Secuenciación de ADN por ligación V14 (SQK-LSK114) (GDE_9161_v114_revAA_30May2025)

Oxford Nanopore Technologies
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PromethION: Protocol

Secuenciación de ADN por ligación V14 (SQK-LSK114) V GDE_9161_v114_revAA_30May2025

  • Este protocolo utiliza ADN genómico o amplicón de ADN
  • Tiempo de preparación de la biblioteca: 65 min ~
  • Fragmentación optativa
  • Sin PCR
  • Compatible con las celdas de flujo R10.4.1

Para uso exclusivo en investigación

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

  • Este protocolo utiliza ADN genómico o amplicón de ADN
  • Tiempo de preparación de la biblioteca: 65 min ~
  • Fragmentación optativa
  • Sin PCR
  • Compatible con las celdas de flujo R10.4.1

Para uso exclusivo en investigación

Document version: GDE_9161_v114_revAA_30May2025

1. Aspectos generales

Introducción al protocolo Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)

Este protocolo describe cómo llevar a cabo la secuenciación de una muestra de ADN, utilizando el kit de secuenciación Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114). Antes de empezar, se recomienda hacer un experimento de control con lambda para familiarizarse con la tecnología.

Pasos en el proceso de secuenciación:

Preparación del experimento

Pasos:

  • Extraer el ADN y evaluar su longitud, cantidad y pureza. Los controles de calidad realizados durante el protocolo son fundamentales para garantizar el éxito del experimento.
  • Contar con el kit de secuenciación, el instrumental adecuado y los reactivos de otros fabricantes.
  • Descargar el programa MinKNOW para obtener y analizar los datos.
  • Comprobar que la celda de flujo tiene poros suficientes para realizar una buena secuenciación.

Preparación de la biblioteca La tabla siguiente es un resumen de los pasos necesarios en la preparación de la biblioteca, incluidos la duración y las paradas opcionales.

Prep biblioteca Proceso Duración Parada opcional
Reparación del ADN y preparación de los extremos Reparar el ADN y preparar los extremos para ligar el adaptador 35 minutos Guardar a 4 °C hasta el día siguiente
Ligación de los adaptadores y purificación Ligar los adaptadores a los extremos de ADN 20 minutos Se recomienda secuenciar la biblioteca tan pronto como se liguen los adaptadores.

Guardar a 4 °C durante un periodo breve o durante un uso repetido, como en la recarga de la celda de flujo

Guardar a -80 °C durante un almacenamiento prolongado.
Acondicionamiento y carga de la celda de flujo Acondicionar la celda de flujo y cargar la biblioteca en ella 10 minutos

ES--Flujo de trabajo LSK114 v02

Secuenciación y análisis

Pasos:

  • Empezar el proceso de secuenciación usando el programa MinKNOW, que obtendrá datos crudos del dispositivo y los convertirá en lecturas de bases identificadas.
  • Iniciar el programa EPI2ME y seleccionar un flujo de trabajo bioinformático para analizar los datos.

Este protocolo debe utilizarse solo junto con:

2. Material y consumibles

Material
  • 1 µg (o 100-200 fmol) de ADN genómico de alto peso molecular
  • o 100+ ng de ADN genómico de alto peso molecular (si se fragmenta el ADN).
  • Kit Ligation Sequencing V14 (SQK-LSK114)
Consumibles
  • Celdas de flujo PromethION
  • Kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen Q32851)
  • NEBNext® Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7672S o E7672L)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
  • Dispositivo PromethION
  • Pantalla protectora celdas de flujo PromethION
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Termociclador
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Cubeta con hielo
  • Temporizador
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Ajuste la cantidad de muestra en función de la longitud de la muestra de ADN inicial:

Longitud de fragmentos Cantidad de muestra inicial
Muy cortos (<1 kb) 200 fmol
Cortos (1-10 kb) 100–200 fmol
Largos (>10 kb) 1 µg

Para más información acerca de las cantidades de muestra inicial y de carga de las celdas de flujo en los protocolos de secuenciación por ligación, consulte este documento técnico

ADN inicial

Cómo efectuar un control de calidad del ADN inicial

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

NEBNext® Companion Module v2 para secuenciación por ligación, de Oxford Nanopore Technologies®

Recomendamos el módulo de acompañamiento NEBNext® Companion Module v2 for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (catalogue number E7672S or E7672L), que contiene todos los reactivos NEB necesarios para usar con el kit Ligation Sequencing Kit.

