采用纳米孔测序，用户无需对样本进行亚硫酸氢盐转化，即可直接检测甲基化胞嘧啶（如CpG位点）。CpG 位点常在基因组中以高密度簇集形式出现，称为 CpG 岛（CGI）。大多数脊椎动物基因的启动子区域都位于 CpG 岛内。

启动子区域甲基化模式的变化与基因表达变化密切相关，并与多种疾病状态（如癌症）有关。通过比较肿瘤样本与正常样本之间的甲基化差异，可以帮助揭示与肿瘤形成和发展相关的分子机制。

借助Oxford Nanopore的适应性采样（AS），样本无需前期处理，只需在测序过程中消耗非靶向区域，即可实现对目标基因区域（如CGI）的富集。该方法快速、灵活、准确。

请参阅我们的简化甲基化测序入门，了解有关此方法的详细工作原理，及与其它甲基化分析技术（如EPIC甲基化芯片、亚硫酸氢盐）的比较情况。

RRMS 可在 GridION 以及 PromethION P2S、P24 和 P48 设备上运行。

在 GridION 平台上运行时，我们建议每张芯片仅测序一个样本，并采用实验指南： 使用 SQK-LSK114 试剂盒对细胞进行简化甲基化测序。

人类样本测序

人类样本测序

简化甲基化测序 (RRMS）方案能够靶向人类基因组中约 310 Mb 的高 CpG 富集区域，覆盖所有已注释的 CpG 岛、岛岸、岛架及超过 90% 的启动子区域（其中含4个以上 CpG 的启动子覆盖率达100%），同时还包括基因组中其他富含 CpG 的区域。相应的 BED 文件共包含约 718 万个 CpG 位点。

为衡量 RRMS 的甲基化识别表现，我们为源自一男性个体的正常和癌性转移性黑色素瘤细胞系对（COLO829/COLO829_BL），及三阴性乳腺癌细胞系对（HCC1395/HCC1935_BL）构建文库，并进行简化甲基化测序（重复次数=5）。每个样本分别上样至一张 MinION/GridION 测序芯片。RRMS 可从每个样本中识别出七百三十万至八百五十万个高置信度（每个位点由超过 10 条序列片段覆盖）的 CpG 甲基化位点。

为便于比较，我们同时使用亚硫酸氢盐法对样本进行简化甲基化测序（RRBS）。该方法可从每个样本中识别出一百七十万至二百五十万个高置信度的甲基化位点。有关二者比较的更多信息，请参阅我们的 RRMS 甲基化识别表现文档 及 海报 。

小鼠样本测序

RRMS 方案及其新设计的 BED 文件同样适用于小鼠基因组，目标区域约 308 Mb，涵盖全部 CpG 岛和启动子区域，以及其他富含 CpG 的基因组区域。

我们在胚泡来源的胚胎干细胞系（ES-E14TG2a）和白血病细胞系（BALB/c AMuLV A.3R.1）上进行了重复实验，以评估 RRMS 方法在小鼠样本中的性能，并以非 RRMS 文库作为对照。每个样本均在单独的一张 MinION 测序芯片上进行测序。结果显示，RRMS 在小鼠基因组中可实现每个位点覆盖深度超过 10× 的高置信度甲基化检测，单个样本可检测到约 500–580 万个 CpG 位点，而对照文库仅检测到约 40 万个 CpG 位点。

RRMS 方案结合定制的 BED 文件亦可用于其他脊椎动物基因组的测序。
但请注意，Oxford Nanopore Technologies 目前仅验证了该方法在人类和小鼠样本中的适用性。

本实验指南详细介绍了采用免扩增条形码试剂盒（SQK-NBD 114.24）和 MinKNOW 软件中的适应性采样功能，对样本进行 DNA 提取，并在单张 PromethION 测序芯片上同时完成最多 4 个样本的简化甲基化测序（RRMS） 的操作流程，以及常见问题的解决方法。

