Secuenciación de ADN por ligación V14 (SQK-LSK114)
PromethION: Protocol
Secuenciación de ADN por ligación V14 (SQK-LSK114) V GDE_9161_v114_revX_13Dec2024
- Este protocolo utiliza ADN genómico o amplicón de ADN
- Tiempo de preparación de la biblioteca: 60 min ~
- Fragmentación optativa
- Sin PCR
- Compatible con las celdas de flujo R10.4.1
Para uso exclusivo en investigación
*Este documento es una traducción del protocolo inglés, versión U, publicado el 8 de diciembre de 2023. Última actualización - 21 agosto 2024
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introducción al protocolo
Preparación de la biblioteca
- 3. Reparación del ADN y preparación de los extremos
- 4. Adapter ligation and clean-up
- 5. Priming and loading the PromethION Flow Cell
Secuenciación y análisis
Resolución de problemas
Descripción general
- Este protocolo utiliza ADN genómico o amplicón de ADN
- Tiempo de preparación de la biblioteca: 60 min ~
- Fragmentación optativa
- Sin PCR
- Compatible con las celdas de flujo R10.4.1
Para uso exclusivo en investigación
*Este documento es una traducción del protocolo inglés, versión U, publicado el 8 de diciembre de 2023. Última actualización - 21 agosto 2024
1. Aspectos generales
CONSEJO
Introducción al protocolo Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
Este protocolo describe cómo llevar a cabo la secuenciación de una muestra de ADN, utilizando el kit de secuenciación Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114). Antes de empezar, se recomienda hacer un experimento de control con lambda para familiarizarse con la tecnología.
Proceso de secuenciación:
Preparación del experimento
Pasos:
- Extraer el ADN y evaluar su longitud, cantidad y pureza. Los controles de calidad realizados durante el protocolo son fundamentales para garantizar el éxito del experimento.
- Contar con el kit de secuenciación, el instrumental adecuado y los reactivos de otros fabricantes.
- Descargar el programa MinKNOW para obtener y analizar los datos.
- Comprobar que la celda de flujo tiene poros suficientes para realizar una buena secuenciación.
Preparación de la biblioteca
La tabla siguiente es un resumen de los pasos necesarios en la preparación de la biblioteca, incluidos la duración y las paradas opcionales.
| Prep biblioteca | Proceso | Duración | Parada opcional |
|---|---|---|---|
| Reparación del ADN y preparación de los extremos | Reparar el ADN y preparar los extremos para ligar el adaptador | 35 minutos | Guardar a 4 °C hasta el día siguiente |
| Ligación de los adaptadores y purificación | Ligar los adaptadores a los extremos de ADN | 20 minutos | Se recomienda secuenciar la biblioteca tan pronto como se liguen los adaptadores. Guardar a 4 °C durante un periodo breve o durante un uso repetido, como en la recarga de la celda de flujo Guardar a -80 °C para usar una sola vez y almacenamiento prolongado. |
| Cebado y carga de la celda de flujo | Cebar la celda de flujo y cargar la biblioteca en ella | 5 minutos |
Secuenciación y análisis
Pasos:
- Empezar el proceso de secuenciación usando el programa MinKNOW, que obtendrá datos crudos del dispositivo y los convertirá en lecturas de bases identificadas.
- Iniciar el programa EPI2ME y seleccionar un flujo de trabajo bioinformático para analizar los datos.
IMPORTANTE
Compatibility of this protocol
This protocol should only be used in combination with:
- Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
- Control Expansion (EXP-CTL001)
- R10.4.1 PromethION Flow Cells (FLO-PRO114M)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
- PromethION 24/48 device - PromethION IT requirements document
- PromethION 2 Solo device - PromethION 2 Solo IT requirements document
2. Material y consumibles
Material
- 1 µg (o 100-200 fmol) de ADN genómico de alto peso molecular
- o 100+ ng de ADN genómico de alto peso molecular (si se fragmenta el ADN).
- Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) (kit de secuenciación por ligación V14)
Consumibles
- Celda de flujo PromethION
- Kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen Q32851)
- NEBNext® Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7672S o E7672L)
- Etanol al 80 %, recién preparado con agua sin nucleasas
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- PromethION device
- PromethION Flow Cell Light Shield
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
- Microcentrífuga
- Mezclador vórtex
- Termociclador
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Cubeta con hielo
- Temporizador
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Ajuste la cantidad de muestra en función de la longitud de la muestra de ADN inicial:
| Longitud de fragmentos | Cantidad de muestra inicial |
|---|---|
| Muy cortos (<1 kb) | 200 fmol |
| Cortos (1-10 kb) | 100–200 fmol |
| Largos (>10 kb) | 1 µg |
Para más información acerca de las cantidades de muestra inicial y de carga de las celdas de flujo en los protocolos de secuenciación por ligación, consulte este documento técnico
Cantidad de muestra inicial de ADN
Cómo realizar un control de calidad del ADN de la muestra inicial
Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.
Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC
Contaminantes químicos
Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.
NEBNext® Companion Module v2 para secuenciación por ligación, de Oxford Nanopore Technologies®
Recomendamos el módulo de acompañamiento NEBNext® Companion Module v2 for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (catalogue number E7672S or E7672L), que contiene todos los reactivos NEB necesarios para usar con el kit Ligation Sequencing Kit.
La versión previa, NEBNext® Companion Module de Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L) es compatible, pero el módulo recomendado v2 ofrece una ligación y adición de dA más efectiva, resultado del reactivo FFPEv2 DNA Repair Buffer y la ligasa Salt-T4 DNA Ligase, recpectivamente.
Con el módulo v2 también se consigue un notable ahorro de costes por preparación de muestra.
Nótese que, en los protocolos con amplicones no es necesario utilizar la mezcla de reparación de ADN, NEBNext FFPE DNA Repair Mix y es más rentable comprar los reactivos necesarios por separado.
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| Flongle | 50 |
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
IMPORTANTE
A fin de garantizar un elevado rendimiento de ligación del adaptador Ligation Adapter (LA), recomendamos el uso del tampón Ligation Buffer (LNB) incluido en el kit Ligation Sequencing Kit V14, en lugar del tampón de ligasa de otros fabricantes.
IMPORTANTE
El adaptador incluido en este kit, Ligation Adapter (LA), no es intercambiable con otros adaptadores de secuenciación.
Contenido del kit Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
Nota: Hemos cambiando el formato de nuestros kits; hemos sustituido algunos de los viales de un solo uso por botellas de mayor contenido.
Formato de tubos monouso 
Formato en botella 
Nota: este producto contiene un reactivo, AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter Inc., que puede conservarse con el kit a -20 °C sin perjudicar su estabilidad.
Nota: la muestra de control de ADN (DCS) es un amplicón estándar de 3,6 kb, que mapea el extremo 3' del genoma Lambda.
3. Reparación del ADN y preparación de los extremos
Material
- 1 µg (o 100-200 fmol) de ADNg
- DNA Control Sample (DCS) (muestra de control)
- AMPure XP Beads (AXP)
Consumibles
- NEBNext® FFPE DNA Repair Mix (M6630), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
- NEBNext® FFPE DNA Repair Buffer v2 (E7363), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
- NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix (E7646), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
- Kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen Q32851)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Etanol al 80 %, recién preparado con agua sin nucleasas
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P10
- Microcentrífuga
- Termociclador
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Gradilla magnética
- Cubeta con hielo
Equipo opcional
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
CONSEJO
Recomendamos utilizar el módulo de acompañamiento Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (ref. E7672S or E7672L) de NEBNext®, que contiene los reactivos necesarios para utilizar junto al Ligation Sequencing Kit.
La versión anterior, NEBNext® Companion Module para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S o E7180L) también es compatible, pero el modelo recomendado v2, ofrece una ligadura y adición de dA más eficaces.
CHECKPOINT
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos verificar la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.
Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.
Descongelar el reactivo DNA Control Sample (DCS) a temperatura ambiente, centrifugar, mezclar con la pipeta y poner en hielo.
CONSEJO
Se recomienda usar DNA Control Sample (DCS) en la preparación de la biblioteca para localizar y solucionar problemas. De todos modos, se puede omitir este paso y compensar el 1 µl extra con la muestra de ADN.
