Ligation sequencing V14 — single-cell transcriptomics with 5' cDNA prepared using 10X Genomics on PromethION (SQK-LSK114)

Oxford Nanopore Technologies
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PromethION: Protocol

Ligation sequencing V14 — single-cell transcriptomics with 5' cDNA prepared using 10X Genomics on PromethION (SQK-LSK114) V SST_9204_v114_revG_06Mar2024

Single-cell transcriptomics method:

  • Requires cDNA amplicons produced using the 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2)
  • Library preparation time ~135 minutes
  • High output
  • PCR required

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

概要

Single-cell transcriptomics method:

  • Requires cDNA amplicons produced using the 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2)
  • Library preparation time ~135 minutes
  • High output
  • PCR required

For Research Use Only

Document version: SST_9204_v114_revG_06Mar2024

1. Overview of the protocol

Introduction to the single-cell 5' transcriptomics protocol

This application allows the sequencing of full-length 5' cDNA transcripts, which provides a complete view of the expressed isoforms and allows detection of alternative splicing and fusion events in individual cells. Additionally, it enables the detection of SNPs anywhere in the transcript, as well as identification of cell sub-types in a population based on isoform expression levels.

This protocol describes how to carry out sequencing of cDNA from single cells using the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114). You will need to have reverse-transcribed single-cell mRNA into cDNA using the 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2) before performing PCR amplification of your cDNA with custom-ordered oligos. Finally, a standard Ligation Sequencing Kit V14 library preparation is completed to prepare the cDNA ends for sequencing on a PromethION device.

This is an optimised protocol adapted from our Ligation sequencing V14 - Single-cell transcriptomics with 3' cDNA prepared using 10X Genomics on PromethION (SQK-LSK114) protocol.
The original 3' protocol was adapted from Lebrigand, K., Magnone, V., Barbry, P. et al. High throughput error corrected Nanopore single cell transcriptome sequencing. Nat Commun 11, 4025 (2020) to sequence full-length transcripts, deplete cDNA synthesis artifacts and to correct for strand bias.

Note: This protocol is compatible and fully supported with the 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2).
For the 10X Genomics Next GEM Single Cell 3' Kit (V3.1), please visit our Ligation sequencing V14 - Single-cell transcriptomics with 3' cDNA prepared using 10X Genomics on PromethION (SQK-LSK114) protocol.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Have previously prepared single-cell cDNA using the 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2). The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents.
  • Download the MinKNOW software for acquiring and analysing your data.
  • Perform a flow cell check to ensure it has enough pores for a good sequencing run.

Library preparation
Protocol step Process Time Stop option
PCR amplification Amplify your cDNA by PCR 80 minutes -
End-prep Prepare the cDNA ends for adapter attachment 30 minutes 4°C overnight
Adapter ligation and clean-up Attach sequencing adapters to the cDNA 20 minutes 4°C for short-term storage or for repeated use, such as for reloading your flow cell
–80°C for long-term storage
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and basecall the reads.
  • Analyse the data using the EPI2ME wf-single-cell pipeline.
重要

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

材料
  • 10 ng of cDNA amplicons prepared using 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kits (V2)
  • Custom-ordered oligo at 10 μM: Fwd_3580_partial_read1_defined_for_5'_cDNA (sequence provided below)
  • Custom-ordered oligo at 10 μM: Rev_PR2_partial_TSO_defined_for_5'_cDNA (sequence provided below)
  • Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
消耗品
  • PromethION Flow Cell (FLO-PRO114M)
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • NEBNext® Ultra II End Repair / dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
  • Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
  • Agilent Technologies DNA 12000 Kit
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 15 ml Falcon tubes
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • PromethION Flow Cell Light Shield
  • PromethION device
  • Agilent Bioanalyzer (or equivalent)
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • Magnetic rack (e.g. Invitrogen DynaMag-2 Magnet, Cat # 12321D)
  • 小型遠心機
  • ボルテックスミキサー
  • Thermal cycler
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットとチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 ピペットとチップ
  • アイスバケツ（氷入り）
  • タイマー
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）

For this protocol, you will need 10 ng amplified cDNA amplicons prepared using 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kits (V2).

重要

10X Genomics kits

Note: This protocol is compatible and fully supported with 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2).

