La secuenciación por nanoporos permite la detección directa de citosinas metiladas (p. Ej., en puntos CpG), sin necesidad de convertirlas en bisulfito. Los sitios CpG se dan con frecuencia en agrupaciones de elevada densidad llamadas islas CpG (CGI) y la mayoría de genes de vertebrados tienen sus promotores alojados dentro de estas islas.

Los cambios en los patrones de metilación dentro de los promotores están asociados a los cambios en la expresión génica y a los estados de enfermedades como el cáncer: analizar las diferencias de metilación entre muestras de tumores y muestras normales ayuda a descubrir mecanismos asociados con la formación y desarrollo de tumores.

El muestreo adaptativo (MA) constituye un método rápido, flexible y preciso de enriquecer regiones de interés (p. Ej., islas CpG) mediante el agotamiento de regiones excluidas durante la secuenciación, sin necesidad de manipular la muestra de antemano.

Encontrará más información sobre cómo funciona el método y cómo se compara con otras técnicas de análisis de metilación (p. ej., Matrices EPIC, bisulfito), en el documento «Introducción a la secuenciación de metilación con representación reducida».

El protocolo de secuenciación múltiple de metilación con representación reducida es compatible con los dispositivos MinION Mk1B/Mk1D, GridION, PromethION 2 Solo, P24 y P48.

Cuando se ejecute en MinION o GridION, recomendamos secuenciar una muestra por celda de flujo y utilizar nuestro protocolo Secuenciación de metilación con representación reducida (RRMS) a partir de células que utilizan el protocolo SQK-LSK114.

Secuenciación de muestras humanas

El protocolo RRMS permite dirigirse a 310 Mb del genoma humano, altamente enriquecidos en las regiones CpG, e incluye todas las islas CpG anotadas, sus zonas adyacentes (shores), regiones más alejadas (shelves) y más del 90 % de las regiones promotoras (el 100 % de los promotores que contienen más de 4 sitios CpG). También abarca otras regiones del genoma ricas en CpG. El número total de sitios CpG en el archivo .bed es 7,18 millones.

A efectos de evaluación comparativa, hemos realizado un protocolo RRMS en cinco duplicados de una estirpe celular de un melanoma metastásico y su par normal para un individuo masculino (COLO829/COLO829_BL) y un par de estirpes celulares de cáncer de mama triple negativo (HCC1395/HCC1935_BL). Cada muestra se secuenció en una única celda de flujo MinION. El protocolo RRMS dio como resultado identificaciones de metilación de elevada confianza (>10 lecturas solapadas) en un rango de 7,3 a 8,5 millones de sitios CpG por muestra.

A modo de comparación, también realizamos el protocolo Secuenciación por bisulfito de representación reducida (RRBS), que por lo general produce entre 1,7 y 2,5 identificaciones de metilación con elevada confianza por muestra. Encontrará más información acerca de esta comparación en el documento sobre las prestaciones de RRMS y el póster.

Secuenciación de muestras de ratón

También se han desarrollado un protocolo RRMS y un nuevo archivo .bed dirigido a 308 Mb del genoma del ratón, con una cobertura del 100 % de las islas CpG y las regiones promotoras, así como de otras regiones del genoma ricas en sitios CpG.

El funcionamiento de RRMS en muestras de ratón se caracterizó por el uso de réplicas de una estirpe de citoblastos embrionarios derivada de blastocitos, (ES-E14TG2a) y una estirpe celular de leucemia ((BALB/c AMuLV A.3R.1). También se secuenció, como control, una biblioteca que no era RRMS. Cada muestra se secuenció en una celda de flujo MinION: RRMS dio como resultado identificaciones de metilación de elevada fiabilidad (más de 10× lecturas por sitio) en 5,0-5,8 millones de sitios CpG por muestra en el genoma del ratón, comparado con ~400 000 sitios CpG en la biblioteca de control.

Con el protocolo RRMS y un archivo .bed personalizado, es posible secuenciar otros genomas de vertebrados, pero Oxford Nanopore Technologies ha validado este método únicamente en muestras humanas y de ratón.

Este protocolo describe cómo llevar a cabo la extracción de ADN y secuenciación múltiple de metilación con representación reducida (RRMS) de hasta 4 muestras en una única celda de flujo PromethION, utilizando el kit Native Barcoding Kit (SQK-NBD114.24) y la función Muestreo adaptativo de MinKNOW.