测序工作流程：

实验准备

您将需要：

• 确保您已准备好测序试剂盒、正确的仪器以及第三方试剂。
• 下载数据收集和分析软件。
• 请确保所使用的 BED 文件适用于适应性采样
• 检查您的测序芯片上有足够的活性纳米孔，以确保测序良好运行。

样本制备

• 采用 QIAGEN Puregene 细胞试剂盒提取 DNA
• 使用 Covaris g-TUBE 片段化 DNA，并评估其长度、浓度和纯度。 质量评估步骤对确保实验成功至关重要。

文库制备

下表概述了文库制备所需的步骤，包括时间安排和可以中止的节点。

测序和分析

您将需要：

• 使用 MinKNOW 软件开始测序。该软件会通过测序仪收集原始数据，并将其识别成碱基序列。在实验配置阶段，开启适应性采样功能，并导入事先准备好的 BED 文件（包含感兴趣的目标区域）以及相应的 FASTA 参考序列文件。

• 样品测序总时长为 96 小时。当可用孔数下降至初始孔数的约 40% 时（通常分别在测序约 24 小时 和 48 小时 后），各进行一次芯片清洗操作，共两次。

• 使用 Dorado 进行修饰碱基识别；有关详细信息，请参阅 Dorado GitHub 页面。

• 使用本指南后文提供的命令，对检测到的修饰碱基进行整合与统计分析，并开展 CpG 岛注释分析。

对于 DNA 提取，起始量要求为：

• 每个样本需 500 万个细胞

对于文库制备，每个样本的起始量要求为：

• 2 µg 经 g-TUBE 打断的 gDNA

DNA质控

选择符合质量和浓度要求的起始DNA至关重要。使用过少或过多的DNA，或者质量较差的DNA（如，高度碎片化、含有RNA或化学污染物的DNA）都会影响文库制备。

有关如何对DNA样品进行质控，请参考起始DNA/RNA质控实验指南。

化学污染物

从原始样本中提取DNA的方法不同，可能会导致经纯化的DNA中所残留的化学污染物不同。这会影响文库的制备效率和测序质量。请参阅牛津纳米孔社区的污染物 页面了解更多信息。

Oxford Nanopore Technologies 推荐您使用本实验指南中列出的所有第三方试剂，并已对其进行验证。我们尚未对其它替代试剂进行测试。

我们建议您按制造商说明准备待用的第三方试剂。

我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到 PromethION 测序芯片 12 周内进行。Oxford Nanopore Technologies 会对活性孔数量少于以下标准，且尚未投入测序的芯片进行替换*：请您按照测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。

*（请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于 Oxford Nanopore Technologies 推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两日内递交给我们。）

请注意： 我们正在更新免扩增条形码试剂盒，新版将加大短片段缓冲液（SFB）的体积。如果您使用的是旧版试剂盒，或需要额外的短片段缓冲液（SFB），可通过购买 SFB 扩展包（EXP-SFB001） 获取。

新版试剂盒：加大体积的短片段缓冲液（SFB）

旧版试剂盒：较低体积的短片段缓冲液（SFB）

请注意： 本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20℃下储存（试剂稳定性将不受损害）。

请注意： DNA参照（DCS）是一段可比对到Lambda基因组的3'端、长度为3.6 kb 的标准扩增子。

请按需使用我们推荐的任一 提取方案，从样本中提取 DNA。

在评估本方法性能时，Oxford Nanopore 团队使用约 500 万个细胞，并采用以下方案进行 DNA 提取：人类细胞系 DNA – QIAGEN Puregene 细胞试剂盒。该方法的具体步骤如下所示。
注意： 此方法同样适用于小鼠细胞系 DNA 的提取。

此外，我们还提供多种 哺乳动物样本 DNA 提取方案，可用于其他类型的样本。

使用 g-TUBE（Covaris） 对 gDNA 进行机械剪切，将 DNA 打断为约 6 kb 的片段，用于后续文库构建。

本方法建议在测序约 24 小时后对芯片进行首次清洗，以恢复纳米孔活性并维持高效的数据采集。再经过约 24 小时测序后，应进行第二次清洗并重新上样。接头连接步骤中已预先制备足够的文库，以满足三次芯片上样的需求。

