Rapid Sequencing Kit V14 - gDNA (SQK-RAD114)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Rapid Sequencing Kit V14 - gDNA (SQK-RAD114) V RSE_9177_v114_revM_16Nov2022

The fastest and simplest protocol for genomic DNA involving:

  • ~10 mins library prep
  • Fragmentation
  • No third-party ligase needed
  • No PCR

This is an Early Access product For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

概览

The fastest and simplest protocol for genomic DNA involving:

  • ~10 mins library prep
  • Fragmentation
  • No third-party ligase needed
  • No PCR

This is an Early Access product For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

For Research Use Only

Document version: RSE_9177_v114_revM_16Nov2022

1. Overview of the protocol

重要

本试剂盒为早期试用产品

如需有关早期试用计划的更多信息，请参阅 本文了解产品的不同发布阶段。

请确保您始终使用最新版本的实验指南。

Introduction to Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)

This protocol describes the step-by-step instructions to complete a rapid sequencing of genomic DNA using the Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114). This protocol uses our most recent Kit 14 chemistry and is optimised for a fast library preparation and requires minimal laboratory equipment.

It is highly recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity using the Input DNA/RNA QC protocol.
    The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • If not already installed, download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell(s) to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

You will need to:

Library preparation step Process Time Stop option
Tagmentation Tagment your DNA using the Fragmentation Mix 5 minutes -
Adapter attachment Attach sequencing adapters to the DNA ends 5 minutes We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes -

RAD004 workflow

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and basecall reads.
  • Optional: Start the EPI2ME software and select a workflow for further analysis, e.g. metagenomic analysis or drug resistance mapping.
重要

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

材料
  • 100-150 ng high molecular weight genomic DNA
  • Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)
耗材
  • MinION 和 GridION测序芯片
  • （非必需）牛血清白蛋白（BSA）（50 mg/mL）（例如 Invitrogen™ UltraPure™ BSA （50 mg/mL）， AM2616）
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes
仪器
  • MinION 或 GridION 测序仪
  • MinION 及GridION 测序芯片遮光片
  • Microfuge
  • P1000 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2移液枪和枪头
  • Timer
  • 热循环仪或恒温加热仪
可选仪器
  • Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）

For this protocol, you will need ~100 ng high molecular weight genomic DNA.

Lower inputs can be used but sequencing output will be reduced.

起始DNA

DNA质控

选择符合质量和浓度要求的起始DNA至关重要的。使用过少或过多的DNA，或者质量较差的DNA（如，高度碎片化、含有RNA或化学污染物的DNA）都会影响文库制备。

有关如何对DNA样品进行质控，请参考起始DNA/RNA质控实验指南 。

化学污染物

从原始样本中提取DNA的方法不同，可能会导致经纯化的DNA中所残留的化学污染物不同。这会影响文库的制备效率和测序质量。请在牛津纳米孔社区的 Contaminants（污染物）页面 了解更多信息。

第三方试剂

Oxford Nanopore Technologies推荐您使用本实验指南中提及的所有第三方试剂，并已对其加以验证。我们尚未对其它替代试剂进行测试。

我们建议您按制造商说明准备待用的第三方试剂.

测序芯片质检

我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到MinION /GridION /PremethION测序芯片12周之内进行，或者在您收到Flongle测序芯片四周内进行。Oxford Nanopore Technologies会对活性孔数量少于以下标准的芯片进行替换** ：

测序芯片 芯片上的活性孔数确保不少于
Flongle 测序芯片 50
MinION/GridION 测序芯片 800
PromethION 测序芯片 5000

** 请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于Oxford Nanopore Technologies推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两天内递交给我们。请您按照 测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。

Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114) contents

Note: We are in the process of reformatting our kits with single-use tubes into a bottle format.