La versión previa, NEBNext® Companion Module de Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L) es compatible, pero el módulo recomendado v2 ofrece una ligación y adición de dA más efectiva, resultado del reactivo FFPEv2 DNA Repair Buffer y la ligasa Salt-T4 DNA Ligase, recpectivamente.
Con el módulo v2 también se consigue un notable ahorro de costes por preparación de muestra.

Nótese que, en los protocolos con amplicones no es necesario utilizar la mezcla de reparación de ADN, NEBNext FFPE DNA Repair Mix y sale más rentable comprar los reactivos necesarios por separado.

Reactivos de otros fabricantes

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000

A fin de garantizar un elevado rendimiento de ligación del adaptador, recomendamos el uso del tampón Ligation Buffer (LNB), incluido en el kit, en lugar de la ligasa de otros fabricantes.

El adaptador incluido en este kit, Ligation Adapter (LA), no es intercambiable con otros adaptadores de secuenciación.

Contenido del kit Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)

SQK-LSK114 v3 ES

Nota: este producto contiene un reactivo, AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter Inc., que puede conservarse con el kit a -20 °C sin perjudicar su estabilidad.

Nota: la muestra de control de ADN (DCS) es un amplicón estándar de 3,6 kb, que mapea el extremo 3' del genoma Lambda.

3. Reparación del ADN y preparación de los extremos

Material
  • 1 µg (o 100-200 fmol) de ADNg
  • DNA Control Sample (DCS)
  • AMPure XP Beads (AXP)
Consumibles
  • NEBNext® FFPE DNA Repair Mix (M6630), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
  • NEBNext® FFPE DNA Repair Buffer v2 (E7363), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
  • NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix (E7646), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
  • Kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen Q32851)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
Instrumental
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P10
  • Microcentrífuga
  • Termociclador
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Gradilla magnética
  • Cubeta con hielo
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el CC)

Recomendamos utilizar el módulo de acompañamiento Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (ref. E7672S o E7672L) de NEBNext®, que contiene los reactivos necesarios para utilizar junto al Ligation Sequencing Kit.

La versión anterior, NEBNext® Companion Module para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S o E7180L) también es compatible, pero el modelo recomendado v2, ofrece una ligadura y adición de dA más eficaces.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos verificar la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.

Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.

Descongelar el reactivo DNA Control Sample (DCS) a temperatura ambiente, centrifugar brevemente, mezclar con la pipeta y poner en hielo.

Recomendamos utilizar DNA Control Sample (DCS) en la preparación de la biblioteca para localizar y solucionar problemas aunque, es posible omitir este paso y compensar el 1 µl extra con la muestra de ADN.

Preparar los reactivos NEB siguiendo las instrucciones del fabricante y poner en hielo.

Para obtener un rendimiento óptimo, NEB recomienda lo siguiente:

  1. Descongelar todos los reactivos en hielo.

  2. Golpear suavemente los tubos de los reactivos con el índice o invertirlos, a fin de mezclarlos bien.
    Nota: No mezclar en vórtex las mezclas FFPE DNA Repair Mix, ni Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Centrifugar brevemente los tubos antes de abrirlos.

  4. Mezclar en vórtex el vial FFPE DNA Repair Buffer v2 hasta que se mezcle bien.
    Nota: Es posible que el tampón tenga un precipitado blanco. Si es el caso, dejar que la mezcla se ponga a temperatura ambiente y mezclar con la pipeta varias veces para romper el precipitado; a continuación, mezclar brevemente en vórtex.