• 此清洗步骤旨在去除测序芯片内现存的大部分文库并疏通纳米孔，为芯片的下一次上样做好准备。
• 请在清洗及上样过程中 暂停 MinKNOW 的数据采集。
• 测序芯片经清洗后，即可用于下一文库的上样。

您可以在“纳米孔活动状态”（Pore Activity） 或“孔扫描结果”（Pore Scan Results） 图中查看纳米孔的可用情况。

下图展示了测序芯片在清洗前后纳米孔状态的示例数据， 以及包含清洗和重新上样步骤的累计测序数据产出示例。 红色星号标示了执行测序芯片清洗与重新上样的时间点。

图 1. 96 小时测序过程中的通道状态变化。通过对测序芯片进行清洗，可恢复被堵塞的纳米孔，从而实现连续高效的数据采集。红色星号表示执行冲洗的时间点。

图 2. 96 小时运行期间的累计测序数据产出。红色星号表示执行冲洗的时间点。

以下视频演示了如何在测序运行结束后清洗测序芯片并上样新的文库。

有关纳米孔数据分析的完整概述，包括碱基识别和次级分析，请参阅数据分析 文档。

MinKNOW 软件负责仪器控制和数据采集。 请确保已在计算机上安装 MinKNOW。有关测序实验的详细设置说明，请参阅 MinKNOW 实验指南。

• 在"试剂盒"页面上，选择 免扩增条形码测序试剂盒-24（SQK-NBD114.24） 。

• 将碱基识别设置为 关 （此操作将自动关闭条码拆分功能）。
  注意： 碱基识别和条码拆分将在测序完成后，于下游分析步骤中进行。

• 将适应性采样设为 开 ，并选择 富集 。
  指定 人类参考基因组文件（用于比对） 以及 .bed 文件（用于定义富集区域） 。您可从在线目录中查找适用于人类 RRMS 的 .bed 文件。

• 将运行时长设置为 至少 96 小时 。

• 根据实验需求设置输出参数。
  为确保下游分析正常运行，建议保持默认输出格式（.POD5）。

• 点击 开始 启动测序。

碱基识别及条形码拆分

碱基识别

独立版 Dorado 通过 Dorado 碱基识别工具（basecaller）进行碱基识别。 打开终端窗口，输入以下命令：

dorado basecaller hac,5mCG_5hmCG --kit-name SQK-NBD114-24 \
--secondary “no” -Y \
--reference {reference_fasta} {input_pod5_folder} \
| samtools view -e '[qs] >= {qscore_filter}' \
--output {out_pass_bam} \
--unoutput {out_fail_bam}

注意：

• 我们建议在 RRMS 测序实验中采用高精准（hac）模型。如选用超精准（sup）模型，请确保在上述命令中调用正确的模型。
• 如提供 FASTA 参考文件，则可在碱基识别过程中同时进行比对。您可点此下载推荐的人类参考基因组文件。
• 使用参数 --secondary no 可去除二级比对结果；启用 -Y 参数，可对补充比对结果进行软剪切。
• 通过添加参数 --kit-name SQK-NBD114-24，Dorado 会在生成的 BAM 文件中添加条形码标签，从而根据条形码对序列进行分类。
• 建议将质量分数（qscore）过滤阈值设置为 10。
• 请注意，使用 Dorado 进行碱基识别时需要 GPU 计算资源。 更多有关如何运行 Dorado 的详情，请参阅 github 资料库。

条形码拆分

Dorado demux 用于根据条形码对测序片段进行拆分。具体命令如下：

dorado demux --no-classify --sort-bam --output-dir <out_folder> {out_pass_bam}

注意：

• 此步骤会根据所使用的条形码试剂盒（例如 SQK-NBD114-24），为其中每个可识别的条形码分别生成一个已排序的 BAM 文件。
• Dorado 默认会自动剪切接头和条形码。一旦条形码被剪切，测序片段将无法再次进行条形码拆分。 如需了解更多信息，请参阅Dorado 文档。