Single-use tubes format:

RAD114 tubes


Bottle format:

RAD114 bottle

3. Library preparation

材料
  • 100-150 ng high molecular weight genomic DNA
  • 快速测序文库接头（RA）
  • Adapter Buffer (ADB)
  • Fragmentation Mix (FRA)
耗材
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes
仪器
  • 热循环仪或恒温加热仪
  • P2移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
CHECKPOINT

测序芯片质检

我们强烈建议您在开始文库制备前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检，以确保测序实验顺利运行。

详情请参阅 MinKNOW 实验指南中的 测序芯片质检说明。

Thaw the kit components at room temperature, spin down briefly using a microfuge and mix by pipetting as indicated by the table below:

Reagent 1. Thaw at room temperature 2. Briefly spin down 3. Mix well by pipetting
Fragmentation Mix (FRA) Not frozen ✓ ✓
Rapid Adapter (RA) Not frozen ✓ ✓
Adapter Buffer (ADB) Not frozen ✓ ✓

Once thawed, keep all the kit components on ice.

Prepare the DNA in nuclease-free water.

  • Transfer 100-150 ng genomic DNA into a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
  • Adjust the volume to 10 µl with nuclease-free water
  • Mix by flicking the tube to avoid unwanted shearing
  • Spin down briefly in a microfuge

In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:

Reagent Volume
100-150 ng template DNA 10 μl
Fragmentation Mix (FRA) 1 μl
Total 11 μl

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Incubate the tube at 30°C for 2 minutes and then at 80°C for 2 minutes. Briefly put the tube on ice to cool it down.

CHECKPOINT

The tagmented DNA in 11 μl is taken into the adapter attachment step.

In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, dilute the Rapid Adapter (RA) as follows and pipette mix:

Reagents Volume
Rapid Adapter (RA) 1.5 μl
Adapter Buffer (ADB) 3.5 μl
Total 5 μl

Add 1 μl of diluted Rapid Adapter (RA) to the tagmented DNA.

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Incubate the reaction for 5 minutes at room temperature.

步骤结束

The prepared DNA library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice until ready to load.

4. Priming and loading the MinION and GridION Flow Cell

材料
  • 测序芯片冲洗液（FCF）
  • 测序芯片系绳（FCT）
  • 文库溶液（LIS）
  • 文库颗粒（LIB）
  • 测序缓冲液（SB）
耗材
  • MinION 和 GridION测序芯片
  • （非必需）牛血清白蛋白（BSA）（50 mg/mL）（例如 Invitrogen™ UltraPure™ BSA （50 mg/mL）， AM2616）
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
  • MinION 或 GridION 测序仪
  • MinION 及GridION 测序芯片遮光片
  • P1000 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
重要

请注意：本试剂盒仅兼容R10.4.1测序芯片（FLO-MIN114）。

提示

测序芯片的预处理及上样

我们建议所有新用户在首次运行测序芯片前，观看视频测序芯片的预处理及上样。

于室温下解冻测序缓冲液（SB）、文库颗粒（LIB）或文库溶液（LIS）、测序芯片系绳（FCT）和一管测序芯片冲洗液（FCF）。完全解冻后，涡旋振荡混匀，然后瞬时离心并置于冰上。

重要

为在MinION及GridION R10.4.1测序芯片（FLO-MIN114）上获得最优的测序表现并提高测序产出，我们推荐您向测序芯片预处理液中加入终浓度为0.2 mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）。

请注意： 我们不推荐使用其它类型的白蛋白（例如重组人血清白蛋白）。

按下表制备测序芯片的预处理液，室温下吹打混匀。

请注意： 我们正在将部分试剂的包装形式由单次管装改为瓶装。请按照与您所用试剂盒包装相对应的说明操作。

单次使用管装： 向一整管测序芯片冲洗液（FCF）中加入5µl 50mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）及 30µl 测序芯片系绳（FCT）。

瓶装： 请另拿一支适当体积的离心管制备测序芯片预处理液：

试剂 体积（每张芯片）
测序芯片冲洗液 (FCF) 1,170 µl
50mg/ml的牛血清白蛋白 (BSA) 5 µl
测序芯片系绳 (FCT) 30 µl
总体积 1,205 µl