Preparar los reactivos NEB siguiendo las instrucciones del fabricante y poner en hielo.
Para obtener un rendimiento óptimo, NEB recomienda lo siguiente:
Descongelar todos los reactivos en hielo.
Golpear suavemente los tubos de los reactivos con el índice o invertirlos, a fin de mezclarlos bien.
Nota: No mezclar en vórtex las mezclas FFPE DNA Repair Mix, ni Ultra II End Prep Enzyme Mix.Centrifugar los tubos antes de abrirlos.
Mezclar en vórtex los tampones FFPE DNA Repair Buffer v2 o FFPE DNA Repair Buffer y Ultra II End Prep Reaction Buffer, a fin de mezclarlos bien.
Nota: Es posible que los tampones tengan un precipitado blanco. Si ello ocurre, dejar que la mezcla se ponga a temperatura ambiente y mezclar el tampón con la pipeta varias veces para romper el precipitado; a continuación, mezclar rápido en vórtex.El tampón FFPE DNA Repair Buffer puede tener un matiz amarillo; no importa si está así; se puede utilizar.
Preparación del ADN en agua sin nucleasas:
Transferir 1 μg (o 100-200 fmol) de muestra de ADN a un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.
Ajustar el volumen a un total de 47 μl con agua sin nucleasas.
Mezclar minuciosamente con la pipeta o golpear el tubo suavemente con el índice.
Centrifugar brevemente
En un tubo de PCR de pared fina (0,2 ml), mezclar lo siguiente:
Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| ADN del paso anterior | 47 µl |
| (opcional) DNA Control Sample (CS) | 1 µl |
| NEBNext FFPE DNA Repair Buffer v2 | 7 µl |
| NEBNext FFPE DNA Repair Mix | 2 µl |
| Ultra II End-prep Enzyme Mix | 3 µl |
| Total | 60 µl |
Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.
Incubar en el termociclador, primero a 20 ºC durante 5 minutos y después a 65 ºC durante 5 minutos más.
Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.
Transferir la muestra de ADN a un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.
Añadir 60 µl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción de preparación de extremos y mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo.
Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Preparar 500 µl de etanol al 80 %, con agua sin nucleasas.
Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.
Dejar el tubo en el imán y lavar el agregado de microesferas, con cuidado de no desplazarlo, con 200 µl de etanol al 80 %. Retirar el etanol con una pipeta y desechar.
Repetir el paso anterior.
Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el precipitado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.
Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 61 µl de agua sin nucleasas. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Extraer 61 µl de eluido y guardar en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.
CHECKPOINT
Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.
FIN DEL PROCESO
Una vez el ADN está reparado y con los extremos preparados, se puede proceder a la ligación del adaptador. En este punto, también se puede guardar la muestra a 4 ⁰C hasta el día siguiente.
4. Adapter ligation and clean-up
Material
- Ligation Adapter (LA) (adaptador de ligación)
- Ligation Buffer (LNB) (tampón de ligación) del kit Ligation Sequencing Kit
- Long Fragment Buffer (LFB) (tampón para fragmentos largos)
- Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
- AMPure XP Beads (AXP)
- Elution Buffer (EB) (tampón de elución) del kit de Oxford Nanopore
Consumibles
- Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
- NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056) (Módulo de ligación rápida)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Gradilla magnética
- Microcentrífuga
- Mezclador vórtex
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
CONSEJO
Recomendamos utilizar Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467).
La ligasa Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467) puede adquirirse por separado o como parte del NEBNext® Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (ref. E7672S or E7672L).
La ligasa Quick T4 DNA Ligase (NEB, E6057), disponible en la versión anterior —NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L)— también es compatible, pero los nuevos reactivos recomendados ofrecen mayor eficacia y ligación.
IMPORTANTE
Aunque la ligasa recomendada de otros fabricantes se suministra con su propio tampón, la eficiencia del adaptador, Ligation Adapter (LA), es mayor cuando se usa el tampón Ligation Buffer (LNB) suministrado en el kit Ligation Sequencing Kit.
Centrifugar los viales Ligation Adapter (LA) y Salt-T4® DNA Ligase y poner en hielo.
