PCR tiling of African Swine Fever (ASF) virus (SQK-LSK109 with EXP-NBD104 or EXP-NBD114)


Descripción general

For Research Use Only

Protocol developed by Amanda Warr et al., 2021

This is a Legacy product This kit is available on the Legacy page of the store. We are in the process of gathering data to support the upgrade of this protocol to our latest chemistry. Further information regarding protocol upgrades will be provided on the Community as soon as they are available over the next few months.

Document version: ASFV_9159_v109_revE_18May2022

1. Overview of the protocol

IMPORTANTE

This is a Legacy product

This kit is available on the Legacy page of the store. We are in the process of gathering data to support the upgrade of this protocol to our latest chemistry. Further information regarding protocol upgrades will be provided on the Community as soon as they are available over the next few months. For further information on please see the product update page.

IMPORTANTE

This protocol is a work in progress, and some details are expected to change over time. Please make sure you always use the most recent version of the protocol.

Native Barcoding Expansion 1-12 and 13-24 features

These kits are recommended for users who:

  • wish to multiplex samples to reduce price per sample
  • want to optimise their sequencing experiment for throughput
  • require control over read length
  • are interested in utilising upstream processes such as size selection or whole genome amplification

Introduction to the ASFV Native Barcoding protocol

This protocol describes an efficient, low-cost method to sequence ASFV at scale. The method uses tiled PCR amplification of the virus to obtain good coverage, while enabling sample multiplexing to reduce run costs.

The kits used are the Native Barcoding Expansion 1-12 (EXP-NBD104) and 13-24 (EXP-NBD114), in conjunction with the Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109). There are 24 unique barcodes if using both expansion kits, allowing the user to pool up to 24 different samples in one sequencing experiment. It is highly recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Prepare your library

You will need to:

  • Amplify the viral genome using tiled primers, purify and pool the amplicons
  • Repair the DNA, and prepare the DNA ends for barcode attachment
  • Ligate Native barcodes supplied in the kit to the DNA ends
  • Ligate sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
  • Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell

Native barcoding workflow amplicons

Sequencing

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
  • Assemble and analyse the ASF genome using bioinformatics tools of your choice (recommendations included in the "Downstream analysis" sections of the protocol)
IMPORTANTE

We do not recommend mixing barcoded libraries with non-barcoded libraries prior to sequencing.

IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

  • Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109)
  • Native Barcoding Expansions 1-12 (EXP-NBD104) and 13-24 (EXP-NBD114)
  • FLO-MIN106 (R9.4.1) flow cells
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

2. Equipment and consumables

Material
  • Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109)
  • Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002)
  • Native Barcoding Expansion 1-12 (EXP-NBD104) and 13-24 (EXP-NBD114) if multiplexing more than 12 samples
  • ASFV-positive blood samples

Consumibles
  • ASFV primers
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • Lysis buffer (10 mM ammonium chloride, 150 mM sodium EDTA, 10 mM sodium bicarbonate)
  • 5x TEN buffer (0.05 M EDTA, 0.5 M NaCl, 20 mg/ml Proteinase K, 20% SDS, in 0.05 M Tris-HCl, pH 8.0)
  • Isopropanol, 100% (Fisher, 10723124)
  • NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB E7180S or E7180L) (módulo de acompañamiento NEBNext de secuenciación por ligación para Oxford Nanopore Technologies®) Como alternativa, se pueden utilizar los siguientes productos de NEBNext®:
  • NEBNext FFPE Repair Mix (NEB M6630) (mezcla de reparación de ADN)
  • NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (NEB E7546) (Módulo de reparación de extremos/Adición de dA)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056) (Módulo de ligación rápida)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water

Instrumental
  • Heat block or water bath set to 95°C
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Termociclador
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Cubeta con hielo
  • Temporizador
Equipo opcional
  • Bioanalizador Agilent (o equivalente)
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
  • Centrifuga Eppendorf 5424 (o equivalente)

NEBNext® Companion Module para secuenciación por ligación, de Oxford Nanopore Technologies®

A los clientes que no conozcan la secuenciación por nanoporos, se les recomienda que adquieran el módulo de acompañamiento NEBNext® Ligation Sequencing para Oxford Nanopore Technologies® (NEB E7180S o E7180L), que contiene todos los reactivos NEB necesarios para usar con el kit Ligation Sequencing Kit.

