Esta aplicación secuencia transcritos de ADNc completos en el extremo 5’, lo que ofrece una visión integral de las isoformas expresadas y facilita la identificación de eventos de empalme alternativo y fusiones en células individuales. Además, detecta SNP en cualquier parte del transcrito e identifica subtipos celulares dentro de una población a partir de los niveles de expresión de las isoformas.

Este protocolo describe cómo llevar a cabo la secuenciación de ADNc a partir de células individuales mediante el kit de secuenciación Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114). Deberá haber retrotranscrito el ARNm de células individuales en ADNc con los ensayos Chromium GEM-X Universal 5' Gene Expression (V3) o Chromium Next GEM Universal 5' Gene Expression (V2) de 10x Genomics, antes de amplificar el ADNc por PCR con oligonucleótidos personalizados. Por último, se realiza una preparación normal de la biblioteca con el kit Ligation Sequencing Kit V14, con la que se acondicionan los extremos de ADNc antes de secuenciar en un dispositivo PromethION.

Este protocolo está optimizado y adaptado para utilizarse con el protocolo Secuenciación transcriptómica de células individuales a partir de ADNc 3′ preparado con 10x Genomics, el kit SQK-LSK114 y la ampliación EXP-PCA001.

El protocolo original de 3' se adaptó a partir de Lebrigand, K., Magnone, V., Barbry, P. et al. High throughput error‑corrected Nanopore single‑cell transcriptome sequencing. Nature Communications 11, 4025 (2020), con el fin de secuenciar transcritos de longitud completa, eliminar artefactos de la síntesis de ADNc y corregir el sesgo de hebra.

Importante: este protocolo se ha elaborado para utilizarse con los ensayos Chromium GEM-X Universal 5' Gene Expression (V3) o Chromium Next GEM Universal 5' Gene Expression (V2) de 10x Genomics.

Si trabaja con los ensayos Chromium GEM-X Universal 3’ Gene Expression (V4) o Chromium Next GEM Universal 3’ Gene Expression (V3.1) de 10x Genomics, consulte el protocolo Secuenciación transcriptómica de células individuales a partir de ADNc 3′ preparado con 10x Genomics y los kits SQK-LSK114 y EXP-PCA001.

Si utiliza los ensayos Visium Spatial Gene Expression (Visium V1 para muestras congeladas en fresco) o Visium HD 3' Spatial Gene Expression, consulte el protocolo Spatial transcriptomics sequencing from 3’ cDNA prepared with 10x Genomics using SQK-LSK114 and EXP-PCA001.

Pasos del proceso de secuenciación:

Preparación del experimento

Pasos:

• Preparar con anterioridad el ADNc de células individuales, con los ensayos Chromium GEM-X Universal 5' Gene Expression (V3) o Chromium Next GEM Universal 5' Gene Expression (V2) de 10x Genomics. Este método requiere utilizar una muestra de buena calidad. Además, los controles de calidad realizados durante el protocolo son esenciales para garantizar el éxito del experimento.
• Tener a disposición el kit de secuenciación, el instrumental pertinente y los reactivos de otros fabricantes.
• Descargar el programa MinKNOW que obtiene y analiza los datos.
• Verificar la(s) celda(s) de flujo y comprobar que tiene(n) poros suficientes para realizar una buena secuenciación.

Preparación de la biblioteca

Pasos	Procedimiento	Duración	Parada opcional
Amplificación por PCR	Amplificar el ADNc por PCR	80 min	-
Preparación de extremos	Preparar los extremos de ADNc antes de ligar los adaptadores	30 minutos	4 °C hasta el día siguiente
Ligación de los adaptadores y purificación	Ligar los adaptadores al ADNc	20 min	4 °C durante almacenamientos breves o en caso de uso repetido, como la recarga de celdas de flujo. –80 °C durante almacenamientos prolongados.
Acondicionar y cargar la celda de flujo	Acondicionar la celda de flujo y cargar la biblioteca preparada	10 minutos

Secuenciación y análisis

Pasos:

• Empezar el proceso de secuenciación desde el programa MinKNOW, que obtendrá datos brutos del dispositivo e identificará las lecturas.
• Analizar los datos con el flujo bioinformático wf-single-cell de EPI2ME.

Pida los siguientes oligonucleótidos purificados por HPLC a una concentración de 100 μM y dilúyalos a 10 μM en amortiguador TE, que utilizará en el paso de amplificación por PCR de la preparación de la biblioteca.

Nombre	Secuencia
Fwd_3580_partial_read1_defined_for_5'_cDNA	5'-/5phos/ACTTGCCTGTCGC TCTATCTTCCTACACGA CGCTCTTCCGATCT-3'
Rev_PR2_partial_TSO_defined_for_5'_cDNA	5'-/5phos/TTTCTGTTGGTGC TGATATTGCAAGCAGTG GTATCAACGCAGAG-3'

En los primeros pasos, cuando se preparen los amplicones de ADNc se necesitará una cantidad adicional de microesferas AMPure XP. A partir de la preparación de extremos, es posible utilizar las microesferas AMPure XP del kit de secuenciación por ligación V14 (SQK-LSK114).