您可以从 AS 目录下载 RRMS 实验所需的目标区域 BED 文件。

Mosdepth 用于评估感兴趣条形码所对应目标区域的覆盖度：

mosdepth -x -t 8 -n -b {target_bed} {out_prefix} {input_pass_bam}

修饰识别

Human variation （人类变异分析）流程使用 modkit 对基因组各位点的修饰信息进行汇总分析。

该工作流程可在以下仓库中获取：wf-human-variation github.

相关文档可在以下页面中查阅：wf-human-variation EPI2ME 页面

对于大多数 RRMS 实验，我们建议使用以下命令：

nextflow run https://github.com/epi2me-labs/wf-human-variation \
-profile singularity \  
--mod \
--bam <bam> \
--bed RRMS_human_hg38.bed \
--ref GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fasta \
--sample_name <sample> --out_dir <output_dir>

（可选）单倍型特异性甲基化分析：

如需进行单倍型特异性甲基化分析，可在命令中添加参数 --snp --phased。此操作将分别汇总各单倍型上的甲基化修饰（例如，为每个单倍型生成独立的 bedmethyl 文件）：

nextflow run https://github.com/epi2me-labs/wf-human-variation \
-profile singularity \  
--mod --snp --phased \
--bam <bam> \
--bed RRMS_human_hg38.bed \
--ref GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fasta \
--sample_name <sample> --out_dir <output_dir>

注意： 对于此类特定分析，建议样本的测序覆盖度在 30X 以上。

“modkit dmr” 工具可用于检测不同样本间的差异甲基化区域。

详细说明请参阅 modkit 文档。

由 Dorado 生成的 BAM 文件不仅包含标准碱基信息，还包括存储在 MM 和 ML 标签中的逐条序列（per-read）修饰信息。若需可视化单条序列的修饰碱基识别结果，可在 IGV 中加载 BAM 文件，并将 “colour reads as” 选项设置为 “base modification 2-color (all)”。

如果您使用 wf-human-variation 流程进行了分相（phasing）分析，则可以在 IGV 中加载带有单倍型标签的 BAM 文件。之后，在 IGV 的 “group by” 选项中选择 “phase”，即可根据单倍型（haplotype）信息将比对结果分组显示。

此外，您还可在 IGV 中通过 BIGWIG 格式查看各个位点的甲基化频率。 为此，您可首先使用 modkit 通过以下命令生成 BEDGRAPH 文件：

modkit pileup --cpg --combine-strands --bedgraph \ 
--threads 10 --prefix {out_prefix} \  
--ref {reference_fasta} \ 
{out_folder} {input_pass_bam}

请注意，对于每种碱基修饰（如本例中 5mC 和 5hmC），都会分别生成一个独立的 BEDGRAPH 文件。

随后，可使用 bedGraphToBigWig 工具将 BEDGRAPH 文件转换为 BIGWIG 格式。转换后的 BIGWIG 文件可与 BAM 文件一同加载至 IGV：

bedtools sort -i {out_folder}/{prefix}_m_CG0_combined.bedgraph | cut -f 1-4 > {out_folder}/{prefix}_m_CG0_combined_sort.bedgraph

bedGraphToBigWig {out_folder}/{prefix}_m_CG0_combined_sort.bedgraph {reference_chrSize} {out_mod_bed_agg_filt_bigwig}

有关 RRMS 在人类样本中的性能评估信息，请参阅我们的 RRMS 性能评估文档。

由于 RRMS 实验测序时间较长，并包含多次芯片清洗和文库重新上样，实验完成后不建议再次使用该测序芯片。

重复使用可能导致数据产出不足，无法满足分析需求。

我们还在 Nanopore 社区的Support板块提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮（support@nanoporetech.com）或 纳米孔社区的在线支持（LiveChat）联系我们。

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