打开MinION或GridION测序仪的盖子，将测序芯片插入金属固定夹的下方。用力向下按压芯片，以确保正确的热、电接触。

中文-测序芯片预处理上样1a

中文-测序芯片预处理上样1b

可选操作

为文库上样前，完成测序芯片检测，查看可用孔数目。

如此前已对测序芯片进行过质检，则此步骤可省略。

更多信息，请查看MinKNOW实验手册的 测序芯片质检 部分。

顺时针转动预处理孔孔盖，使预处理孔显露出来。

中文-测序芯片预处理上样2

重要

从测序芯片中反旋排出缓冲液。请勿吸出超过20-30µl的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。

将预处理孔打开后，检查孔周围是否有小气泡。请按照以下方法，从孔中排出少量液体以清除气泡：

  1. 将P1000移液枪转至200µl刻度。
  2. 将枪头垂直插入预处理孔中。
  3. 反向转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在220-230 µl之间，或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。
    __请注意：__ 肉眼检查，确保从预处理孔到传感器阵列的缓冲液连续且无气泡。

中文-测序芯片预处理上样3

通过预处理孔向芯片中加入800µl预处理液，避免引入气泡。等待5分钟。在此期间，请按照以下步骤准备用于上样的DNA文库。

中文-测序芯片预处理上样4

重要

LIB管内的文库颗粒分散于悬浮液中。由于颗粒沉降速度非常快，因此请在混匀颗粒后立即使用。

对于大多数测序实验，我们建议您使用文库颗粒（LIB）。但如文库较为粘稠，您可考虑使用文库溶液（LIS）。

将含有文库颗粒的LIB管用移液枪吹打混匀。

在一支新的1.5ml Eppendorf LoBind离心管中，按下表所示准备上样文库：

试剂 体积（每张测序芯片）
测序缓冲液（SB） 37.5 µl
文库颗粒（LIB），使用前即时混匀；或文库溶液（LIS） 25.5 µl
DNA文库 12 µl
总体积 75 µl

完成测序芯片的预处理：

  1. 轻轻地翻起SpotON上样孔盖，使SpotON上样孔显露出来。 中文-测序芯片预处理上样5
  2. 通过预处理孔（而 非 SpotON加样孔）向芯片中加入200µl预处理液，避免引入气泡。 中文-测序芯片预处理上样6

临上样前，用移液枪轻轻吹打混匀制备好的文库。

通过SpotON加样孔向芯片中逐滴加入75µl样品。确保液滴流入孔内后，再加下一滴。

中文-测序芯片预处理上样7

轻轻合上SpotON加样孔孔盖，确保塞头塞入加样孔内。逆时针转动预处理孔孔盖，盖上预处理孔。

中文-测序芯片预处理上样8

中文-测序芯片预处理上样9

重要

为获得最佳测序产出，在文库样本上样后，请立即在测序芯片上安装遮光片。

我们建议在清洗芯片并重新上样时，将遮光片保留在测序芯片上。一旦文库从测序芯片中吸出，即可取下遮光片。

按下述步骤安装测序芯片遮光片：

  1. 小心将遮光片的前沿（平端）与金属固定夹的边沿对齐。 请注意： 请勿将遮光片强行压到固定夹下方。

  2. 将遮光片轻轻盖在测序芯片上。遮光片的SpotON加样孔孔盖缺口应与芯片上的SpotON加样孔孔盖接合，遮盖住整个测序芯片的前部。

MinION加装遮光片

注意

MinION测序芯片的遮光片并非固定在测序芯片上，因此当为芯片加装遮光片后，请小心操作。

步骤结束

小心合上测序设备上盖并在MinKNOW上设置测序实验。

5. 数据采集和碱基识别

如何开始测序

在完成测序芯片的加样后，您即可在MinKNOW中启动测序实验。MinKNOW 软件负责仪器控制、数据采集以及实时碱基识别。有关设置和使用 MinKNOW 的详细信息，请参阅MinKNOW 实验指南。