Pasos del proceso de secuenciación:

Preparación del experimento

Pasos:

• Tener a disposición el kit de secuenciación, el instrumental adecuado y los reactivos de otros fabricantes.
• Descargar el programa con el que se obtienen y analizan los datos.
• Contar con el archivo .bed adecuado para realizar el muestreo adaptativo.
• Verificar la celda de flujo y comprobar que tiene poros suficientes para realizar una buena secuenciación.

Preparación de la muestra

• Extraer el ADN con ayuda del kit Puregene Cell, de QIAGEN.
• Fragmentar el ADN con ayuda del tubo g-TUBE de Covaris, comprobar su longitud, cantidad y pureza. Los controles de calidad realizados durante el protocolo son esenciales para garantizar el éxito del experimento.

Preparación de la biblioteca

La tabla siguiente describe los pasos necesarios en la preparación de la biblioteca.

Secuenciación y análisis

Pasos:

• Empezar el proceso de secuenciación usando el programa MinKNOW, que recopilará los datos sin procesar del dispositivo y los convertirá en lecturas de bases identificadas. Mientras configura el experimento, active la función Muestreo adaptativo e importe un archivo .bed preconfigurado con sus regiones de interés, junto a un archivo de referencia FASTA.
• Secuenciar la muestra durante un total de 96 horas, con dos lavados de celda de flujo cuando el recuento de poros disponible disminuya a un 40 % del recuento de poros inicial (por lo general, tras 24 horas aprox. y una segunda vez tras 48 horas).
• Utilizar Dorado para identificar bases modificadas; encontrará más información en la página de Dorado en github.
• Utilizar los comandos recomendados al final de este protocolo para agregar las bases modificadas y realizar anotaciones de islas CpG.

Requisitos de cantidad inicial por muestra en el método de extracción:

• 5 × 10⁶ de células por muestra

Cantidad de muestra necesaria por muestra en la preparación de la biblioteca:

• 2 μg de ADNg fragmentado en g-tube

Verificar la calidad de la muestra inicial de ADN

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), tal vez afecte a la preparación de la biblioteca.

Siga las instrucciones del protocolo Input DNA/ RNA QC, sobre cómo realizar un control de calidad en la muestra de ADN.

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra sin procesar, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual tal vez afecte la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

Hemos probado y recomendamos el uso de todos los reactivos de otros fabricantes usados en este protocolo. Oxford Nanopore Technologies no ha evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos comprobar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La evaluación deberá realizarse en los primeros tres meses desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la evaluación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para evaluar la celda de flujo, consultar las instrucciones en el documento Flow Cell Check.

Nota: estamos actualizando nuestros kits de códigos de barras sin amplificar (native barcoding), que ahora incluyen una mayor cantidad de Short Fragment Buffer (SFB). Si dispone de un kit en el formato antiguo y necesita una cantidad adicional de SFB, es posible adquirirla con el complemento SFB Expansion (EXP-SFB001).

Nuevo formato: mayor cantidad de Short Fragment Buffer (SFB)

Formato antiguo: menor cantidad de Short Fragment Buffer (SFB)

Nota: este producto contiene reactivo AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter, Inc., y puede almacenarse a −20 °C junto con el kit sin comprometer su estabilidad.

Nota: la muestra de control de ADN (DCS) es un amplicón estándar de 3,6 kb que corresponde al extremo 3’ del genoma Lambda.

Extraer el ADN de la(s) muestra(s) siguiendo uno de los protocolos de extracción recomendados.

Como parte de la evaluación comparativa de este método, el equipo de Oxford Nanopore extrajo ADN de ~5 millones de células utilizando el protocolo: ADN de estirpes celulares humanas – kit Puregene Cell de QIAGEN. A continuación, describimos los pasos de este método.
Nota: este método también admite ADN de estirpes celulares de ratón.

También ofrecemos varios protocolos de extracción de muestras de mamíferos, que es posible utilizar con otros tipos de muestras.

La fragmentación mecánica del ADN genómico se lleva a cabo con un tubo g-TUBE (Covaris), que permite cizallar el ADN y obtener fragmentos de aproximadamente 6 kb, como paso previo al protocolo de preparación de la biblioteca.

En este método, la celda de flujo se lava tras 24 h de secuenciación para restablecer los poros y garantizar una adquisición de datos eficaz. Tras 24 h de secuenciación adicionales, se lava la celda de flujo y se vuelve a cargar por segunda vez. Por este motivo se creó suficiente biblioteca para cargar 3 celdas de flujo, en la fase de ligación del adaptador.