  5. El tampón FFPE DNA Repair Buffer podría tener un matiz amarillo; no importa si está así; se puede utilizar.

Preparación del ADN en agua sin nucleasas:

  1. Transferir 1 μg (o 100-200 fmol) de muestra de ADN a un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.

  2. Ajustar el volumen a un total de 47 μl con agua sin nucleasas.

  3. Mezclar minuciosamente con la pipeta o golpear el tubo suavemente con el índice.

  4. Centrifugar brevemente

En un tubo de PCR de pared fina (0,2 ml), mezclar lo siguiente:

Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.

Reactivo Volumen
ADN del paso anterior 47 µl
(opcional) DNA Control Sample (CS) 1 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer v2 7 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix 2 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
Total 60 µl

Pipetear la mezcla con suavidad y centrifugar brevemente hasta que esté bien homogénea.

Incubar en el termociclador, primero a 20 ºC durante 5 minutos y después a 65 ºC durante 5 minutos más. A continuación, enfriar las muestras en el termociclador a entre 4 ºC y 20 ºC o colocarlas en hielo.

Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.

Transferir la muestra de ADN a un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

Añadir 60 µl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción de preparación de extremos y mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Preparar 500 µl de etanol al 80 %, con agua sin nucleasas.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Dejar el tubo en el imán y lavar el precipitado, con cuidado de no desplazarlo, con 200 µl de etanol al 80 %. Retirar el etanol con una pipeta y desechar.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el precipitado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el precipitado en 61 µl de agua sin nucleasas. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 61 µl de eluido y guardar en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

Una vez el ADN esté reparado y con los extremos preparados, se procederá a la ligación del adaptador. En este punto, también se puede guardar la muestra a 4 ⁰C hasta el día siguiente.

4. Ligación del adaptador y purificación

Material
  • Ligation Adapter (LA)
  • Ligation Buffer (LNB)
  • Long Fragment Buffer (LFB)
  • Short Fragment Buffer (SFB)
  • AMPure XP Beads (AXP)
  • Elution Buffer (EB)
Consumibles
  • Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056)
  • Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
  • Gradilla magnética
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Recomendamos utilizar Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467).

La ligasa Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467) puede adquirirse por separado o como parte del NEBNext® Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (ref. E7672S or E7672L).

La ligasa Quick T4 DNA Ligase (NEB, E6057), disponible en la versión anterior —NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L)— también es compatible, pero los nuevos reactivos recomendados ofrecen una ligación de extremos más eficaz.

Aunque la ligasa recomendada de otros fabricantes se suministra con su propia solución amortiguadora, la eficiencia del adaptador —Ligation Adapter (LA)—, es mayor cuando se usa la solución Ligation Buffer (LNB) suministrada en el kit Ligation Sequencing.

Centrifugar los viales Ligation Adapter (LA) y Salt-T4® DNA Ligase y poner en hielo.

Descongelar el vial Ligation Buffer (LNB) a temperatura ambiente, centrifugar y mezclar con la pipeta. Debido a su viscosidad, la agitación en vórtex de este tampón es ineficaz. Tras descongelar y mezclar, colocar en hielo inmediatamente.

Descongelar el vial Elution Buffer (EB) a temperatura ambiente, agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

Según la solución amortiguadora que se utilice —Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer—, el lavado tras la ligación del adaptador está diseñado bien para enriquecer los fragmentos de ADN de >3 kb o para purificar todos los fragmentos por igual.

  • Para enriquecer fragmentos de ADN de 3 kb o mayores, utilizar el amortiguador de fragmentos largos, Long Fragment Buffer (LFB).

  • Para conservar fragmentos de ADN de todos los tamaños, utilizar el amortiguador de fragmentos cortos, Short Fragment Buffer (SFB).

Descongelar el vial Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) a temperatura ambiente y agitar en vórtex. A continuación, centrifugar brevemente y mantener a temperatura ambiente.