The 10X Genomics Next GEM Single Cell 3' Kit (V3.1) is compatible with our Ligation sequencing V14 - Single-cell transcriptomics with 3' cDNA prepared using 10X Genomics on PromethION (SQK-LSK114) protocol.
The Visium Spatial Gene Expression Kit is also compatible with the 3' method, but has not been validated by our internal teams.

Custom-ordered oligo sequences

Order the following HPLC-purified oligos at 100 μM, and dilute to 10 μM in TE buffer for use in the PCR amplification step of the library prep.

Name Sequence
Fwd_3580_partial_read1_defined_for_5'_cDNA 5'-/5phos/ACTTGCCTGTCGC
TCTATCTTCCTACACGA
CGCTCTTCCGATCT-3'
Rev_PR2_partial_TSO_defined_for_5'_cDNA 5'-/5phos/TTTCTGTTGGTGC
TGATATTGCAAGCAGTG
GTATCAACGCAGAG-3'

AMPure XP beads

Extra AMPure XP Beads will be required for the first steps when preparing the cDNA amplicons. From the end-prep step, the AMPure XP Beads (AXP) from the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) can be used.

インプットDNA

インプットDNAのQC方法

インプットDNAの量と品質の要件を満たすことが重要です。DNAの使用量が少なすぎたり多すぎたり、あるいは品質の低いDNA（例としてDNAが非常に断片化されていたり、RNAや化学汚染物質が含まれている場合など）を使用すると、ライブラリーの調製に影響を及ぼす可能性があります。

DNAサンプルの品質管理の方法については、Input DNA/RNA QC protocolのプロトコルをご覧ください。

コンタミネーション

DNAの抽出する方法によっては、精製DNAに特定の化学汚染物質が残留する可能性があり、ライブラリ調製の効率やシークエンシングの品質に影響を及ぼす可能性があります。コンタミネーションについての詳細は、コミュニティーの Contaminants page をご覧ください。

サードパーティー試薬

このプロトコールで使用されているすべてのサードパーティー試薬は、当社が検証し、使用を推奨しているものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以外の試薬を用いたテストは行っていません。

すべてのサードパーティ製試薬については、製造元の指示に従って使用の準備をすることをお勧めします。

フローセルのチェックをしてください

シークエンシング実験を開始する前に、フローセルのポアの数を確認することを強くお勧めします。このフローセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの場合は代理店への到着から１２週間以内に行ってください。またはFlongle Flow Cellの場合は代理店への到着から4週間以内に行う必要があります。Oxford Nanopore Technologiesは、フローセルチェックの実施から2日以内に結果が報告され、推奨される保管方法に従っていた場合に、以下の表に記載されているナノポアの有効数に満たさない場合には、フローセルを交換します。 フローセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指示に従ってください。

Flow cell 保証する最小有効ポア数（以下の数未満のフローセルが交換対象となります）
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000

Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) のコンテンツ

（注： 現在のキットの容器を変更しています。今までは実験毎に使い捨てのシングルユーズチューブを使用していましたが、バッファー単位のボトル容器に変更しています。

シングルユースチューブの場合: SQK-LSK114 v2

ボトル容器の場合: SQK-LSK114 v3

（注： 本製品には、Beckman Coulter、Inc.製のAMPure XP試薬が含まれており、試薬の安定性を損なうことなくキットと共に-20 ° Cで保存することができます。

（注： DNA Control Sample（DCS）は3.6kbのアンプリコンで、Lambda genomeの3'末端をマッピングしたプレップコントロールです。

3. PCR amplification

材料
  • 10 ng of cDNA amplicons prepared using 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kits (V2)
  • Custom-ordered oligo at 10 μM: Fwd_3580_partial_read1_defined_for_5'_cDNA (sequence provided in Equipment and Consumables)
  • Custom-ordered oligo at 10 μM: Rev_PR2_partial_TSO_defined_for_5'_cDNA (sequence provided in Equipment and Consumables)
消耗品
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™ cat # A63881)
  • Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
  • Agilent Technologies DNA 12000 Kit
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat #AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • サーマルサイクラー
  • Microfuge
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • Magnetic rack (e.g. Invitrogen DynaMag-2 Magnet, Cat # 12321D)
  • Ice bucket with ice
  • P1000 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • P100 pipette and tips
  • P20 pipette and tips
  • P2 pipette and tips
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）
オプション装置
  • Agilent Bioanalyzer (or equivalent)
CHECKPOINT