Nótese que en los protocolos con amplicones no es necesario usar ni la mezcla de reparación de ADN NEBNext FFPE DNA Repair Mix, ni el tampón de reparación de ADN NEBNext FFPE DNA Repair Buffer.

Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109) contents

SQK-LSK109 v1

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
DNA CS DCS Yellow 1 50
Adapter Mix AMX Green 1 40
Ligation Buffer LNB Clear 1 200
L Fragment Buffer LFB White cap, orange stripe on label 2 1,800
S Fragment Buffer SFB Grey 2 1,800
Sequencing Buffer SQB Red 2 300
Elution Buffer EB Black 1 200
Loading Beads LB Pink 1 360

Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002) contents

FLP

Name Acronym Cap colour No. of vial Fill volume per vial (μl)
Flush Buffer FB Blue 6 1,170
Flush Tether FLT Purple 1 200

Native Barcoding Expansion 1-12 (EXP-NBD104) and 13-24 (EXP-NBD114) contents

EXP-NBD104 kit contents EXP-NBD104 kit contents

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (μl)
Native Barcode 01-12 NB01-12 White 12 20
Adapter Mix II AMII Green 1 40

**EXP-NBD114 kit contents** ![EXP-NBD114 kit contents](//images.ctfassets.net/76r1b51it64n/355IyPje5ymq4OOK6maywi/ebb06336aa81351f28d1bc46a1d968f4/EXP-NBD114_kit_contents.svg)
Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (μl)
Native Barcode 13-24 NB13-24 White 12 20
Adapter Mix II AMII Green 1 40

Native barcode sequences

The native barcode sequences are the reverse complement of the corresponding barcode sequence in other kits. 24 unique barcodes are available in the Native Barcoding Expansion 1-12 and 13-24 (EXP-NBD104 and EXP-NBD114).

Native Barcoding Expansion 1-12 and 13-24 (EXP-NBD104 and EXP-NBD114)

Component Forward sequence Reverse sequence
NB01 CACAAAGACACCGACAACTTTCTT AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG
NB02 ACAGACGACTACAAACGGAATCGA TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT
NB03 CCTGGTAACTGGGACACAAGACTC GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG
NB04 TAGGGAAACACGATAGAATCCGAA TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA
NB05 AAGGTTACACAAACCCTGGACAAG CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT
NB06 GACTACTTTCTGCCTTTGCGAGAA TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC
NB07 AAGGATTCATTCCCACGGTAACAC GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT
NB08 ACGTAACTTGGTTTGTTCCCTGAA TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT
NB09 AACCAAGACTCGCTGTGCCTAGTT AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT
NB10 GAGAGGACAAAGGTTTCAACGCTT AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC
NB11 TCCATTCCCTCCGATAGATGAAAC GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA
NB12 TCCGATTCTGCTTCTTTCTACCTG CAGGTAGAAAGAAGCAGAATCGGA
NB13 AGAACGACTTCCATACTCGTGTGA TCACACGAGTATGGAAGTCGTTCT
NB14 AACGAGTCTCTTGGGACCCATAGA TCTATGGGTCCCAAGAGACTCGTT
NB15 AGGTCTACCTCGCTAACACCACTG CAGTGGTGTTAGCGAGGTAGACCT
NB16 CGTCAACTGACAGTGGTTCGTACT AGTACGAACCACTGTCAGTTGACG
NB17 ACCCTCCAGGAAAGTACCTCTGAT ATCAGAGGTACTTTCCTGGAGGGT
NB18 CCAAACCCAACAACCTAGATAGGC GCCTATCTAGGTTGTTGGGTTTGG
NB19 GTTCCTCGTGCAGTGTCAAGAGAT ATCTCTTGACACTGCACGAGGAAC
NB20 TTGCGTCCTGTTACGAGAACTCAT ATGAGTTCTCGTAACAGGACGCAA
NB21 GAGCCTCTCATTGTCCGTTCTCTA TAGAGAACGGACAATGAGAGGCTC
NB22 ACCACTGCCATGTATCAAAGTACG CGTACTTTGATACATGGCAGTGGT
NB23 CTTACTACCCAGTGAACCTCCTCG CGAGGAGGTTCACTGGGTAGTAAG
NB24 GCATAGTTCTGCATGATGGGTTAG CTAACCCATCATGCAGAACTATGC

ASFV primer sequences

ASFV primer sequences described in the protocol are subject to change. Any updates can be found at ASFV Lilo GitHub page.