Descongelar el vial Ligation Buffer (LNB) a temperatura ambiente, centrifugar y mezclar con la pipeta. Debido a su viscosidad, la agitación en vórtex de este tampón es ineficaz. Tras descongelar y mezclar, colocar en hielo inmediatamente.
Descongelar el vial Elution Buffer (EB) a temperatura ambiente, agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
IMPORTANTE
La fase de lavados tras la ligación de los adaptadores está diseñada para enriquecer los fragmentos de ADN de >3 kb o para purificar todos los fragmentos por igual, según el tampón que se utilice -Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).
Para enriquecer fragmentos de ADN de 3 kb o mayores, utilizar el tampón para fragmentos largos, Long Fragment Buffer (LFB).
Para conservar fragmentos de ADN de todos los tamaños, utilizar el tampón para fragmentos cortos, Short Fragment Buffer (SFB).
Descongelar el vial Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) a temperatura ambiente, agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
En un tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml mezclar en el siguiente orden:
Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| Muestra de ADN del paso anterior | 60 µl |
| Ligation Adapter (LA) | 5 µl |
| Ligation Buffer (LNB) | 25 µl |
| Salt-T4® DNA Ligase | 10 µl |
| Total | 100 µl |
Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.
Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.
Añadir 40 μl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción y mezclar dando suaves golpes al tubo con el dedo.
Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.
Lavar las microesferas magnéticas con 250 μl o de Long Fragment Buffer (LFB) o de Short Fragment Buffer (SFB). Golpear el tubo suavemente con el dedo para resuspender las microesferas, centrifugar, colocar en la gradilla magnética y dejar que las microesferas precipiten. Retirar el sobrenadante con una pipeta y desechar.
Repetir el paso anterior.
Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 25 µl Elution Buffer (EB). Spin down and incubate for 10 minutes at room temperature. For high molecular weight DNA, incubating at 37°C can improve the recovery of long fragments.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Remove and retain 25 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Dispose of the pelleted beads
CHECKPOINT
Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.
Depending on your DNA library fragment size, prepare your final library in 32 µl of Elution Buffer (EB).
| Fragment library length | Flow cell loading amount |
|---|---|
| Very short (<1 kb) | 100 fmol |
| Short (1-10 kb) | 35–50 fmol |
| Long (>10 kb) | 300 ng |
Note: If the library yields are below the input recommendations, load the entire library.
If required, we recommend using a mass to mol calculator such as the NEB calculator.
FIN DEL PROCESO
La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo o a 4 °C hasta el momento de cargar.
CONSEJO
Recomendaciones de guardado de la biblioteca
Se recomienda guardar las bibliotecas en tubos Eppendorf DNA LoBind a 4 ⁰C, durante periodos de tiempo cortos o en caso de uso repetido, por ejemplo, para recargar celdas de flujo entre lavados. Para uso individual y para conservar a largo plazo por periodos de más de 3 meses, se recomienda guardar las bibliotecas a -80 ⁰C en tubos Eppendorf DNA LoBind.
5. Priming and loading the PromethION Flow Cell
Material
- Sequencing Buffer (SB)
- Library Beads (LIB)
- Library Solution (LIS)
- Flow Cell Tether (FCT)
- Flow Cell Flush (FCF)
Consumibles
- Celda de flujo PromethION
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- PromethION device
- PromethION Flow Cell Light Shield
- P1000 pipette and tips
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P20
IMPORTANTE
This kit is only compatible with R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M).
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, Flow Cell Tether (FCT) y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex. Centrifugar brevemente y poner en hielo.
To prepare the flow cell priming mix, combine Flow Cell Tether (FCT) and Flow Cell Flush (FCF), as directed below. Mix by vortexing at room temperature.
Note: We are in the process of reformatting our kits with single-use tubes into a bottle format. Please follow the instructions for your kit format.
Single-use tubes format: Add 30 µl Flow Cell Tether (FCT) directly to a tube of Flow Cell Flush (FCF).