您可以通过多种方式使用并设置MinKNOW：

  • 在直接或远程连接到测序设备的计算机上。
  • 直接在 GridION、MinION Mk1C 或 PromethION 24/48 测序设备上。

有关在测序设备上使用 MinKNOW 的更多信息，请参阅相应设备的用户手册：

在MinKNOW中启动测序：

1. 在 "开始 "（Start）页面上，选择 __开始测序__（Start Sequencing)。 start

2. 输入实验详情：例如实验名称，测序芯片位置及样本ID。 Grid start seq

3. 在"试剂盒"页面上，选择建库试剂盒。 kit selection

4. 配置测序实验参数，或保持“运行选项”和“分析”页面中的默认设置。

请注意： 如果在设置运行参数时关闭了碱基识别，您可在实验结束后，在MinKNOW中运行线下碱基识别。详情请参阅MinKNOW实验指南。

5. 在“输出”页面中，设置输出参数或保持默认设置。 step5c

6. 单击 "参数确认" 页面上的 开始 启动测序。 Step6

测序后数据分析

当于MinKNOW上完成测序后，您可按照“测序芯片的重复利用及回收”一节中的说明重复使用或返还测序芯片。

完成测序和碱基识别后，即可进行数据分析。有关碱基识别和后续分析选项的详细信息，请参阅数据分析文档。

在下游分析部分，我们将概述更多用于数据分析的选项。

6. 测序芯片的重复利用及回收

材料
  • 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）

完成测序实验后，如您希望再次使用测序芯片，请按照测序芯片清洗试剂盒的说明进行操作，并将清洗后的芯片置于2-8℃保存。

您可在纳米孔社区获取 测序芯片清洗试剂盒实验指南。

提示

我们建议您在停止测序实验后尽快清洗测序芯片。如若无法实现，请将芯片留在测序设备上，于下一日清洗。

请按照“回收程序”清洗好芯片，以便送回Oxford Nanopore。

您可在 此处找到回收测序芯片的说明。

请注意： 在将测序芯片寄回之前，请使用去离子水对每张芯片进行冲洗。

重要

如果您遇到问题或对测序实验有疑问，请参阅本实验指南在线版本中的“疑难解答指南”一节。

7. 下游分析

下游分析

您可以选择以下几个途径来进一步分析经过碱基识别的数据：

1. EPI2ME 工作流程

Oxford Nanopore Technologies通过EPI2ME Labs平台提供了一系列针对高阶数据分析的生物信息学教程和工作流程。上述资源汇总于纳米孔社区的 EPI2ME Labs 板块。该平台通过描述性文字、生物信息学代码和示例数据，具象化地展示出我们的研究和应用团队发布在 GitHub 上的工作流程。

2. 科研分析工具

Oxford Nanopore Technologies的研发部门开发了许多分析工具，您可在Oxford Nanopore的 GitHub 资料库中找到。这些工具面向有一定经验的用户，并包含如何安装和运行软件的说明。工具以源代码形式提供，因此我们仅提供有限的技术支持。

3. 纳米孔社区用户开发的分析工具

如果以上工具仍无法为您提供解决研究问题的分析方法，请参考资源中心的生物信息学板块。该板块汇总了许多由纳米孔社区成员开发、且在Github上开源的、针对纳米孔数据的生信分析工具。请注意，Oxford Nanopore Technologies不为这些工具提供支持，也不能保证它们与测序所用的最新的化学试剂/软件配置兼容。

8. DNA/RNA提取和文库制备过程中可能出现的问题

以下表格列出了常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的“Support”板块 提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮(support@nanoporetech.com)）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们。

