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos o poros no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están irreversiblemente dañados) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de manera irreversible. Vea el vídeo Priming and loading your flow cell para familiarizarse con las técnicas más adecuadas. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Fluctuación de la temperatura
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace. |
Last updated: 12/14/2024
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