Bottle format: In a clean suitable tube for the number of flow cells, combine the following reagents:
| Reagent | Volume per flow cell |
|---|---|
| Flow Cell Flush (FCF) | 1,170 µl |
| Flow Cell Tether (FCT) | 30 µl |
| Total volume | 1,200 µl |
IMPORTANTE
Una vez sacadas de la nevera, esperar 20 minutos antes de insertar las celdas de flujo en el dispositivo y así darles tiempo a que estén a temperatura ambiente. En entornos húmedos se puede formar condensación. Inspeccione las clavijas doradas del conector, situadas en la parte superior e inferior de la celda de flujo, en busca de condensación y si la hubiera, límpiela con una toallita sin pelusa. Procure que la almohadilla térmica (color gris oscuro) esté enganchada en la parte posterior.
For PromethION 2 Solo, load the flow cell(s) as follows:
Place the flow cell flat on the metal plate.
Slide the flow cell into the docking port until the gold pins or green board cannot be seen.
For the PromethION 24/48, load the flow cell(s) into the docking ports:
- Line up the flow cell with the connector horizontally and vertically before smoothly inserting into position.
- Press down firmly onto the flow cell and ensure the latch engages and clicks into place.
IMPORTANTE
Insertion of the flow cells at the wrong angle can cause damage to the pins on the PromethION and affect your sequencing results. If you find the pins on a PromethION position are damaged, please contact support@nanoporetech.com for assistance.
Slide the inlet port cover clockwise to open.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer solución amortiguadora de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que la solución cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
After opening the inlet port, draw back a small volume to remove any air bubbles:
- Set a P1000 pipette tip to 200 µl.
- Insert the tip into the inlet port.
- Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, or until you see a small volume of buffer entering the pipette tip.
Load 500 µl of the priming mix into the flow cell via the inlet port, avoiding the introduction of air bubbles. Wait five minutes. During this time, prepare the library for loading using the next steps in the protocol.
Mezclar minuciosamente con la pipeta el contenido del vial Library Beads (LIB).
IMPORTANTE
El vial Library Beads (LIB) contiene microesferas en suspensión. Las microesferas sedimentan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.
En la mayoría de experimentos de secuenciación recomendamos utilizar Library Beads (LIB). El reactivo Library Solution (LIS) está disponible en caso de utilizar bibliotecas más viscosas.
In a new 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare the library for loading as follows:
| Reagent | Volume per flow cell |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 100 µl |
| Library Beads (LIB) thoroughly mixed before use, or Library Solution (LIS) | 68 µl |
| DNA library | 32 µl |
| Total | 200 µl |
Note: Library loading volume has been increased to improve array coverage.
Complete the flow cell priming by slowly loading 500 µl of the priming mix into the inlet port.
Mezclar la biblioteca suavemente con la pipeta, justo antes de cargar.
Load 200 µl of library into the inlet port using a P1000 pipette.
Close the valve to seal the inlet port.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
If the light shield has been removed from the flow cell, install the light shield as follows:
- Align the inlet port cut out of the light shield with the inlet port cover on the flow cell. The leading edge of the light shield should sit above the flow cell ID.
- Firmly press the light shield around the inlet port cover. The inlet port clip will click into place underneath the inlet port cover.
FIN DEL PROCESO
Close the PromethION lid when ready to start a sequencing run on MinKNOW.
Wait a minimum of 10 minutes after loading the flow cells onto the PromethION before initiating any experiments. This will help to increase the sequencing output.
6. Data acquisition and basecalling
How to start sequencing
Once you have loaded your flow cell, the sequencing run can be started on MinKNOW, our sequencing software that controls the device, data acquisition and real-time basecalling. For more detailed information on setting up and using MinKNOW, please see the MinKNOW protocol.
MinKNOW can be used and set up to sequence in multiple ways:
- On a computer either direcly or remotely connected to a sequencing device.
- Directly on a GridION or PromethION 24/48 sequencing device.
For more information on using MinKNOW on a sequencing device, please see the device user manuals:
To start a sequencing run on MinKNOW:
1. Navigate to the start page and click Start sequencing.
2. Fill in your experiment details, such as name and flow cell position and sample ID.
3. Select the sequencing kit used in the library preparation on the Kit page.
4. Configure the sequencing and output parameters for your sequencing run or keep to the default settings on the Run configuration tab.