フローセルのチェックを行ってください。

ライブラリー調製を開始する前にフローセルチェックを行い、良好なシークエンスランに十分なポアを持つフローセルを使用することをお勧めします。

詳細については、MinKNOWプロトコルのflow cell check instructions を参照してください。

Prepare the cDNA amplicons in nuclease-free water:

  • Transfer 10 ng of cDNA amplicons into a 0.2 ml thin-walled PCR tube.
  • Adjust the volume to 21 µl with nuclease-free water.
  • Mix thoroughly by flicking the tube to avoid unwanted shearing.
  • Spin down briefly in a microfuge.

In the same 0.2 ml thin-walled PCR tube, set up the following reaction:

Reagent Stock Final Volume
cDNA template 0.48 ng/μl 0.2 ng/μl 21 μl
Fwd_3580_partial_read1_defined_for_5'_cDNA 10 μM 0.4 μM 2 μl
Rev_PR2_partial_TSO_defined_for_5'_cDNA 10 μM 0.4 μM 2 μl
LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix 2X 1X 25 μl
Total - - 50 μl

Mix by pipetting and spin down.

Amplify using the following cycling conditions:

Cycle step Temperature Ramp rate Time No. of cycles
Initial denaturation 94°C max 3 min 1
Denaturation

Annealing ramp-down

Annealing

Extension		 94°C

66°C down to 58°C

58°C

65°C		 max

0.2°C/s

max

max		 30 sec

40 sec

50 sec

6 mins

8
Final extension 65°C max 10 min 1
Hold 4°C - ∞ -

Below is a schematic of the cycling conditions. 5- 10X PCR conditions edit

Transfer the sample to a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 40 µl of resuspended AMPure XP beads to the reaction and mix by flicking the tube.

Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）で5分間インキュベートします（常温）。

新鮮な80％エタノールをヌクレアーゼフリー水で500μl用意します。

Spin down the samples and pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless. Keep the tubes on the magnet and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol in nuclease-free water without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repeat the previous step.

Briefly spin down and place the tubes back on the magnet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for 30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 15 µl nuclease-free water. Spin down and incubate for 2 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 15 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Dispose of the pelleted beads

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer - recovery aim >50 ng total.

Quantify 200 fmol of cDNA from the average fragment size identified using an Agilent Bioanalyzer.

Alternatively, assume an average fragment size of 1 kbp.

5- post PCR Frag analyser

Figure: Example amplicon fragment length distribution: 3 biological replicates of 5' cDNA from PBMCs prepared using the 10x genomics 5' gene expression v2 kit, processed using the Oxford Nanopore Technologies 5' 10x cDNA protocol. Here the amplicons have been analysed using the Agilent Bioanalyzer 2100 and DNA 12000 kit.

最終ステップ

Take forwards 200 fmol of cDNA amplicons into the end-prep step.

4. End-prep

材料
  • 200 fmol cDNA amplicons
  • AMPure XP Beads (AXP)
消耗品
  • NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
  • NEBNext® Ultra II End Prep Reaction Buffer from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチューブ
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • Thermal cycler
  • 小型遠心機
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • マグネットラック
  • アイスバケツ（氷入り）
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）

Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Ensure the reagents are well mixed.
    Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.

Transfer 200 fmol of cDNA amplicons into a clean 0.2 ml thin-walled PCR tube and adjust the volume to 50 µl with nuclease-free water.

In the same 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent Volume
cDNA amplicons 50 µl
Ultra II End-prep Reaction Buffer 7 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
Total 60 µl

反応液を完全に混合するために、ゆっくりとピペッティングし短時間スピンダウンして下さい。

サーマルサイクラーを使用して、初めに20℃で5分間インキュベートした後に、65℃で5分間インキュベートしてください。

DNA サンプルを清潔な 1.5 ml エッペンドルフ DNA LoBind チューブに移してください。

AMPure XP ビーズ（AXP）をボルテックスで懸濁します。

再懸濁したAMPure XP Beads (AXP) 60 µlをエンドプレップ反応に加え、チューブをフリッ クして混和します。

Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）で5分間インキュベートします（常温）。

新鮮な80％エタノールをヌクレアーゼフリー水で500μl用意します。

チューブをスピンダウンした後、マグネットラック上で、上清が無色透明になるまで置きます。チューブを磁石の上に置いたまま、上清をピペットで取り除いていきます。ピペットを使用してエタノールを除去し 、 廃棄してください。

