Rapid sequencing gDNA - Lambda control (SQK-RAD004)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Rapid sequencing gDNA - Lambda control (SQK-RAD004) V RSE_9045_v1_revAE_14Aug2019

The fastest and simplest protocol for genomic DNA involving:

  • ~10 mins library prep
  • fragmentation
  • no third-party ligase needed

For Research Use Only

This is a Legacy product This kit has now been discontinued and we recommend all customers upgrade to the latest chemistry for their relevant kit which is available on the Store.

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

The fastest and simplest protocol for genomic DNA involving:

  • ~10 mins library prep
  • fragmentation
  • no third-party ligase needed

For Research Use Only

This is a Legacy product This kit has now been discontinued and we recommend all customers upgrade to the latest chemistry for their relevant kit which is available on the Store.

Document version: RSE_9045_v1_revAE_14Aug2019

1. Overview of the protocol

IMPORTANTE

This is a Legacy product

This kit has now been discontinued and we recommend all customers upgrade to the latest chemistry for their relevant kit which is available on the Store. For further information on please see the product update page.

Rapid Sequencing Kit features

This kit is recommended for users who:

  • require a short preparation time
  • have limited access to laboratory equipment

Introduction to Rapid Lambda Control protocol (SQK-RAD004)

This protocol describes the step-by-step instructions to complete a Lambda Control experiment using the Rapid Sequencing Kit (SQK-RAD004) on the MinION Mk1B. The control experiment uses a high-quality DNA sample supplied in the kit. It allows you to become familiar with nanopore sequencing before preparing your own library.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

You will need to:

  • Tagment your DNA using the Fragmentation Mix in the kit
  • Attach sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
  • Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell

RAD004 workflow

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, selecting "SQK-RAD004 - control experiment" in kit selection. Note: When using the control experiment kit, run length will automatically be reduced to 6 hours.
  • Start the EPI2ME software and select a workflow for Lambda alignment
IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

  • Rapid Sequencing Kit (SQK-RAD004)
  • R9.4.1 (FLO-MIN106) flow cells
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

2. Equipment and consumables

Material
  • Rapid Sequencing Kit (SQK-RAD004)
  • Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002)
Consumibles
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
Instrumental
  • Microcentrífuga
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Temporizador
  • Termociclador o termobloque
Equipo opcional
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

For this protocol, you will need Lambda DNA (LMD) contained in the Rapid Sequencing Kit.

Rapid Sequencing Kit contents

rad004 v1

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
Lambda DNA LMD Yellow 1 88
Fragmentation Mix FRA Brown 1 30
Rapid Adapter RAP Green 1 10
Loading Beads LB Pink 1 360
Sequencing Buffer SQB Red 1 300
IMPORTANTE

Please note that the Sequencing Tether (SQT) tube will NOT be used in this protocol.

Flow Cell Priming Kit contents (EXP-FLP002)

FLP

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (μl)
Flush Buffer FB Blue 6 1,170
Flush Tether FLT Purple 1 200

3. Computer requirements and software

Requisitos informáticos para el MinION Mk1B

Para secuenciar con el MinION Mk1B es necesario tener un ordenador o portátil de alto rendimiento, que pueda soportar la velocidad de adquisición de datos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1B IT Requirements.

Requisitos informáticos para el MinION Mk1C

El MinION Mk1C contiene ordenador y pantalla integrados, lo que elimina la dependencia de cualquier accesorio para generar y analizar datos de nanoporos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1C IT Requirements.

MinION Mk1D IT requirements

Sequencing on a MinION Mk1D requires a high-spec computer or laptop to keep up with the rate of data acquisition. For more information, refer to the MinION Mk1D IT requirements document.

Software for nanopore sequencing

MinKNOW

The MinKNOW software controls the nanopore sequencing device, collects sequencing data and basecalls in real time. You will be using MinKNOW for every sequencing experiment to sequence, basecall and demultiplex if your samples were barcoded.

For instructions on how to run the MinKNOW software, please refer to the MinKNOW protocol.

EPI2ME (optional)

The EPI2ME cloud-based platform performs further analysis of basecalled data, for example alignment to the Lambda genome, barcoding, or taxonomic classification. You will use the EPI2ME platform only if you would like further analysis of your data post-basecalling.