Note: If basecalling was turned off when a sequencing run was set up, basecalling can be performed post-run on MinKNOW. For more information, please see the MinKNOW protocol.
5. Click Start to initiate the sequencing run.
Identificación de bases duplex
La química del kit 14 ha mejorado la identificación de bases duplex, la cual requiere, tras realizar la identificación de bases simplex en MinKNOW, volver a identificar las bases en el programa Dorado con herramientas de identificación de bases duplex.
Para obtener información detallada sobre la configuración de un experimento de secuenciación, tanto para la identificación de bases simplex, como para la duplex, consultar la hoja informativa Kit 14 sequencing and duplex basecalling.
Nota: Mientras Dorado se esté ejecutando, recomendamos parar otros procesos de identificación de bases, para potenciar la memoria disponible en el programa. Esta acción se puede detener y reiniciar, cuando Dorado haya terminado, a través de la interfaz gráfica de MinKNOW.
Análisis de datos
Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.
Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de análisis disponible durante y tras la identificación de bases, consulte el documento Data Analysis.
En la sección Análisis, se describen otras opciones para analizar los datos.
7. Reutilización y devolución de celdas de flujo
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a entre 2 °C y 8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
CONSEJO
Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución, lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí están las instrucciones para devolver celdas de flujo.
IMPORTANTE
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
8. Análisis
Análisis posterior a la identificación de bases
Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de identificación de bases:
1. Procesos de trabajo en EPI2ME
Para realizar un análisis de datos exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y procesos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, situados en la sección EPI2ME de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los procesos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
2. Herramientas de análisis
El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.
3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad
Si en ninguno de los recursos anteriores se proporciona un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.
9. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) | El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI. |
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre el tema en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Al trabajar con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas. |
Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Escasa recuperación | Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. | 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza. |
| Escasa recuperación | Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado | Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar.  |
| Escasa recuperación tras la preparación de extremos | El paso de lavado utilizó etanol a <70 % | Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto. |
10. Problemas durante el experimento de secuenciación
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que tras verificar la celda de flujo
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, y antes de acondicionarla, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de purgado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca podría haber dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la evaluación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación podría deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir instrucciones de almacenamiento adicionales. |
Ocupación de poro por debajo del 40 %
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Ocupación de poro <40 % | No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo | Procure cargar la biblioteca al volumen y la concentración adecuados, tal como se indica en el protocolo correspondiente. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular fmoles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, (opción "dsDNA: μg to fmol"). |
| Ocupación de poro próxima a 0 | Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN | En la fase de ligación del adaptador, utilice NEBNext Quick Ligation Module (E6056) y el tampón Ligation Buffer (LNB) de Oxford Nanopore Technologies, suministrado en el kit de secuenciación. Recuerde añadir la cantidad correcta de cada reactivo. Prepare una biblioteca de control con lambda para valorar la integridad de los reactivos de otros fabricantes. |
| Ocupación de poro próxima a 0 | Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y en la fase de lavado, después de la ligación del adaptador, se utilizó etanol en lugar de Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB). | El etanol puede desnaturalizar la proteína motor en los adaptadores de secuenciación. Usar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) después de la ligación de los adaptadores. |
| Ocupación de poro próxima a 0 | No hay anclaje en la celda de flujo | Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (Flush Tether (FLT) para los kits 9, 10 y 11, y Flow Cell Tether (FCT) para el kit 14). Asegurarse de añadir un anclaje —Flush Tether (FLT) o Flow Cell Tether (FCT)— al tampón antes del cebado; el tampón utilizado es Flush Buffer (FB) para los kits 9, 10 y 11 y Flow cell Flush (FCF) para el Kit 14. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción y preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.  En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)  Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros "no disponibles". | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores". Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta: 1. Realizar un purgado de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el acondicionamiento de la celda y carga de la biblioteca podrían dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de acondicionamiento y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte los métodos de extracción de ADN en la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Purificar con el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Fluctuación de la temperatura
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar con una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW dispone de un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continúa. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede provocar disminuciones en el rendimiento y generar índices de calidad Qscore menores. Corrija la ubicación del dispositivo, procurando que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace. |
Last updated: 12/13/2024
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