Verificar la calidad de la muestra inicial de ADN

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), en ocasiones afecta a la preparación de la biblioteca.

Siga las instrucciones sobre cómo realizar un control de calidad de la muestra de ADN, en el protocolo Input DNA/ RNA QC.

Contaminantes químicos

Según cómo se extraiga el ADN de la muestra original, ciertos contaminantes químicos quedan en el ADN purificado y afectan tanto a la eficacia de la preparación de la biblioteca como a la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

Hemos probado y recomendamos el uso de todos los reactivos de otros fabricantes usados en este protocolo. Oxford Nanopore Technologies no ha evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos comprobar el número de poros disponibles presentes en la celda de flujo. La comprobación debe realizarse en un plazo de 12 semanas desde la compra. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la evaluación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Encontrará más información en las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celdas de flujo	Cantidad mínima de poros activos cubierta por la garantía
PromethION	5 000

Nota: este producto contiene un reactivo, AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter Inc., y el almacenamiento a –20 °C, junto con el kit, no perjudica su estabilidad.

Nota: DNA Control Sample (DCS) es un amplicón estándar de 3,6 kb que se alinea con el extremo 3’ del genoma Lambda.

El programa MinKNOW gestiona el dispositivo de secuenciación y la adquisición de datos. Compruebe que MinKNOW esté instalado en su ordenador o dispositivo. Encontrará instrucciones adicionales para configurar experimentos de secuenciación en el Protocolo de MinKNOW.

Recomendamos configurar el experimento de secuenciación con las recomendaciones indicadas a continuación. Los demás parámetros se dejan en su configuración predeterminada.

Estas son las recomendaciones de configuración de MinKNOW:

Posiciones

Posición de celda de flujo: [Definida por el usuario]

Nombre del experimento: [definido por el usuario]

Tipo de celda de flujo: FLO-PRO114M

ID de muestra: [definido por el usuario]

Kit

Seleccionar el kit: Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK114)

Configuración del experimento

Secuenciación y análisis

Identificación de bases: Encendido
Bases modificadas: Apagado [predeterminado]
Modelo: Identificación de bases de máxima precisión (SUP)
*\ Nota: si se ejecutan varias celdas de flujo a la vez, recomendamos utilizar la identificación de bases de gran precisión (HAC) y volver a identificarlas con SUP al finalizar el experimento.

Etiquetado con códigos de barras: Apagado [predeterminado]

Alineamiento: Apagado [predeterminado]

Muestreo adaptativo: Apagado [predeterminado]

Opciones avanzadas
Intervalo entre exploraciones de poros: 1,5 [predeterminado]
Reservar poros: Encendido [predeterminado]

Objetivos de datos

Duración máxima de la ejecución: detener el experimento cuando la secuenciación alcance 72 h

Salida

Formatos de salida
.BAM: Apagado
.FASTQ: Apagado
Lecturas sin procesar: Encendido [predeterminado]
.POD5: Encendido [predeterminado]

Filtrado: Encendido [predeterminado]
Índice Q score: 8 [predeterminado]
Longitud mínima de lectura: 200 b

Al finalizar la secuenciación, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, tal como se describe en la sección Reutilización y devolución de celdas de flujo.

Una vez la identificación de bases y la secuenciación han finalizado, se analizan los datos tal como se describe en la sección Análisis de datos.

Los archivos de salida (FASTQ o BAM) se analizan con wf-single-cell, un flujo de trabajo bioinformático desarrollado en Nextflow que forma parte de la plataforma de análisis de datos EPI2ME de Oxford Nanopore Technologies. El flujo de trabajo wf-single-cell está diseñado para ejecutarse desde la línea de comandos y desde la aplicación EPI2ME Desktop Application. wf-single-cell está disponible en GitHub.

Ejecución del flujo de trabajo desde la línea de comandos:

nextflow run epi2me-labs/wf-single-cell \ 
   --expected_cells <CELL NUMBER> \ 
   --fastq <READS> \ 
   --kit <KIT> \ 
   --ref_genome_dir <REFERENCE> \ 
   -profile standard 

expected _cells corresponde al número de células seleccionadas en el experimento con 10x Chromium, fastq (o bam) a la ubicación de las lecturas identificadas, kit corresponde al kit y la versión de 10x utilizados (p. ej. 5prime:v4) y ref_genome_dir a la ubicación del genoma de referencia y los archivos de anotación de acuerdo con el formato de referencia 10x (encontrará más información en el centro de descargas de 10x.

La ejecución del flujo de trabajo requiere tener instalado Nextflow, Docker o Singularity en el sistema. Encontrará información adicional sobre cómo ejecutar los flujos de trabajo de EPI2ME desde la línea de comandos en la Guía de inicio rápido.

En la página de GitHub y en la documentación del flujo de trabajo se encuentra la información más reciente, junto con datos adicionales sobre cómo ejecutarlo y sobre los parámetros disponibles.