En un tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml mezclar en el siguiente orden:

Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.

Reactivo Volumen
Muestra de ADN del paso anterior 60 µl
Ligation Adapter (LA) 5 µl
Ligation Buffer (LNB) 25 µl
Salt-T4® DNA Ligase 10 µl
Total 100 µl

Mezclar la reacción, pipeteando con suavidad hasta obtener una mezcla homogénea, y centrifugar brevemente.

Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Resuspender las microesferas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.

Añadir 40 μl de microesferas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción y mezclar dando suaves golpes en el tubo con el dedo.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Lavar las microesferas con 250 μl de Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB). Golpear el tubo suavemente con el dedo, centrifugar brevemente, colocar en la gradilla magnética y dejar que las microesferas precipiten. Retirar el sobrenadante con una pipeta y desechar.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el precipitado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Retirar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el precipitado en 25 µl de Elution Buffer (EB). Centrifugar brevemente e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. En el caso de ADN con alto peso molecular, incubar a 37 °C favorece la recuperación de fragmentos cortos.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer y conservar 25 µl de eluido, que contiene la biblioteca de ADN, en un tubo Eppendorf DNA LoBind limpio de 1,5 ml.

Desechar las microesferas precipitadas

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

Dependiendo del tamaño de los fragmentos, preparar la biblioteca final en 32 µl de Elution Buffer (EB).

Longitud de fragmentos Cantidad de carga en la celda de flujo
Muy cortos (<1 kb) 100 fmol
Cortos (1-10 kb) 35–50 fmol
Largos (>10 kb) 300 ng

Nota: Si los resultados están por debajo de las recomendaciones de entrada, cargue toda la biblioteca.

Si es necesario, recomendamos utilizar una calculadora de masa a mol como la calculadora NEB.

La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar en hielo o a 4 °C hasta el momento de cargar.

Recomendaciones de almacenamiento

Recomendamos guardar las bibliotecas en tubos Eppendorf DNA LoBind a 4 ⁰C, durante periodos cortos o en caso de uso repetido, por ejemplo, durante la recarga de celdas de flujo entre lavados. Para uso individual y para almacenar a largo plazo (más de 3 meses), recomendamos guardar las bibliotecas a -80 ⁰C en tubos Eppendorf DNA LoBind.

5. Acondicionar y cargar celdas de flujo PromethION

Material
  • Sequencing Buffer (SB)
  • Library Beads (LIB)
  • Library Solution (LIS)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Flow Cell Flush (FCF)
Consumibles
  • Celdas de flujo PromethION
  • Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
Instrumental
  • Dispositivo PromethION
  • Pantalla protectora celdas de flujo PromethION
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P20

Este kit es compatible solo con celdas de flujo R10.4.1 (FLO-PRO114M)

Sacar las celdas de flujo de la nevera y esperar 20 minutos, mientras alcanzan la temperatura ambiente, antes de insertarlas en el dispositivo. En entornos húmedos se puede formar condensación. Inspeccione las clavijas doradas del conector, situadas en la parte superior e inferior de la celda de flujo, en busca de condensación y si la hubiera, límpiela con una toallita sin pelusa. Compruebe que la almohadilla térmica (color negro) esté enganchada en la parte posterior.

Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), —si se requiere—, Flow Cell Tether (FCT) y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar brevemente y poner en hielo.

Preparar la mezcla de acondicionamiento combinando Flow Cell Tether (FCT) y Flow Cell Flush (FCF) como se indica a continuación. Mezclar en vórtex a temperatura ambiente.

Nota: Estamos cambiando el formato de nuestros kits: de tubos de un solo uso a un formato en botella. Siga las instrucciones correspondientes al formato de su kit.

Formato en tubos monouso: Añadir 30 µl de Flow Cell Tether (FCT) directamente en el tubo Flow Cell Flush (FCF).