• Este método de lavado tiene por objeto eliminar la mayor parte de la biblioteca inicial y desbloquear los poros como preparación para cargar la biblioteca siguiente.
• La adquisición de datos en MinKNOW debe interrumpirse durante el lavado y la carga de la biblioteca.
• Una vez lavada la celda de flujo, es posible cargar la siguiente biblioteca.

Navegar hasta el gráfico de actividad o el de resultados de exploración para ver la disponibilidad de poros.

A continuación, se presentan datos de ejemplo sobre el estado de los poros observados en una celda de flujo antes y después de realizar los pasos de lavado. Además, es posible observar un ejemplo de los datos de secuenciación acumulados, incluyendo los pasos de lavado y recarga. Los asteriscos rojos indican los lavados y las recargas de la celda de flujo.

Imagen 1. Estado del canal durante un experimento de secuenciación de 96 horas. Los lavados de la celda de flujo están incluidos en el método para restablecer los poros bloqueados y permitir una adquisición continua de datos. Los asteriscos rojos indican que se ha realizado un purgado.

Imagen 2. Estado del canal durante un experimento de secuenciación de 96 horas. Los asteriscos rojos indican que se ha realizado un purgado.

Este vídeo muestra cómo lavar una celda de flujo tras un experimento de secuenciación y cómo cargar una nueva biblioteca.

Encontrará una descripción completa del análisis de datos de nanoporos, con distintas posibilidades de análisis de identificación y postidentificicación de bases, en el documento Data Analysis.

El programa MinKNOW gestiona el dispositivo de secuenciación y la adquisición de datos. Compruebe que MinKNOW esté instalado en su ordenador. Encontrará instrucciones adicionales para configurar experimentos de secuenciación en el Protocolo de MinKNOW.

• En la pestaña del kit, seleccionar Native Barcoding Sequencing Kit 24 (SQK-NBD114.24).

• DESACTIVAR la identificación de bases (que desactivará automáticamente la adición de códigos de barras).
  Nota: la identificación de bases y adición de códigos se llevará a cabo tras la secuenciación, en la sección de análisis de datos.

• ACTIVAR el Muestreo adaptativo y seleccionar Enriquecer.
  Introducir el archivo de referencia humano para la alineación y el archivo .bed para enumerar las regiones (consulte el catálogo en línea del archivo .bed de RRMS humano).

• Configurar la duración del experimento a un mínimo de 96 horas.

• Establecer los parámetros de salida deseados.
  Recomendamos mantener las opciones predeterminadas de formato (.POD5) en el archivo de salida, lo que garantiza el correcto funcionamiento del análisis posterior.

• Pulsar «Empezar».

Identificación de bases:

La versión independiente de Dorado se utiliza para realizar la identificación de bases. Abrir una ventana del terminal e introducir los siguientes comandos:

dorado basecaller hac, 5mCG_5hmCG --kit-name SQK-NBD114-24 \
--secondary “no” -Y \
--reference {reference_fasta} {input_pod5_folder} \
| samtools view -e '[qs] >= {qscore_filter}' \
--output {out_pass_bam} \
--unoutput {out_fail_bam}

Notas:

• Recomendamos utilizar el modelo de gran precisión (HAC), en los ciclos de secuenciación de RRMS. No obstante, si utiliza el modelo de ultra precisión (SUP), compruebe que utiliza el modelo correcto en los comandos mencionados arriba.
• Es posible realizar la alineación durante la identificación de bases, con ayuda de un archivo FASTA. El archivo de referencia humana recomendado se encuentra disponible para descargar aquí.
• Las alineaciones secundarias se descartan mediante la opción «--secondary no» y se activa la opción Y, lo que permite un suave corte de alineaciones complementarias.
• Al proporcionar la opción «--kit-name SQK-NBD114.24», Dorado también clasificará las lecturas entre los diferentes códigos de barras presentes, con una etiqueta en el archivo BAM generado.
• Recomendamos ajustar el filtro Q score a 10.
• Tenga en cuenta, para identificar bases con Dorado es necesario el procesamiento en GPU. Encontrará más información sobre cómo ejecutar Dorado en el repositorio de GitHub.

