Esta lista contiene los requisitos mínimos para instalar el PromethION en su institución. Encontrará información más detallada de los mismos a lo largo del documento. Nótese, es posible utilizar una conexión de fibra o cobre.

El PromethION es un dispositivo de sobremesa para secuenciar por nanoporos, diseñado para procesar y analizar hasta 24 o 48 celdas de flujo. Es perfecto para laboratorios con múltiples proyectos que necesiten beneficiarse de las ventajas de la secuenciación por nanoporos:

• Preparación de bibliotecas sencilla
• Análisis en tiempo real
• Comprensión biológica a partir de lecturas largas

Además, el PromethION 24/48 permite a los usuarios ofrecer la secuenciación por nanoporos como servicio certificado.

El PromethION tiene la ventaja de incluir un ordenador integrado, que permite gestionar el dispositivo, facilita la adquisición de datos, la identificación de bases y la transmisión de datos, todo ello sin suponer un peso adicional en la infraestructura informática existente. El PromethION 24 Combined tiene los mismos requisitos informáticos que el PromethION 24/48 Serie A y está disponible solo en países seleccionados.

Un programa personalizado preinstalado, creado por Oxford Nanopore Technologies, lleva a cabo la gestión del dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en el PromethION. A continuación se muestra el flujo de trabajo bioinformático predeterminado cuando se utiliza el PromethION:

Imagen 1: Flujo de trabajo bioinformático por defecto en el dispositivo PromethION 24/48

El PromethION está diseñado en torno a una interfaz de usuario sencilla, sobre una electrónica personalizada de vanguardia, que proporciona soluciones de análisis en tiempo real. Las características técnicas del dispositivo variarán según se trate del modelo P24 o P48:

*Intervalo de temperatura de funcionamiento: 5° C a 40° C.
**La unidad de adquisición de datos PromethION Serie A contiene una fuente de alimentación adicional, para garantizar la fiabilidad.

MinKNOW recoge información de telemetría durante los experimentos de secuenciación, de acuerdo con los Términos y condiciones, que permiten supervisar el rendimiento de un dispositivo y la resolución de problemas a distancia. Algunos de estos datos provienen de campos de texto libre, así que no debería incluir datos de identificación personal. No recogemos ningún dato de secuenciación.

La plataforma EPI2ME está alojada en AWS y proporciona soluciones de análisis basadas en la nube para múltiples aplicaciones. Los usuarios cargan datos de secuenciación en formato FASTQ a través del Agente de EPI2ME, que procesa los datos a través de flujos bioinformáticos definidos dentro del Portal EPI2ME. Las descargas de EPI2ME se realizan en forma de Datos + Telemetría o solo Telemetría. El portal de EPI2ME usa información de telemetría para cumplimentar informes.

La dirección IP desde la que se recibirán actualizaciones dependerá de su ubicación geográfica. Es posible actualizar el programa a través de la interfaz de usuario o mediante la herramienta apt del terminal, por lo que se necesita acceso solo de salida. Cuando haya actualizaciones disponibles, lo notificaremos a través de la comunidad Nanopore y proporcionaremos instrucciones de actualización en cada nota de lanzamiento.

Los datos de secuenciación por nanoporos se almacenan en tres tipos de archivos: POD5, FASTQ y BAM. La información general de bases identificadas se almacena en un archivo de tipo sequencing_summary.txt:

• POD5 es un formato de archivo desarrollado por Oxford Nanopore, que almacena datos de secuenciación por nanoporos de manera accesible y sustituye al formato .fast5, ya obsoleto. Este nuevo formato lee y escribe datos más rápido, utiliza menos recursos informáticos y tiene un tamaño de archivo de datos sin procesar más pequeño que .fast5. Los archivos POD5 se generan en lotes cada 10 minutos. Si se emplea la técnica de adición de códigos, es posible dividir los archivos según los códigos de barras, aunque esta opción está desactivada por defecto.
• .fast5 es un formato de archivo obsoleto, basado en el archivo .hdf5, que contiene toda la información necesaria para analizar datos de secuenciación por nanoporos y rastrearlos hasta su origen. Un archivo .fast5 contiene datos de múltiples lecturas (4000 lecturas como mínimo) y tiene varios cientos Mb de tamaño.
• FASTQ es un formato de almacenamiento de secuencias basado en texto, que contiene tanto la secuencia de ADN/ARN como sus índices de calidad. Por defecto, los experimentos de secuenciación por nanoporos guardan hasta 4000 secuencias de ADN en un archivo FASTQ. El tamaño del archivo puede variar de < 1 Mb a decenas de Mb, dependiendo del número y la longitud de las secuencias.
• Los archivos BAM proporcionan resultados si se realizan alineaciones o identificación de bases modificadas en el conjunto de datos de bases identificadas.
• Los archivos sequencing_summary.txt contienen metadatos de las lecturas de bases identificadas de un experimento individual. La información incluye un identificador de lecturas, longitud de secuencias, puntuación Q-score por lectura, duración, etc. El tamaño del archivo resumen de las secuencias dependerá del número de lecturas secuenciadas.

