ライゲーションシークエンスプロトコルのサンプル使用量とフローセルへのロード量の詳細については、our know-how documentをご覧ください。

インプットDNAのQC方法

インプットDNAの量と品質の要件を満たすことが重要です。DNAの使用量が少なすぎたり多すぎたり、あるいは品質の低いDNA（例としてDNAが非常に断片化されていたり、RNAや化学汚染物質が含まれている場合など）を使用すると、ライブラリーの調製に影響を及ぼす可能性があります。

DNAサンプルの品質管理の方法については、Input DNA/RNA QC protocolのプロトコルをご覧ください。

コンタミネーション

DNAの抽出する方法によっては、精製DNAに特定の化学汚染物質が残留する可能性があり、ライブラリ調製の効率やシークエンシングの品質に影響を及ぼす可能性があります。コンタミネーションについての詳細は、コミュニティーの Contaminants page をご覧ください。

NEBNext® Companion Module v2 for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (catalogue number E7672S or E7672L), を購入されることをお勧めします。この商品にはLigation Sequencing Kitで使用するために必要なすべてのNEB試薬が含まれています。

旧バージョンのNEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L)と互換性がありますが、新しい「モジュールｖ2」では、FFPEv2 DNA Repair BufferとSalt-T4 DNA Ligaseにより、より効率的なdA-tailingとligationが可能になりました。v2モジュールを使用すると、サンプルあたりのコストを削減できます。

（注： アンプリコンのプロトコールについては、NEBNext FFPE DNA Repair Mixをお買い求めいただくことも可能ですが、試薬を別途でお買い求めいただく方がコスト的に有利です。

このプロトコールで使用されているすべてのサードパーティー試薬は、当社が検証し、使用を推奨しているものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以外の試薬を用いたテストは行っていません。

すべてのサードパーティ製試薬については、製造元の指示に従って使用の準備をすることをお勧めします。

シークエンシング実験を開始する前に、フローセルのポアの数を確認することを強くお勧めします。このフローセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの場合は代理店への到着から１２週間以内に行ってください。またはFlongle Flow Cellの場合は代理店への到着から4週間以内に行う必要があります。Oxford Nanopore Technologiesは、フローセルチェックの実施から2日以内に結果が報告され、推奨される保管方法に従っていた場合に、以下の表に記載されているナノポアの有効数に満たさない場合には、フローセルを交換します。 フローセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指示に従ってください。

（注： 現在のキットの容器を変更しています。今までは実験毎に使い捨てのシングルユーズチューブを使用していましたが、バッファー単位のボトル容器に変更しています。

シングルユースチューブの場合:

ボトル容器の場合:

（注： 本製品には、Beckman Coulter、Inc.製のAMPure XP試薬が含まれており、試薬の安定性を損なうことなくキットと共に-20 ° Cで保存することができます。

（注： DNA Control Sample（DCS）は3.6kbのアンプリコンで、Lambda genomeの3'末端をマッピングしたプレップコントロールです。

フローセルをロードしたら、MinKNOWでシーケンスランを開始します。MinKNOWは、デバイス、データ収集、リアルタイムベースコールを制御するシーケンスソフトウェアです。MinKNOWのセットアップと使用に関する詳細情報は、[MinKNOWプロトコル] MinKNOW protocolをご覧ください。

MinKNOWは、複数の方法でシーケンスに使用し、設定することができます:

• シーケンシングデバイスに直接またはリモートで接続されたコンピューター
• GridIONまたはPromethION 24/48シーケンス装置上

シーケンシングデバイス上でのMinKNOWの使用に関する詳細は、デバイスのユーザーマニュアルをご覧ください：

• PromethION 24/48 user manual
• PromethION 2 Solo user manual

MinKNOWでシーケンスランを開始するには：

1. スタートページに移動し、_Start sequencing. をクリックしてください。

2. 名前、フローセルの位置、サンプルIDなど、実験の詳細を入力する。

3. Kitページで sequencing kit used in the library preparation を選択する。

4. Run configurationタブで、シーケンスラン用のシーケンスパラメータと出力パラメータを設定するか、デフォルト設定のままにする。

注）: シーケンスランのセットアップ時にベースコールがオフになっている場合、ベースコールはMinKNOWでポストランに実行できます。詳細については、[MinKNOWプロトコル] MinKNOW protocol を参照してください。

5. Start をクリックしてシーケンスランを開始します。

Kit 14chemistryはデュプレックスベースコールを改良しました。デュプレックスベースコールデータは、MinKNOWでシンプレックスベースコールを行った後に、 Dorado で再ベースコールを行うことで得られます。

シンプレックスおよび、デュプレックスのベースコールに関するシークエスランのセットアップの詳細については、Kit 14 sequencing and duplex basecalling とデュプレックスベースコールの情報シートをご覧ください.

(注： Doradoを使用する場合、メモリを最大限Doradoで使用するために、他のベースコールを停止することを推奨しています。ベースコールはDoradoが終了すればMinKNOWのGUIで停止や再開することができます。

MinKNOWでシークエンスが終わると、フローセルを再利用または返却ができます。詳しくは、フローセルの再利用と返却のセクションをご覧ください。

シークエンシングとベースコールの後にはデータを解析することができます。 ベースコールおよびベースコール後の解析オプションの詳細については、Data Analysis を参照してください。

ダウンストリーム解析セクションでは、データを解析するためのオプションの概要を説明しています。

ベースコールされたデータをさらに解析するには、いくつかの方法があります。

1. EPI2ME workflows

詳細なデータ解析のために、オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズは、EPI2MEで利用可能な様々なバイオインフォマティクスのチュートリアルとワークフローを提供しています。このプラットフォームでは、研究チームとアプリケーションチームがGitHubに保存しているワークフローを記載しています。このプラットフォーム内にはバイオインフォマティクスのコードと説明をしているコメント、およびサンプルデータを使ってコードを試すことが出来ます。

2. 研究分析ツール

Oxford Nanopore Technologiesの研究部門では、Oxford Nanopore GitHub repositoryで多数の分析ツールを公開しています。これらのツールは上級ユーザー向けであり、ソフトウェアのインストールと実行方法の説明が含まれています。これらのツールは最低限のサポートしかしていません。

3. コミュニティーで開発されたツール

研究課題に適したデータ解析方法が上記のリソースのいずれにも記載されていない場合は、 resource centre を参照し、アプリケーションに適したバイオインフォマティクスツールを検索してください。 Nanoporeコミュニティーの多くのメンバーが、 ナノポアシークエンシングデータを解析するための独自のツールやパイプラインを開発しており、そのほとんどはGitHubで利用可能です。これらのツールはOxford Nanopore Technologiesではサポート対象外であり、最新のケミストリーやソフトウェア構成との互換性を保証するものではありませんのでご了承ください。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。