Formato en botella: En un tubo nuevo, adecuado al número de celdas de flujo que se utilicen, combinar los siguientes reactivos:

Reactivos Volumen por celda de flujo
Flow Cell Flush (FCF) 1 170 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Volumen total 1 200 µl

En el PromethION 2 Solo, cargar la(s) celda(s) de flujo de la siguiente manera:

  1. Colocar la celda de flujo en la placa metálica.

  2. Deslizar la celda en el puerto de acople hasta que las clavijas doradas o la placa verde no se vean.

J2068 FC-into-P2-animation V5

En el PromethION 24/48, cargar la(s) celda(s) en los puertos de acople:

  1. Alinear la celda con el conector, horizontal y verticalmente, antes de insertarla suavemente en su posición.
  2. Presionarla hacia abajo con firmeza hasta que el pestillo encaje y haga clic en la base.

ES-Step 1a V3 Prom

ES-Step 1B Prom

Insertar la celda de flujo en el ángulo equivocado podría dañar las clavijas del PromethION y afectar los resultados de la secuenciación. Si nota que las clavijas del conector están dañadas, contacte con el servicio de asistencia en support@nanoporetech.com.

Screenshot 2021-04-08 at 12.08.37

Antes de cargar la biblioteca, realizar una comprobación de la celda de flujo a fin de evaluar el número de poros disponible.

Este paso puede omitirse si la celda de flujo se ha comprobado con anterioridad.

Para más información, consultar las instrucciones de comprobación de celdas de flujo en el protocolo de MinKNOW.

Deslizar la tapa del puerto de entrada en el sentido de las agujas del reloj.

ES-Prom loading 2 v03

Tenga cuidado a la hora de extraer solución amortiguadora de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que la solución cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de entrada, aspirar un volumen pequeño con la pipeta a fin de eliminar burbujas de aire:

  1. Ajustar la pipeta P1000 a 200 µl.
  2. Insertar la punta en el puerto de entrada.
  3. Girar la rueda hasta que el dial marque 220-230 µl o hasta que una pequeña cantidad de solución entre en la punta de la pipeta.

ES-Paso 3 v2

Cargar 500 µl de mezcla de acondicionamiento, evitando introducir burbujas de aire. Esperar cinco minutos. Mientras tanto, preparar la biblioteca siguiendo los siguientes pasos del protocolo.

ES-Paso 4 v1

Mezclar minuciosamente con la pipeta el contenido del vial Library Beads (LIB).

El vial Library Beads (LIB) contiene microesferas en suspensión. Las microesferas sedimentan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.

En la mayoría de experimentos de secuenciación recomendamos utilizar Library Beads (LIB). El reactivo Library Solution (LIS) está disponible en caso de utilizar bibliotecas más viscosas.

En un tubo nuevo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml, preparar la biblioteca como se indica a continuación:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Sequencing Buffer (SB) 100 µl
Library Beads (LIB) bien mezcladas antes de usar o Library Solution (LIS) 68 µl
Biblioteca de ADN 32 µl
Total 200 µl

Nota: Se ha incrementado el volumen de la biblioteca a fin de optimizar la cobertura de la matriz de poros.

Cargar lentamente 500 µl de mezcla de acondicionamiento por el puerto de entrada.

ES-Paso 5 v1

Mezclar la biblioteca suavemente con la pipeta, justo antes de cargar.

Con una pipeta P1000, cargar 200 µl de biblioteca en el puerto de entrada.

ES-Paso 6 v1

Cerrar la tapa del puerto de entrada.

ES--Paso 7 v02

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos colocar la pantalla protectora y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Si se ha retirado la pantalla protectora, volver a colocarla de la siguiente manera:

  1. Alinear la pieza de modo que el orificio coincida con la tapa del puerto de entrada. El borde delantero debería asentarse por encima del identificador de la celda de flujo (sin cubrirlo).
  2. Presionar con firmeza la pantalla alrededor de la tapa. Se escuchará un clic cuando encaje debajo de esta.