低质量样本

现象 可能原因 措施及备注
低纯度DNA（Nanodrop测定的DNA吸光度比值260/280<1.8，260/230 <2.0-2.2） 用户所使用的DNA提取方法未能达到所需纯度 您可在 污染物专题技术文档 中查看污染物对后续文库制备和测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法。

请考虑将样品再次用磁珠纯化。
RNA完整度低（RNA完整值（RIN）<9.5，或rRNA在电泳凝胶上的条带呈弥散状） RNA在提取过程中降解 请尝试其它 RNA 提取方法。您可在 RNA完整值专题技术文档 中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅 DNA/RNA 操作 页面。
RNA的片段长度短于预期 RNA在提取过程中降解 请尝试其它 RNA 提取方法。 您可在 RNA完整值专题技术文档中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅DNA/RNA 操作 页面。

我们建议用户在无RNA酶污染的环境中操作，并确保实验设备没有受RNA酶污染.

经AMPure磁珠纯化后的DNA回收率低

现象 可能原因 措施及备注
低回收率 AMPure磁珠量与样品量的比例低于预期，导致DNA因未被捕获而丢失 1. AMPure磁珠的沉降速度很快。因此临加入磁珠至样品前，请确保将磁珠重悬充分混匀。

2. 当AMPure磁珠量与样品量的比值低于0.4:1时，所有的DNA片段都会在纯化过程中丢失。
低回收率 DNA片段短于预期 AMPure磁珠量与样品量的比值越低，针对短片段的筛选就越严格。每次实验时，请先使用琼脂糖凝胶（或其他凝胶电泳方法）确定起始DNA的长度，并据此计算出合适的AMPure磁珠用量。 SPRI cleanup
末端修复后的DNA回收率低 清洗步骤所用乙醇的浓度低于70% 当乙醇浓度低于70%时，DNA会从磁珠上洗脱下来。请确保使用正确浓度的乙醇。

9. 在使用快速测序试剂盒测序的过程中，可能产生的问题

以下表格列出了常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的“Support”板块 提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮(support@nanoporetech.com)）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们。

Mux扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 纳米孔阵列中引入了气泡 在对通过质控的芯片进行预处理之前，请务必排出预处理孔附近的气泡。否则，气泡会进入纳米孔阵列对其造成不可逆转地损害。 视频中演示了避免引入气泡的最佳操作方法。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 测序芯片没有正确插入测序仪 停止测序，将芯片从测序仪中取出，再重新插入测序仪内。请确保测序芯片被牢固地嵌入测序仪中，且达到目标温度。如用户使用的是GridION/PromethION测序仪，也可尝试将芯片插入仪器的其它位置进行测序。
inKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 文库中残留的污染物对纳米孔造成损害或堵塞 在测序芯片质检阶段，我们用芯片储存缓冲液中的质控DNA分子来评估活性纳米孔的数量。而在测序开始时，我们使用DNA文库本身来评估活性纳米孔的数量。因此，活性纳米孔的数量在这两次评估中会有约10%的浮动。

如测序开始时报告的孔数明显降低，则可能是由于文库中的污染物对膜结构造成了损坏或将纳米孔堵塞。用户可能需要使用其它的DNA/RNA提取或纯化方法，以提高起始核酸的纯度。您可在 污染物专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法 。

MinKNOW脚本失败

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示 "Script failed”（脚本失败）
重启计算机及MinKNOW。如问题仍未得到解决，请收集 MinKNOW 日志文件 并联系我们的技术支持。 如您没有其他可用的测序设备，我们建议您先将装有文库的测序芯片置于4°C 储存，并联系我们的技术支持团队获取进一步储存上的建议。