Desmultiplexado

Dorado demux se utiliza para clasificar lecturas por código de barras mediante el siguiente comando:

dorado demux --no-classify --sort-bam --output-dir <out_folder> {out_pass_bam}

Notas:

• Este paso generará archivos BAM separados por cada uno de los códigos de barras posibles relacionados con el kit utilizado (por ejemplo SQK-NBD114-24).
• El recorte de adaptadores y códigos de barras se realizará por defecto en Dorado. Una vez recortados los códigos de barras, no es posible desmultiplexar las lecturas de nuevo.
• Encontrará más información en la documentación de Dorado.

El archivo .bed con las regiones utilizadas en RRMS se encuentra disponible en el catálogo AS.

Mosdepth se utiliza para comprobar la cobertura en regiones seleccionadas de los códigos de barras de interés:

mosdepth -x -t 8 -n -b {target_bed} {out_prefix} {input_pass_bam}

El flujo bioinformático de variación humana se utiliza para agregar modificaciones en posiciones genómicas mediante modkit.

El flujo de trabajo está disponible en el siguiente repositorio: wf-human-variation github.

La documentación se encuentra en el siguiente espacio: wf-human-variation EPI2ME page

Identificación de las modificaciones:

En la mayoría de los experimentos de RRMS recomendamos utilizar el siguiente comando:

nextflow run https://github.com/epi2me-labs/wf-human-variation \
-profile singularity \  
--mod \
--bam <bam> \
--bed RRMS_human_hg38.bed \
--ref GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fasta \
--sample_name <sample> --out_dir <output_dir>

(Opcional) En la metilación específica del haplotipo

Si se necesita metilación específica del haplotipo, es posible proporcionar opciones «--snp – phased» para agregar modificaciones identificadas en cada uno de los haplotipos (es decir, se generará un archivo BED de metilación para cada uno de los haplotipos):

nextflow run https://github.com/epi2me-labs/wf-human-variation \
-profile singularity \  
--mod --snp --phased \
--bam <bam> \
--bed RRMS_human_hg38.bed \
--ref GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fasta \
--sample_name <sample> --out_dir <output_dir>

Nota: en este análisis específico, recomendamos una cobertura de muestra superior a 30×.

«modkit dmr» sirve para detectar regiones diferencialmente metiladas a través de diferentes muestras.

Encontrará más información en la documentación de modkit.

Los archivos BAM generados por Dorado contienen bases canónicas así como modificaciones por lectura guardadas en etiquetas MM y ML (del archivo BAM). Para visualizar las modificaciones por lectura en IGV (Integrative Genomics Viewer), cargue el archivo BAM y seleccione «base modification 2-color (all)» en el menú «colour reads as».

Si se ha realizado la asignación de variantes a haplotipos mediante el flujo bioinformático wf-human-variation, es posible cargar el archivo BAM con etiquetas haplotípicas en IGV y agrupar las alineaciones por haplotipo mediante la opción «group by» y la selección de «phase».

En IGV también es posible visualizar las frecuencias de metilación por posición mediante el formato BIGWIG. Para ello, se utiliza modkit, que genera archivos BEDGRAPH mediante el siguiente comando:

modkit pileup --cpg --combine-strands --bedgraph \ 
--threads 10 --prefix {out_prefix} \  
--ref {reference_fasta} \ 
{out_folder} {input_pass_bam}

Tenga en cuenta que se creará un archivo BEDGRAPH diferente para cada una de las modificaciones presentes, en este caso 5mC y 5hmC.

BedGraphToBigWig se utiliza para generar archivos bigwig, que es posible cargar en IGV junto con el archivo BAM:

bedtools sort -i {out_folder}/{prefix}_m_CG0_combined.bedgraph | cut -f 1-4 > {out_folder}/{prefix}_m_CG0_combined_sort.bedgraph

bedGraphToBigWig {out_folder}/{prefix}_m_CG0_combined_sort.bedgraph {reference_chrSize} {out_mod_bed_agg_filt_bigwig}

Encontrará información sobre la evaluación comparativa del rendimiento de RRMS en muestras humanas, en el documento de rendimiento RRMS

Debido al prolongado tiempo de secuenciación y a los múltiples lavados de las celdas de flujo y recargas de bibliotecas, no recomendamos reutilizar las celdas de flujo utilizadas en este protocolo.

Reutilizar las celdas de flujo en experimentos posteriores tal vez dé como resultado que se generen datos insuficientes para el análisis.

También disponemos de una sección de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat en directo de la comunidad Nanopore.

También disponemos de una sección de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live de la comunidad Nanopore.