ES-J2264 - Animación colocación de la pantalla protectora celda de flujo PromethION 8a FAW

ES-J2264 - Animación pantalla protectora celda de flujo PromethION 8b FAW

Cerrar la tapa del PromethION cuando esté listo para iniciar un ciclo de secuenciación en MinKNOW.

Tras cargar las celdas de flujo, esperar al menos10 minutos antes de iniciar un experimento ayudará a aumentar el rendimiento de la secuenciación.

6. Adquisición de datos e identificación de bases

Cómo empezar a secuenciar

Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que gestiona el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.

Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:

  • En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o a distancia.
  • Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION o PromethION 24/48.

Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:

Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:

1. Ir a la página principal y pulsar "Iniciar secuenciación".

2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de la muestra.

3. En la pestaña Kit, seleccionar Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114).

4. En la pestaña Configuración del experimento, ajustar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o mantener la configuración por defecto.

Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, es posible identificar las bases tras la ejecución en MinKNOW. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.

5. En la página Inicio, pulsar en la casilla Iniciar la secuenciación.

Análisis de datos

Una vez la secuenciación en MinKNOW haya finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.

Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y el análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.

En la sección Análisis de datos, se describen otras opciones para analizar los datos.

7. Reutilización y devolución de celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda lavada a entre 2 °C y 8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución, lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí están las instrucciones para devolver celdas de flujo.

Ante cualquier duda o pregunta, consulte el apartado Resolución de problemas, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

8. Análisis de datos

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:

1. Flujos de trabajo en EPI2ME

Para realizar un análisis de datos exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y flujos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, situados en la sección EPI2ME de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los flujos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis

El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si en ninguno de los recursos anteriores se proporciona un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.

9. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre el tema en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Al trabajar con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <70 % Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

10. Problemas durante el experimento de secuenciación

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que tras verificar la celda de flujo

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, y antes de acondicionarla, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de purgado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca podría haber dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la evaluación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación podría deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir instrucciones de almacenamiento adicionales.

Ocupación de poro por debajo del 40 %

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación de poro <40 % No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo Procure cargar la biblioteca al volumen y la concentración adecuados, tal como se indica en el protocolo correspondiente. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular fmoles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, (opción "dsDNA: μg to fmol").
Ocupación de poro próxima a 0 Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN En la fase de ligación del adaptador, utilice NEBNext Quick Ligation Module (E6056) y el tampón Ligation Buffer (LNB) de Oxford Nanopore Technologies, suministrado en el kit de secuenciación. Recuerde añadir la cantidad correcta de cada reactivo. Prepare una biblioteca de control con lambda para valorar la integridad de los reactivos de otros fabricantes.
Ocupación de poro próxima a 0 Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y en la fase de lavado, después de la ligación del adaptador, se utilizó etanol en lugar de Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB). El etanol puede desnaturalizar la proteína motor en los adaptadores de secuenciación. Usar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) después de la ligación de los adaptadores.
Ocupación de poro próxima a 0 No hay anclaje en la celda de flujo Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (Flush Tether (FLT) para los kits 9, 10 y 11, y Flow Cell Tether (FCT) para el kit 14). Asegurarse de añadir un anclaje —Flush Tether (FLT) o Flow Cell Tether (FCT)— al tampón antes del cebado; el tampón utilizado es Flush Buffer (FB) para los kits 9, 10 y 11 y Flow cell Flush (FCF) para el Kit 14.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción y preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros "no disponibles".		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores". Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta:

1. Realizar un purgado de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el acondicionamiento de la celda y carga de la biblioteca podrían dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de acondicionamiento y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte los métodos de extracción de ADN en la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Purificar con el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Fluctuación de la temperatura

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar con una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW dispone de un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continúa. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede provocar disminuciones en el rendimiento y generar índices de calidad Qscore menores. Corrija la ubicación del dispositivo, procurando que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace.

Last updated: 6/9/2025

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