纳米孔利用率低于40%

现象 可能原因 措施及备注
纳米孔利用率<40% 测序芯片中的文库量不足 请确保您按照相应实验指南，向MinION Mk1B/GridION测序芯片中加入正确浓度的优质测序文库。请在上样前对文库进行定量，并使用 Promega Biomath Calculator 等工具中的“ dsDNA：µg to pmol”功能来计算DNA分子的摩尔量。
纳米孔利用率接近0 尽管您使用了快速建库测序试剂盒 V14/快速条形码测序试剂盒V14，但测序接头并未与DNA连接 请务必严格遵照实验指南的操作步骤，并确保使用正确的试剂体积和孵育温度。您可制备Lambda对照文库来检验试剂的质量和有效性。
纳米孔利用率接近0 测序芯片中无系绳 系绳（FCT管）随预处理液加入芯片。因此在制备预处理液时，请确保将FCT加入测序芯片冲洗液（FCF）中。

读长短于预期

现象 可能原因 措施及备注
读长短于预期 DNA样本降解 读长反映了起始DNA片段的长度。起始DNA在提取和文库制备过程中均有可能被打断。

1. 1. 请查阅纳米孔社区中的 提取方法 以获得最佳DNA提取方案。

2. 在进行文库制备之前，请先跑电泳，查看起始DNA片段的长度分布。DNA gel2 在上图中，样本1为高分子量DNA，而样本2为降解样本。

3. 在制备文库的过程中，请避免使用吹打或/和涡旋振荡的方式来混合试剂。轻弹或上下颠倒离心管即可。

大量纳米孔处于不可用状态

现象 可能原因 Comments and actions
大量纳米孔处于不可用状态 (在通道面板和纳米孔活动状态图上以蓝色表示)

image2022-3-25 10-43-25 上方的纳米孔活动状态图显示：状态为不可用的纳米孔的比例随着测序进程而不断增加。		 样本中含有污染物 使用MinKNOW中的“Unblocking”（疏通）功能，可对一些污染物进行清除。 如疏通成功，纳米孔的状态会变为"测序孔". 若疏通后，状态为不可用的纳米孔的比例仍然很高甚至增加：

1. 用户可使用 测序芯片冲洗试剂盒（EXP-WSH004）进行核酸酶冲洗 can be performed, 操作，或
2. 使用PCR扩增目标片段，以稀释可能导致问题的污染物。

大量纳米孔处于失活状态

现象 可能原因 措施及备注
大量纳米孔处于失活状态（在通道面板和纳米孔活动状态图上以浅蓝色表示。膜结构或纳米孔遭受不可逆转地损伤） 测序芯片中引入了气泡 在芯片预处理和文库上样过程中引入的气泡会对纳米孔带来不可逆转地损害。请观看 测序芯片的预处理及上样 视频了解最佳操作方法。
大量纳米孔处于失活/不可用状态 文库中存在与DNA共纯化的化合物 与植物基因组DNA相关的多糖通常能与DNA一同纯化出来。

1. 请参考 植物叶片DNA提取方法。
2. 使用QIAGEN PowerClean Pro试剂盒进行纯化。
3. 利用QIAGEN REPLI-g试剂盒对原始gDNA样本进行全基因组扩增。
大量纳米孔处于失活/不可用状态 样本中含有污染物 您可在 污染物专题技术文档 中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法。

温度波动

现象 可能原因 措施及备注
温度波动 测序芯片和仪器接触不良 检查芯片背面的金属板是否有热垫覆盖。重新插入测序芯片，用力向下按压，以确保芯片的连接器引脚与测序仪牢固接触。如问题仍未得到解决，请联系我们的技术支持。

未能达到目标温度

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示“未能达到目标温度” 测序仪所处环境低于标准室温，或通风不良（以致芯片过热） MinKNOW会限定测序芯片达到目标温度的时间。当超过限定时间后，系统会显示出错信息，但测序实验仍会继续。值得注意的是，在错误温度下测序可能会导致通量和数据质量（Q值）降低。请调整测序仪的摆放位置，确保其置于室温下、通风良好的环境中后，再在MinKNOW中继续实验。有关MinION MK1B温度控制的更多信息，请参考此 FAQ （常见问题）文档。

Last updated: 11/11/2024

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MinION
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