El flujo de trabajo wf-single-cell genera un informe interactivo en formato HTML, que incluye parámetros básicos de control de calidad (puntuación de secuenciación, longitudes de lectura), un resumen del experimento (número de células, media de lecturas por célula, etc.), gráficos diagnósticos de saturación y gráfico de inflexión, así como gráficos UMAP que representan los agrupamientos celulares. También genera matrices de expresión génica y de transcritos en un formato compatible con las herramientas de análisis más utilizadas.

También disponemos de una sección de preguntas frecuentes (FAQ) en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop del ADN con una relación OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2)	El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria	Los efectos de los contaminantes se muestran en el documento Contaminants. Probar con otro método de extracción que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación	Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas AMPure por muestra inferior a lo previsto.	1. Las microesferas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra deben estar bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas AMPure por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación	Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado	Cuanto menor sea la proporción de microesferas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel y a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas AMPure que se debe utilizar.
Escasa recuperación tras la preparación de extremos	En el paso de lavado se utilizó etanol en una concentración inferior al 70 %	Si se utiliza etanol a una concentración inferior al 70 %, el ADN se eluye de las microesferas. Utilice el porcentaje correcto.

También dispone de una sección de preguntas frecuentes, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat de la comunidad Nanopore.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo.	Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos.	Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo y antes de acondicionarla, es imprescindible quitar las burbujas de aire que haya cerca del puerto de purgado. Si no se quitan, las burbujas pueden desplazarse a la matriz de poros y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En el vídeo Cómo cargar una celda de flujo PromethION se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo.	La celda de flujo no está colocada correctamente.	Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar a insertarla en una posición diferente.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo	La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros.	El recuento de poros durante la evaluación de la celda de flujo se efectúa utilizando las moléculas de ADN del control de calidad presentes en el amortiguador de almacenamiento. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para calcular el número de poros activos. Por este motivo, se estima que existe una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación suele estar relacionado con la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. En algunos casos, se recomienda emplear métodos alternativos de extracción o purificación de ADN/ARN para mejorar la pureza del material de partida. Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción diferente que no provoque el arrastre de contaminantes.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"		Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema persiste, reúna los archivos de registro de MinKNOW y contacte con el departamento de Asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica, que proporcionará instrucciones de almacenamiento adicionales.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación de poro inferior al 40 %	No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo	Cargue la biblioteca al volumen y la concentración adecuados, tal como se indica en el protocolo correspondiente. Es necesario cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular los moles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, seleccionando la opción "dsDNA: μg to pmol".
Ocupación de poro próxima a 0	Se utilizó el kit Ligation Sequencing y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN	En la fase de ligación del adaptador, añadir la cantidad recomendada de NEBNext Quick Ligation Module (E6056) y el amortiguador Ligation Buffer (LNB) suministrado en el kit. Preparar una biblioteca de control con lambda para valorar la integridad de los reactivos de otros fabricantes.
Ocupación de poro próxima a 0	Se utilizó el kit Ligation Sequencing y en la fase de lavado, después de ligar el adaptador, se utilizó etanol en lugar de Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).	El etanol puede desnaturalizar la proteína motor en los adaptadores de secuenciación. Usar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) después de la ligación de los adaptadores.
Ocupación de poro próxima a 0	No hay anclaje en la celda de flujo	Los anclajes se añaden durante el acondicionamiento de la celda de flujo (viales (FLT)/(FCT)). Añadir Flush Tether (FLT) o Flow Cell Tether (FCT) al vial Flush Buffer (FB) o Flow cell Flush (FCF) antes de acondicionar la celda de flujo.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado	Fragmentación no deseada de la muestra de ADN	La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La fragmentacion tiene lugar durante los procesos de extracción y preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. En la imagen superior, la muestra 1 contiene un elevado peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado. 3. Durante la preparación de la biblioteca, evite pipetear y agitar en vórtex al mezclar los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros) El gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros "no disponibles».	Hay contaminantes presentes en la muestra	Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores". Si la porción de poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta: 1. Es posible realizar un lavado con nucleasa utilizando el kit Flow Cell Wash (EXP-WSH004), o 2. Realizar varios ciclos de PCR a fin de diluir cualquier contaminante que esté causando problemas.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros). Los poros o membranas han sufrido daños irreversibles)	Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo	Las burbujas de aire introducidas durante el acondicionamiento de la celda y carga de la biblioteca provocan daños permanentes. La forma más eficaz de evitar que esto ocurra se muestra en el vídeo Cómo cargar celdas de flujo PromethION.
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles	Hay contaminantes presentes en la muestra	Los efectos de los contaminantes se muestran en el documento Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura	La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo	Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar hasta que las clavijas del conector estén firmemente en contacto con el dispositivo. Si el problema persiste, contacte con el servicio de Asistencia técnica.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje «Error al intentar alcanzar la temperatura deseada»	El dispositivo se colocó en una ubicación con una temperatura ambiente inferior a la media o con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo).	MinKNOW establece un tiempo para que la celda de flujo alcance la temperatura fijada. Si se supera el tiempo establecido, aparecerá un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continuará. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y generar índices de calidad Q score menores. Ajuste la ubicación del dispositivo, procurando que esté a temperatura ambiente y con buena ventilación y reinicie la secuenciación en MinKNOW.