チューブをマグネットの上に置き、ペレットを乱さないように、200 µl の新しく調製した 80% エタノールでビーズを洗浄します。

前のステップを繰り返します。

スピンダウンし、チューブをマグネットの上に戻します。残ったエタノールをピペットで取り除きます。ペレットを30 秒間程乾かします。 ただし、 ペレットにひびが入るまでは乾燥させないでください。

チューブをマグネットラックから取り出し、ペレットを61μlのヌクレアーゼフリー 水に懸濁します。室温で2分間インキュベートします。

溶出液が無色透明になるまで、少なくとも1分間マグネット上でビーズをペレット化します。

61μlの溶出液を除去し、清潔な1.5mlエッペンドルフDNA LoBindチューブに保持します。

CHECKPOINT

Qubit蛍光光度計を使用して、溶出したサンプル1 µlを定量します。

最終ステップ

エンドプレップと修復されたDNAをアダプターライゲーションのステップに進めます。なお、この時点でサンプルを4℃で一晩保存することも可能です。

5. Adapter ligation and clean-up

材料
  • Ligation Adapter (LA)
  • Ligation Buffer (LNB)
  • Short Fragment Buffer (SFB)
  • AMPure XP Beads (AXP)
  • Elution Buffer (EB)
消耗品
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • マグネットラック
  • Hula mixer (rotator mixer)
  • 小型遠心機
  • ボルテックスミキサー
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）
ヒント

Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467) の使用を推奨します。

Salt-T4® DNA Ligase（NEB, M0467）は別途購入するか、Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing用のNEBNext® Companion Module v2（カタログ番号E7672SまたはE7672L）に含まれています。

旧バージョンのNEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L)も使用することが出来ます。しかし、上記で推奨したv2モジュールを使用する事でより効率的なdA-tailingとligationを提供することが出来ます。

重要

推奨の他社製リガーゼ（ligase）には専用のバッファーが付属していますが、Ligation Sequencing Kitに付属のLigation Buffer (LNB)を使用した方が、Ligation Adapter (LA)のライゲーション効率が高くなります。

Ligation Adapter (LA) とSalt-T4® DNA Ligaseをスピンダウンし、氷上に置きます。

ライゲーションバッファー(LNB)を室温で融解し、スピンダウンしてピペッティングで混合します。粘性が高い為、この緩衝液をボルテックスするのは効果的ではないです。解凍して混ぜたら、すぐに氷の上に置いてください。

溶出バッファー（EB）を室温で融解し、ボルテックスで混合します。その後、スピンダウンして氷の上に置きます。

Thaw the Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

In a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, mix in the following order:

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent Volume
DNA sample from the previous step 60 µl
Ligation Adapter (LA) 5 µl
Ligation Buffer (LNB) 25 µl
Salt-T4® DNA Ligase 10 µl
Total 100 µl

反応液を完全に混合するために、ゆっくりとピペッティングし短時間スピンダウンして下さい。

反応液を室温で10分間インキュベートします。

AMPure XP ビーズ（AXP）をボルテックスで懸濁します。

再懸濁したAMPure XP Beads (AXP) 40 µlを加え、チューブをフリッ クして混和します。

Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）で5分間インキュベートします（常温）。

サンプルをスピンダウンし、マグネット上でペレット化します。チューブをマグネットの上に置き、無色透明になったら上清をピペットで取り除きます。

Wash the beads by adding 250 μl of Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.

Note: Take care when removing the supernatant, the viscosity of the buffer can contribute to loss of beads from the pellet.

前のステップを繰り返します。

スピンダウンし、チューブをマグネットの上に戻します。残った上清をピペットで取り除きます。ペレットを30 秒間程乾かします。 ただし、 ペレットにひびが入るまでは乾燥させないでください。

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 34 µl Elution Buffer (EB).

Spin the sample down briefly and incubate for 10 minutes at room temperature.

Note: For high molecular weight DNA, incubating at 37°C can improve the recovery of long fragments.

溶出液が無色透明になるまで、少なくとも1分間マグネット上でビーズをペレット化します。

Remove and retain 34 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

Prepare 50–100 fmol of your final library to 32 µl with Elution Buffer (EB).