Amplicon - primer pair Forward sequence Reverse sequence
ASFV1 GGCGTTCATTTCACAAGATGC ACGGCATCTAAGCAGCTCAATG
ASFV2 CAGGCCGATATATCATTTCATCAATATTCA ACCCAAAGCCCTGGAATCCTTA
ASFV3 GCAAACCAAGTGACTCACCCTC ATTGTATGACGTCGGGGCAGAT
ASFV4 ACCTAGTAAAAGTCCTAGAAAAACCTTCA CGCCATTGTTTTACACAGTCGC
ASFV5 TCGAGATTTTATTATTTGGATGCATCATCA GGACTGATGAAAGCCGTGAA
ASFV6 TCCACGCGGTACTTGGCTCC AGGCCTCGTTGGTGGAAAGGA
ASFV7 AGGGCTGATGCAAATCTCTTTTTCA TCTCCGATTTTCGCATGCCAAA
ASFV8 AGTTTGCAAAGAGCCTAAAGATAGACT AGCGTGGAACTGTAGATGACGA
ASFV9 TGCAGAAACCGCAGATGAATGT ATAGGATTAGATGCGACGCCCA
ASFV10 GCATGTAGAGAGGTTTTGGTAGTCA GGAAACAGCTGGAGAGTTGTGG
ASFV11 TGGTTTTGAAATAAAATGCCTTCTACGG GGAATGCATGGACGAAGAAGCA
ASFV11 (alt) CTATGGGATGGGAAGAGTGGTCAA CGTCAACCGCCGCATTAGC
ASFV12 TCCTTGGGAGTTACAGCGAAGA AATGAAATCATTCGCGGCGAGT
ASFV13 CAGACATTGGCAGTGATGGCTA GAAATGCCGGGCCTTCTACAAA
ASFV14 GCTACTCCCCCAAATATCACATATAATTGT TTTTTCGTGTTGCTGTTCGGGA
ASFV15 GGATGGCACCCTTCTCACAATC TGCGTATGACCCGATGTTGTTG
ASFV16 GTCGACTTCACAGGAACAACGG ACCCGCTTTACACAAAACACGT
ASFV17 TGGAATTTCCTGACGTGGCAAA GCAACCGCTATTCCAAACAGGA
ASFV18 AGTTGTTGTCCTAGACCGTGGCA TGAAAAGGAGGGCACGATCC
ASFV19 CCCGTATGCGGGCGTACTTT TGGCCTCTTCTTTCCCCCGA
ASFV20 GGCCGCAACATTTGTGTCAAAG GCTCGCGAACAAATTACTCCCA
ASFV21 GAATGGCAGCGATGATCTCAGG TGCAGGGCAAGGGTATACTGAA
ASFV22 TGGCGTCGTTTAACAGCTTGAT GCTGGATGGCAAATCGGTTGTA
ASFV23 AGGCGTGAAAATTCTTCTTCAAACA AGACGTTTTAAGCTGCATGGCA
ASFV24 GGCAGCAGGATCTTAAAACCGG TGCATAATGCCCAGCTTTTCGT
ASFV25 GCTGTTTAAGCGTTTCAAGCTGA CTCCGCGGGGAACATTGTTTTA
ASFV26 CCCTGGGAGGAGTCATCATGAA GGTCATTGACTTTGGAAGCGCT
ASFV27 ACTGTCTGCTAGACTCCCAGGA CCCAAGAGGAGGAATGGTTTGC
ASFV28 GCCCCCTAGCGTCACCGAAT CCAAGCCTGCTGCGAAGCTC
ASFV29 GACGCAATTTCGGCTGTTTTTAAAA GACTTGGTCTCCGGCTCAAAAG
ASFV30 GTTGGGGTGTTGGAGCGAATAA TTCTGCTTACGGACGATGCAAC
ASFV31 TAGTTGTGAAGCGTTCTCGGGT GAGCACATGTTACTCGCCACTC
ASFV32 GGACTTCTTATGCTCAGATGGGC ACTGCTGCAGGCGTTAAACATT

3. Computer requirements and software

Requisitos informáticos para el MinION Mk1B

Para secuenciar con el MinION Mk1B es necesario tener un ordenador o portátil de alto rendimiento, que pueda soportar la velocidad de adquisición de datos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1B IT Requirements.