For instructions on how to create an EPI2ME account and install the EPI2ME Desktop Agent, please refer to this link.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000

4. Library preparation

Material
  • Lambda DNA (LMD)
  • Fragmentation Mix (FRA)
  • Rapid Adapter (RAP)
Consumibles
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
Instrumental
  • Termociclador o termobloque
  • Pipeta y puntas P2
  • Pipeta y puntas P10

DNA tagmentation

Thaw kit components at room temperature, spin down briefly using a microfuge and mix by pipetting as indicated by the table below:

Reagent 1. Thaw at room temperature 2. Briefly spin down 3. Mix well by pipetting
Lambda DNA
(50 µg/ml) (LMD)		 ✓ ✓ ✓
Fragmentation Mix (FRA) Not frozen ✓ ✓
Rapid Adapter (RAP) Not frozen ✓ ✓
Sequencing Buffer (SQB) ✓ ✓ ✓*
Loading Beads (LB) ✓ ✓ Mix by pipetting or vortexing immediately before use
Flush Buffer (FLB) ✓ ✓ ✓*
Flush Tether (FLT) ✓ ✓ ✓

*Vortexing, followed by a brief spin in a microfuge, is recommended for Sequencing Buffer (SQB) and Flush Buffer (FLB).

Please note that the Sequencing Tether (SQT) tube will NOT be used in this protocol. It is provided in the kit for potential future product compatibility.

Una vez descongelado, colocar todos los viales del kit en hielo.

In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:

| Reagent | Volume | | --- | --- | --- | | Lambda DNA | 7.5 μl | | FRA | 2.5 μl | | Total | 10 μl |

Mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo y centrifugar brevemente.

Incubate the tube at 30°C for 1 minute and then at 80°C for 1 minute. Briefly put the tube on ice to cool it down.

CONSEJO

If heat blocks are used instead of a thermal cycler, incubation at both temperatures should be extended to 2 minutes.

CHECKPOINT

375 ng tagmented Lambda DNA in 10 μl is taken into the next step.

Adapter attachment

Add 1 μl of RAP to the tube.

Mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo y centrifugar brevemente.

Incubar la reacción durante 5 minutos a temperatura ambiente.

FIN DEL PROCESO

La biblioteca de ADN preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo hasta el momento de cargar.

5. Priming and loading the SpotON Flow Cell

Material
  • Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002)
  • Sequencing Buffer (SQB)
  • Loading Beads (LB)
Consumibles
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
Instrumental
  • MinION device
  • SpotON Flow Cell
  • Pantalla protectora de celdas de flujo MinION/GridION
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
CONSEJO

Acondicionar y cargar la celda de flujo

Recomendamos a los usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Thaw the Sequencing Buffer (SQB), Loading Beads (LB), Flush Tether (FLT) and one tube of Flush Buffer (FB) at room temperature before mixing the reagents by vortexing, and spin down at room temperature.

To prepare the flow cell priming mix, add 30 µl of thawed and mixed Flush Tether (FLT) directly to the tube of thawed and mixed Flush Buffer (FB), and mix by vortexing at room temperature.

Open the MinION device lid and slide the flow cell under the clip.

Press down firmly on the flow cell to ensure correct thermal and electrical contact.

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verificar la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado la celda de flujo con anterioridad, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

Slide the priming port cover clockwise to open the priming port.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer solución amortiguadora de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que la solución cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de purgado, comprobar si hay burbujas de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de solución amortiguadora para quitar las burbujas:

  1. Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
  2. Introducir la punta de la pipeta en el puerto de purgado.
  3. Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de solución amortiguadora entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de solución amortiguadora circulando desde el puerto de purgado a través de la matriz de poros.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Cargar 800 μl de mezcla de acondicionamiento por del puerto de purgado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar cinco minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5 SPANISH

Thoroughly mix the contents of the Loading Beads (LB) tubes by vortexing.

In a new tube, prepare the library for loading as follows:

Reagent Volume per flow cell
Sequencing Buffer (SQB) 34 µl
Loading Beads (LB), mixed immediately before use 25.5 µl
Nuclease-free water 4.5 µl
DNA library 11 µl
Total 75 µl

Note: Load the library onto the flow cell immediately after adding the Sequencing Buffer (SQB) and Loading Beads (LB) because the fuel in the buffer will start to be consumed by the adapter.

IMPORTANTE

The Loading Beads (LB) tube contains a suspension of beads. These beads settle very quickly. It is vital that they are mixed immediately before use.

Terminar de acondicionar la celda de flujo:

  1. Levantar con suavidad la tapa del puerto de carga SpotON.
  2. Cargar 200 µl de mezcla de acondicionamiento en el puerto de purgado (no en el puerto SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

Flow Cell Loading Diagrams Step 5

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5 SPANISH 2

Mezclar la biblioteca suavemente con la pipeta, justo antes de cargar.

Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto SpotON de la celda de flujo. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.

Flow Cell Loading Diagram Step 07 V5 SPANISH

Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de purgado.

Step 8 update - SPANISH

Flow Cell Loading Diagrams Step 9 SPANISH

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:

  1. Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.

  2. Posar la pantalla protectora sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised. SPANISH

ATENCIÓN

La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipular la celda de flujo con cuidado.

FIN DEL PROCESO

Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.

6. Adquisición de datos e identificación de bases

Cómo empezar a secuenciar

Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.

Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:

  • En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o a distancia.
  • Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.

Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:

Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:

1. Ir a la página principal y pulsar "Iniciar secuenciación".

2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de la muestra.

3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.

4. En la pestaña Configuración del experimento, ajustar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o mantener la configuración por defecto.

Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, es posible identificar las bases tras la ejecución en MinKNOW. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.

5. En la página Inicio, pulsar en la casilla Iniciar la secuenciación.

Análisis de datos

Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.

Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de análisis disponible durante y tras la identificación de bases, consulte el documento Data Analysis.

En la sección Análisis, se describen otras opciones para analizar los datos.

7. Reutilización y devolución de celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a entre 2 °C y 8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución, lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí están las instrucciones para devolver celdas de flujo.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

8. Análisis posterior

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:

1. Flujos de trabajo de EPI2ME

A fin de realizar un análisis en profundidad de los datos, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales sobre bioinformática y flujos de trabajo, que están disponibles en EPI2ME. La plataforma proporciona un espacio donde los flujos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis para la investigación

Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y flujos de trabajo bioinformáticos, disponibles en EPI2ME Labs, que encontrará en la sección del mismo nombre de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los proyectos que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte el centro de recursos Resource Centre y busque herramientas bioinformáticas para su aplicación. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/programas informáticos.

9. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre el tema en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Al trabajar con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <70 % Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

10. Issues during the sequencing run

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que tras verificar la celda de flujo

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, y antes de acondicionarla, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de purgado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca podría haber dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la evaluación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación podría deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir instrucciones de almacenamiento adicionales.

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the sequencing kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents.
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FLT/FCT tube). Make sure FLT/FCT was added to FB/FCF before priming.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción y preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros "no disponibles".		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores". Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta:

1. Realizar un purgado de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el acondicionamiento de la celda y carga de la biblioteca podrían dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de acondicionamiento y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte los métodos de extracción de ADN en la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Purificar con el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Reducción de la velocidad de secuenciación y del índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Reducción de la velocidad de secuenciación y el índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación En la química del kit 9 (p. ej., SQK-LSK109), cuando la celda de flujo está sobrecargada con la biblioteca se observa un consumo rápido de combustible (consulte el protocolo correspondiente a su biblioteca de ADN para ver las recomendaciones) Añadir más combustible a la celda de flujo, siguiendo las instrucciones en el protocolo de MinKNOW. En futuros experimentos, cargar cantidades menores de biblioteca en la celda de flujo.

Fluctuación de la temperatura

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observaciones Posibles causas Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar con una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW dispone de un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continúa. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede provocar disminuciones en el rendimiento y generar índices de calidad Qscore menores. Corrija la ubicación del dispositivo, procurando que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace.

Guppy – no input .fast5 was found or basecalled

Observation Possible cause Comments and actions
No input .fast5 was found or basecalled input_path did not point to the .fast5 file location The --input_path has to be followed by the full file path to the .fast5 files to be basecalled, and the location has to be accessible either locally or remotely through SSH.
No input .fast5 was found or basecalled The .fast5 files were in a subfolder at the input_path location To allow Guppy to look into subfolders, add the --recursive flag to the command

Guppy – no Pass or Fail folders were generated after basecalling

Observation Possible cause Comments and actions
No Pass or Fail folders were generated after basecalling The --qscore_filtering flag was not included in the command The --qscore_filtering flag enables filtering of reads into Pass and Fail folders inside the output folder, based on their strand q-score. When performing live basecalling in MinKNOW, a q-score of 7 (corresponding to a basecall accuracy of ~80%) is used to separate reads into Pass and Fail folders.

Guppy – unusually slow processing on a GPU computer

Observation Possible cause Comments and actions
Unusually slow processing on a GPU computer The --device flag wasn't included in the command The --device flag specifies a GPU device to use for accelerate basecalling. If not included in the command, GPU will not be used. GPUs are counted from zero. An example is --device cuda:0 cuda:1, when 2 GPUs are specified to use by the Guppy command.

Last updated: 9/7/2023

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MinION