Alternatively, assume an average fragment length of 1 kbp and proceed with 33 ng of library.

Note: If your DNA library is below the required concentration, take forward the full volume of 32 µl eluted DNA for sequencing.

Caution: Please note, very low recovery could be indicative of library preparation failiure.

If required, we recommend using a mass to mol calculator such as the NEB calculator.

重要

We recommend loading 50–100 fmol of this final prepared library onto the R10.4.1 flow cell.

Loading the recommended concentration onto the flow cell will ensure optimal pore occupancy for high sequencing output. Dilute the library in Elution Buffer if required.

最終ステップ

調製されたライブラリーは、フローセルへのロードに使用されます。ライブラリーは、ロードの準備ができるまで氷上、または4℃で保存して下さい。

ヒント

推奨のライブラリー保存方法

短期間の保存や繰り返し使用する場合は__（例　フローセルをウオッシュして再度ロードする場合）は、ライブラリーをEppendorf DNA LoBindチューブに入れ、__4℃で保存 することをお勧めします。 __3か月以上の長期保存の場合は、____ライブラリーをEppendorf DNA LoBindチューブに -80 ° Cで保存 することをお勧めします。

6. PromethIONフローセルのプライミングとローディング

材料
  • Sequencing Buffer (SB)
  • Library Beads (LIB)
  • Library Solution (LIS)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Flow Cell Flush (FCF)
消耗品
  • PromethION Flow Cell
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装置
  • PromethION device
  • PromethION Flow Cell Light Shield
  • P1000 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • P20 pipette and tips
重要

This kit is only compatible with R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M).

Sequencing Buffer（SB）、Library Beads（LIB）またはLibrary Solution（LISを使用する場合のみ）、Flow Cell Tether（FCT）およびFlow Cell Flush（FCF）を室温で融解してから、ボルテックスで混合します。その後、スピンダウンして氷上で保存します。

フローセルプライミングミックスを調製するには、フローセルテザー（FCT）とフローセルフラッシュ（FCF）を以下の指示通りに混合してください。その後に、室温でボルテックスして混合してください。

注） 現在、使い捨てチューブを使用したキットをボトル型にフォーマット変更中です。ご使用のキットのフォーマットに従ってください。

シングルユースチューブの場合: 30μlのFlow Cell Tether（FCT）をFlow Cell Flush（FCF）チューブに直接加えてください。

ボトルフォーマットの場合: フローセルの数に適したチューブに、以下の試薬を入れてくださいs:

試薬 フローセルあたりの容量
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
合計 1,200 µl
重要

冷蔵庫からフローセルを取り出した後にフローセルが室温に戻るまで20分待ってからPromethIONに差し込んでください。湿度の高い環境ではフローセルに結露が生じることがあります。フローセルの上面と下面にある金色のコネクターピンに結露がないかを点検し、結露が確認された場合はリントフリーのウェットティッシュで拭き取ってください。フローセル下面にヒートパッド（黒いパッド）があることを確認してください。

PromethION 2 Soloの場合、フローセルは以下のようにセットします

  1. フローセルを金属プレートの上に平らに置きます。

  2. フローセルを、金色のピンまたは緑色の基板が見えなくなるまでドッキングポートにスライドさせます。

J2068 FC-into-P2-animation V5

PromethION 24/48 の場合は、フローセルをドッキングポートにセットします

  1. フローセルとコネクターを水平および垂直に並べてから、所定の位置にスムーズに挿入してください。
  2. フローセルをしっかりと押し下げ、ラッチがかみ合い、カチッと音がして所定の位置に収まることを確認します。

Step 1a V3

Step 1B

重要

フローセルを誤った角度で挿入すると、PromethIONのピンが損傷し、シーケンス結果に影響を及ぼす可能性があります。PromethIONのピンが損傷している場合は、support@nanoporetech.com までご連絡ください。

Screenshot 2021-04-08 at 12.08.37

インレットポートカバーを時計回りにスライドさせて開きます。

Prom loading 2

重要

フローセルからバッファーを引き上げる際には注意してください。20～30μl以上は除去せず、ポアのアレイ全体が常にバッファーで覆われていることを確認して下さい。アレイに気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。