Requisitos informáticos para el MinION Mk1C

El MinION Mk1C contiene ordenador y pantalla integrados, lo que elimina la dependencia de cualquier accesorio para generar y analizar datos de nanoporos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1C IT Requirements.

MinION Mk1D IT requirements

Sequencing on a MinION Mk1D requires a high-spec computer or laptop to keep up with the rate of data acquisition. For more information, refer to the MinION Mk1D IT requirements document.

Software for nanopore sequencing

MinKNOW

The MinKNOW software controls the nanopore sequencing device, collects sequencing data and basecalls in real time. You will be using MinKNOW for every sequencing experiment to sequence, basecall and demultiplex if your samples were barcoded.

For instructions on how to run the MinKNOW software, please refer to the MinKNOW protocol.

EPI2ME (optional)

The EPI2ME cloud-based platform performs further analysis of basecalled data, for example alignment to the Lambda genome, barcoding, or taxonomic classification. You will use the EPI2ME platform only if you would like further analysis of your data post-basecalling.

For instructions on how to create an EPI2ME account and install the EPI2ME Desktop Agent, please refer to this link.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000

4. DNA extraction

Material
  • ASFV-positive blood samples

Consumibles
  • Lysis buffer (10 mM ammonium chloride, 150 mM sodium EDTA, 10 mM sodium bicarbonate)
  • 5x TEN buffer (0.05 M EDTA, 0.5 M NaCl, 20 mg/ml Proteinase K, 20% SDS, in 0.05 M Tris-HCl, pH 8.0)
  • Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water
  • Isopropanol, 100% (Fisher, 10723124)
  • Nuclease-free water
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind

Instrumental
  • Microfuge
  • Heat block or water bath set to 95°C
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • P20 pipette and tips
IMPORTANTE

Below is one example of a method to extract DNA from swine blood samples. However, users can instead use other options (e.g. commercially-available DNA extraction kits) if preferred. The authors have found that spin columns are not suitable for this protocol due to PCR inhibitors being carried over in the blood. This method is optimised for frozen blood samples; other methods may work with fresh blood.

The blood samples used will have been tested for ASFV by PCR prior to DNA extraction. Individual blood samples are preferred; however this protocol can also work with pooled blood samples from multiple animals.

Transfer 50 μl of whole blood to a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Add 1 ml of lysis buffer to each sample.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 1 minute at room temperature.

Remove the samples from the Hula mixer and incubate at room temperature for 30 minutes.

Centrifuge at 7,500 rpm for 5 minutes. You should see a pellet form at the bottom of the tube.

Without disturbing the pellet, remove and discard the supernatant.

Add 700 μl of 5X TEN buffer to each sample.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 1 minute at room temperature.

Remove the samples from the Hula mixer and incubate at room temperature for 30 minutes.

Incubate the samples at 95°C for 5 minutes in a heat block or water bath.

Centrifuge at 7,500 rpm for 5 minutes. You should see a pellet form at the bottom of the tube.

Without disturbing the pellet, remove and discard the supernatant.

Resuspend each pellet in 700 μl 100% isopropanol.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 1 minute at room temperature.

Remove the samples from the Hula mixer and incubate at room temperature for 30 minutes.

Prepare sufficient fresh 70% ethanol in nuclease-free water.

Centrifuge the samples at 14,500 rpm for 15 minutes. You should see a white pellet form at the bottom of the tube.

Without disturbing the pellet, remove and discard the supernatant.

Wash the pellet by adding 500 μl of freshly-prepared 70% ethanol and pipetting up and down.

Centrifuge the samples at 11,500 rpm for 5 minutes.

Without disturbing the pellet, remove and discard the supernatant.

Allow the pellet to dry for ~30 seconds, ensuring there is no ethanol left in the sample. However, do not dry the pellet to the point of cracking.

Resuspend the pellet in 30 μl nuclease-free water. If it is difficult to resuspend in this volume, add more nuclease-free water.