Los tamaños de archivo de ejemplo representados en la tabla siguiente están basados en diferentes rendimientos de una sola celda de flujo, con una ejecución que guarda archivos POD5, FASTQ y BAM, con un N50 de lectura de 23 kb. RMT= Rendimiento máximo teórico.

A medida que avance el experimento, se generarán archivos POD5 de manera automática de todas las lecturas. Si decide identificar bases con sus datos, el programa MinKNOW utilizará archivos POD5 para generar datos de secuenciación, que luego se almacenarán en archivos FASTQ o BAM.

La capacidad de almacenamiento de la Unidad de adquisición de datos PromethION Serie A está diseñada como una caché temporal para que los datos se escriban en MinKNOW. El espacio del dispositivo no está diseñado para almacenar datos de secuenciación a largo plazo y no debería usarse para tal fin. Cuando el dispositivo funcione a plena capacidad, es fundamental que los datos se transmitan en tiempo real para prevenir que los experimentos se interrumpan debido a falta de espacio. Por ello, la empresa o entidad del cliente debe asegurar que la conexión a la infraestructura local tenga suficiente banda ancha para prevenir que los datos se acumulen y creen un embotellamiento. El PromethION ofrece dos puertos de 10 Gb/s para este propósito y el usuario deberá escoger entre utilizar un cable Ethernet o uno de Fibra. Los puertos USB no proporcionan suficiente banda ancha para transferir datos en tiempo real, por lo que no deberían utilizarse. A continuación hay un ejemplo práctico que muestra velocidades de transferencia de datos ideales; las velocidades de transferencia real podrían ser más lentas, en función de la configuración de red.

El PromethION funciona con Ubuntu 20.04 y es capaz de montar múltiples tipos de sistemas de archivos. Recomendamos el almacenamiento en NFS o CIFS. El almacenamiento en tiempo real debería ser SSD por su alta velocidad de escritura, comparado con HDD. Tras la escritura inicial en unidades SSD conectadas, es posible trasladar los datos con una velocidad de escritura más lenta para almacenarlos a largo plazo.

La forma (y volumen) de datos que se almacenen dependerá de los requisitos del usuario:

• Almacenar archivos .POD5 con datos de lecturas sin procesar permitirá volver a identificar las bases de esos datos cuando Oxford Nanopore Technologies lance nuevos algoritmos. En estos casos, nuevas versiones de identificadores de bases han permitido mejorar significativamente la precisión en conjuntos de datos existentes gracias a la reidentificación de bases. Además, tanto las herramientas de terceros como las de Oxford Nanopore usan la información de la señal sin procesar, contenida en el .POD5, para extraer información adicional, por ejemplo la identificación de bases modificadas, la identificación de polimorfismos de un solo nucleótido guiados por la referencia o la limpieza de datos.
• Conservar solo los archivos FASTQ permitirá utilizar las herramientas de análisis habituales, utilizando la secuencia de ADN/ARN, pero no se podrán generar más datos cuando aparezcan nuevas versiones de identificador de bases.

Oxford Nanopore no facilita recomendaciones específicas de almacenamiento, ya que ellas dependerán de cada lugar. Sin embargo, las pautas y requisitos mencionados deberían tomarse en cuenta.

¿Puedo utilizar un sistema de alimentación ininterrumpida (SAI) con el PromethION 24/48? Sí, es posible usar un sistema SAI, aunque no podemos recomendar ningún producto específico.

¿Qué módulos SFP+ son compatibles con los puertos de fibra del PromethION 24/48? Todos los módulos SPF+ son compatibles; seleccione uno que se adecúe a la infraestructura de su institución.

¿Qué recomiendan para transferir datos en tiempo real desde el PromethION 24/48, durante un experimento de secuenciación? En los paquetes de programa del PromethION se proporcionan scripts que permiten transferir datos en tiempo real a una ubicación remota. Para más información, contacte con support@nanoporetech.com

¿Qué tipo de tipo de almacenamiento recomiendan, que pueda conectar al PromethION 24/48? El PromethION es compatible con cualquier dispositivo NAS; recomendamos que analice sus necesidades de almacenamiento con el personal de informática de su institución y que tenga en cuenta la información citada, para obtener la mejor solución para sus necesidades