インレットポートを開けた後、少量ずつ引き戻して気泡を取り除きます：

  1. P1000ピペットチップを200µlにセットします。
  2. チップをインレットポートに挿入します。
  3. ダイヤルが220～230µlを示すまで、またはピペットチップに少量のバッファ ーが入るのが確認できるまで、ホイールを回します。

Step 3 v1

気泡が入らないように、500 µl のプライミングミックスをインレットポートからフローセルに注入し、５分間待ちます。この間に、プロトコールの次のステップでライブラリーをロードする準備をしてください。

Step 4 v1

Library Beads(LIB)の液をピペッティングすることで十分に混合して下さい。

重要

Library Beads（LIB）チューブにはビーズの懸濁液が入っています。これらのビーズはすぐに沈殿するので、使用直前に混合することが重要です。

ほとんどのシーケンス実験にはLibrary Beads （LIB）の使用を推奨します。しかし、より粘性の高いライブラリーにはLibrary Solution（LIS）を使ってください。

新しい1.5mlのEppendorf DNA LoBindチューブに、以下のようにしてライブラリーをロードする準備をしてください

試薬 フローセルあたりの容量
Sequencing Buffer (SB) 100 µl
Library Beads (LIB) thoroughly mixed before use, or Library Solution (LIS) 68 µl
DNA library 32 µl
合計 200 µl

注） アレイカバレッジを向上させるため、ライブラリーのローディング量を増やしました。

500μlのプライミングミックスをインレットポートにゆっくりと注入し、フローセルのプライミングを完了します。

Step 5 v1

調製したライブラリーは、ロードする直前にピペッティング混合して下さい。

P1000ピペットを使用して、インレットポートに200µlのライブラリーを注入します。

Step 6 v1

インレットポートを密閉するためにバルブを閉じます。

Step 7 V2

重要

最適なシークエンス出力を得るために、ライブラリーがロードされたすぐにライトシールドをフローセルに取り付けてください。

ライブラリーがフローセル上にある状態では（ウォッシングやリロードのステップを含める）、フローセルにライトシールドを付けたままにしておくことを推奨します。ライトシールドは、ライブラリーがフローセルから除去された時点で取り外すことができます。

ライトシールドがフローセルから取り外されている場合は、以下のようにライトシールドを取り付けます

  1. ライトシールドとインレットポートをフローセルのインレットポートカバーに合わせます。ライトシールドの前縁をフローセルIDの上に位置するようにします。
  2. ライトシールドをインレットポートカバーの周囲にしっかりと押し付けます。インレットポートクリップがインレットポートカバーの下にカチッとはまるようになっています。

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8a FAW

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8b FAW

最終ステップ

MinKNOWでシーケンスランを開始する準備ができたら、PromethIONの蓋を閉めてください。

フローセルをPromethIONにロードした後、実験を開始する前に最低10分間待ちます。この待ち時間があることで、よりシーケンス出力が向上します。

7. Data acquisition and basecalling

How to start sequencing

Once you have loaded your flow cell, the sequencing run can be started on MinKNOW, our sequencing software that controls the device, data acquisition and real-time basecalling. For more detailed information on setting up and using MinKNOW, please see the MinKNOW protocol.

MinKNOW can be used and set up to sequence in multiple ways:

  • On a computer either direcly or remotely connected to a sequencing device.
  • Directly on a PromethION 24/48 sequencing device.

For more information on using MinKNOW on a sequencing device, please see the device user manuals:

Open the MinKNOW software using the desktop shortcut and log into the MinKNOW software using your Community credentials.

Click on your connected device.

prom 48

Set up a sequencing run by clicking Start sequencing.

Edit 1

Type in the experiment name, select the flow cell postition and enter sample ID. Choose FLO-PRO114M flow cell type from the drop-down menu.

Click Continue to kit selection.

Flow cell selection

Select the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114).

An expansion kit does not need to be selected.

Click Continue to Run Options to continue.

kit selection

Set the run options to a 72 hour run length and 200 bp minimum read length.

Click Continue to basecalling to continue.

Edit 4

Set up basecalling using the following parameters:

  1. Ensure the basecalling is switched ON.
  2. Next to "Models", click Edit options and choose High-accuracy baseceller (HAC) from the drop-down menu.
  3. Ensure barcoding is OFF.

Click Continue to output and continue.

Analysis run setup 5- 10X

Keep the output format and filtering options to their default settings.

However, .fast5 output can be used if you cannot use .pod5 output files.

Click Continue to final review to continue.

output setting

Click Start to start sequencing.

You will be automatically navigated to the Sequencing Overview page to monitor the sequencing run.

Overview run 5- 10X

Data analysis after sequencing

After sequencing has completed on MinKNOW, the flow cell can be reused or returned, as outlined in the Flow cell reuse and returns section.

After sequencing and basecalling, the data can be analysed, as outlined in the Downstream analysis section.

8. Flow cell reuse and returns

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

シークエンス実験終了後、フローセルを再利用する場合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコールに従い、洗浄したフローセルを2～8℃で保管してください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティーで入手できます。

または、返送手順に従って、オックスフォード・ナノポアに返送してください。

フローセルの返却方法は hereをご覧ください。

(注： 製品を返却する前に、すべてのフローセルを脱イオン水で洗浄する必要があります。

重要

シークエンシング実験に関して問題が発生した場合や質問がある場合には、このプロトコルのオンライン版にあるトラブルシューティングガイドを参照してください。

9. Downstream analysis

EPI2ME provides a Nextflow-based workflow for the analysis of single-cell sequencing data.

The workflow, wf-single-cell, processes the FASTQ format sequence data prepared by the MinKNOW software. The workflow screens each sequence read for 10X cell barcode information and assigns reads to a cell of origin. A subset of sequences from “true” cells are dynamically filtered on the basis of the number of assigned sequence reads. These sequences are mapped to the reference genome, and tables of both gene and transcript abundance are prepared for each cell. These "cell barcode x gene" or transcript abundance information are used to prepare the familiar UMAP plots that may show the stratification of the cell types present within the sample.

For more information on this workflow, follow the link to the GitHub documentation.

10. Issues during DNA extraction and library preparation

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

Low sample quality

Observation Possible cause Comments and actions
Low DNA purity (Nanodrop reading for DNA OD 260/280 is <1.8 and OD 260/230 is <2.0–2.2) The DNA extraction method does not provide the required purity The effects of contaminants are shown in the Contaminants document. Please try an alternative extraction method that does not result in contaminant carryover.

Consider performing an additional SPRI clean-up step.

AMPureビーズクリーンアップ後のDNA回収率が低い

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
低回収率 AMPureビーズとサンプルの比率が予想していたのよりも低いことによるDNAの損失 1. AMPureビーズはすぐに沈降するため、サンプルに添加する前によく再懸濁させてください。

2. AMPureビーズ対サンプル比が0.4:1未満の場合、どのようなサイズのDNA断片でもクリーンアップ中に失われます。
低回収率 DNA断片が予想よりも短い サンプルに対するAMPureビーズの比率が低いほど、短い断片に対する選択が厳しくなります。 アガロースゲル(または他のゲル電気泳動法)上でインプットDNAの長さを設定してから、使用するAMPureビーズの適切な量を計算してください。 SPRI cleanup
エンドプレップ後の収率が低い 洗浄ステップで使用したエタノール濃度が低い（70%未満）。 エタノールが70%未満の場合、DNAは洗浄中にビーズから溶出されます。必ず正しい濃度（％）のエタノールを使用してください。

11. Issues during the sequencing run

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

シークエンス開始時のポアがフローセルチェック後よりも少ない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ナノポアアレイに気泡が入ってしまった。 フローセルチェックをした後、フローセルをプライミングする前に、プライミングポート付近の気泡を取り除くことが必要です。 気泡を取り除かないと、気泡がナノポアアレイに移動し、空気に触れたたナノポアが不可逆的なダメージを負った可能性がある。これを防ぐための最適な方法が、 this videoで紹介されています。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 フローセルがデバイスに正しく挿入されていない。 シークエンスランを停止し、フローセルをシークエンス装置から取り出します。次に再度フローセルを挿入し、装置にしっかりと固定され、目標温度に達していることを確認します。GridIONやPromethIONの場合は別のフローセルの位置をお試しください。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ライブラリー内の汚染物質がポアを失活させたり塞いだりしている。 フローセルチェックの際のポア数は、フローセル保存バッファー中のQC用のDNA分子を用いて計測されます。シークエンシングの開始時は、ライブラリ自体を使用してアクティブなポア数を推定します。このため、フローセルチェックとRun開始時のポア数は、約10％程度の変動が起こります。シークエンシング開始時に報告されたポアの数が大幅に減少している場合は、ライブラリー中の汚染物質がメンブレンを損傷していたり、ポアをブロックしている可能性があります。インプット材料の純度を向上させるために、別のDNA/RNA抽出または精製方法が必要となる場合があります。コンタミネーションの影響は、Contaminants Know-how pieceを参照にして下さい。夾雑物を除去するために別の抽出方法extraction method をお試しください。

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
MinKNOW に 「Script failed」と表示されている"
コンピューターを再起動し、MinKNOWを再起動します。問題が解決しない場合は MinKNOW log files MinKNOWログファイルを収集し 、テクニカルサポートにご連絡ください。他のシークエンシングデバイスをお持ちでない場合は、 フローセルとロードしたライブラリーを4℃で保管することをお勧めします。詳細な保管方法については、テクニカルサポートにお問い合わせください。

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the sequencing kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents.
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FLT/FCT tube). Make sure FLT/FCT was added to FB/FCF before priming.

予想より短いリード長

問題点 予想される原因 解決策とコメント
予想より短いリード長 DNAサンプルの不要な断片化 読み取り長はサンプルDNA断片の長さを反映します。サンプルDNAは、抽出およびライブラリー調製中の操作で断片化した可能性があります。

1. 抽出の最適な方法については、Extraction Methods の抽出方法を参照してください。

2. ライブラリー調製に進む前に、アガロースゲル電気泳動で、サンプルDNAのフラグメント長の分布を確認してください。 DNA gel2 上の画像では、サンプル1は高分子量ですが、サンプル2は断片化されています。

3. ライブラリー調製中は、試薬を混合するためのピペッティングやボルテックス操作は、プロトコルで指示がないかぎり行わないでください。

利用できないポアの割合が多い場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
利用できないポアの割合が大きい（チャンネルパネルとポアのアクティブポートで青く表示されています）

image2022-3-25 10-43-25 上のアクティブなポアの図は、時間の経過とともに「利用できない」ポアの割合が増加していることを示しています。		 サンプル内に不純物が含まれている 一部のポアに吸着する不純物は、MinKNOWに組み込まれたポアのブロック解除機能によって、ポアから除去することができます。 このステップが完了すると、ポアの状態が「sequencing pore」に戻ります。利用できないポアの部分が多いか、増加した場合:

1.Flow Cell Wash Kit nuclease flush using the Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) を用いて、ヌクレアーゼ洗浄を 行うことができます。又は
2. PCRを数サイクル実行してサンプルDNAの量を増やし、サンプルDNAに含まれる問題の不純物が相対的に減る（希釈される）ようにします。

Large proportion of inactive pores

Observation Possible cause Comments and actions
Large proportion of inactive/unavailable pores (shown as light blue in the channels panel and pore activity plot. Pores or membranes are irreversibly damaged) Air bubbles have been introduced into the flow cell Air bubbles introduced through flow cell priming and library loading can irreversibly damage the pores. Watch the Priming and loading your flow cell video for best practice
Large proportion of inactive/unavailable pores Contaminants are present in the sample The effects of contaminants are shown in the Contaminants Know-how piece. Please try an alternative extraction method that does not result in contaminant carryover.

温度変動

問題点 予想される原因 解決策とコメント
温度変動 フローセルとデバイスの接続が途切れている。 フローセルの背面にある金属プレートを覆っているヒートパッドがあることを確認してください。 フローセルを再度挿入し、コネクターピンがデバイスにしっかりと接触していることを確認するために軽く押してください。問題が解決しない場合は、テクニカルサービスにご連絡してください。

目標温度に到達しない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目標温度に達しなかった)と表示する。" 装置が通常の室温より低い場所、または風通しの悪い場所（排気が出来ない場所）に置かれた時にフローセルが過熱してします。 MinKNOWでは、フローセルが目標温度に到達するまでの既定の時間枠があります。時間枠を超えると、エラーメッセージが表示され、シークエンシング実験が続行されます。しかし、不適切な温度でシークエンスを行うと、スループットが低下し、qスコアが低下する可能性があります。シークエンシングデバイスが風通しの良い室温に置かれていることを確認して、MinKNOW再スタートしてください。MinION Mk 1Bの温度制御の詳細については、FAQ を参照してください。

Last updated: 11/6/2024

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