FIN DEL PROCESO

The resuspended samples will be taken forward into the tiled DNA amplification and clean-up step. The extracted DNA can be used immediately or stored at 4°C for up to one week. For longer-term storage place at -20°C or -80°C.

5. Tiled DNA amplification and clean-up

Material
  • Extracted ASFV DNA

Consumibles
  • ASFV primers
  • VeriFi HS Mix (PCRBIO)
  • Nuclease-free water
  • Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen, Q32850)

Instrumental
  • Microfuge
  • Thermal cycler and/or heating block
  • Hula mixer (gentle rotator mixer)
  • Magnetic rack suitable for 0.2 ml PCR tubes
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • P20 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P2
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Prepare the primers according to the manufacturer's instructions.

Pool the tiled primer pairs in Eppendorf or PCR tubes following these proportions. The final stock concentration should be 100 μM.

Odd primer pool:

Primer pair Concentration
3 0.75X
5 2X
7 1X
9 1X
11 1X
11 alt 1X
13 1X
15 1X
17 1.5X
19 1X
21 1X
23 1X
25 2X
27 1X
29 1X
31 0.5X

Even primer pool:

Primer pair Concentration
2 1X
4 2X
6 0.5X
8 1.5X
10 2X
12 2X
14 2.5X
16 1X
18 1.5X
20 1X
22 1.5X
24 1.5X
26 1.5X
28 0.75X
30 1.5X
32 1X

Primer one:

Primer number Concentration
1 1X

Note: Due to the proximity to the telomeric sequence, primer 1 has a shorter amplicon length. The primer does not perform optimally in when pooled with others, therefore it is prepared separately.

MEDIDA OPCIONAL

To conserve the DNA samples, dilute 1:10 using nuclease-free water. Unused sample should be stored at –20°C.

Immediately before setting up the PCR, dilute each primer pool 1:10 in nuclease-free water to make a 10 μM working stock.

For each sample, prepare one reaction corresponding to each primer pool in 0.2 ml PCR tubes:

Note: For each sample you will have three reactions – odd primer pool, even primer pool, and primer 1 pool.

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent Volume
Nuclease-free water 9 µl
ASFV DNA (1:10 dilution) 2 µl
Primer pool (1:10 dilution) 1.5 µl
VeriFi HS Mix (PCRBIO) 12.5 µl
Total 25 µl

Note: we recommend to make a PCR master mix, either for individual primer pools for multiple samples or one for the three primers sets.

Mix well by pipetting and spin down.

Incubate in a thermocycler using the following program:

Step Temperature Time Cycles
Initial denaturation 98°C 1 min 1
Denaturation

Annealing

Extension
98°C

60°C

72°C
15 sec

15 sec

4 min 40 sec

40
Final extension 72°C 5 min 1
Hold 10°C

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 10 µl of resuspended AMPure XP beads to each tube and mix by gently pipetting.

Incubate for 10 minutes at room temperature.

Prepare 50 ml of fresh 70% ethanol in nuclease-free water.

Spin down the tubes and pellet the beads on a magnet for 5 minutes. Keep the tubes on the magnet until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.

Keep the tubes on the magnet and wash the beads in each well with 200 µl of freshly prepared 70% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repeat the previous step.

Spin down and place the tubes back on the magnet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the tubes from the magnetic rack and resuspend each pellet in 15 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 15 µl of eluate containing the DNA for each sample, in its three respective primer pools, into a clean tube.

Note: At this point you should still have three tubes for each DNA sample.

Quantify 1 μl of each cleaned PCR product using a Qubit ds DNA BR assay.

Using the Qubit reads, pool each sample by quantity in the following proportions:

Primer pool Proportion
Pool 1 48%
Pool 2 50%
Amplicon 1 2%
CONSEJO

If your pools consistently have a similar Qubit quantification across samples, in future experiments it is possible to omit the Qubit step and pool the samples by volume based on previous results.

FIN DEL PROCESO

Take forward the DNA sample pools into the DNA repair and end-prep step. However, at this point it is also possible to store the samples at 4°C overnight.

6. DNA repair and end-prep

Material
  • Pooled ASFV amplicons

Consumibles
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • NEBNext FFPE DNA Repair Mix (NEB M6630)
  • NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB E7546)
  • Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind

Instrumental
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P10
  • Thermal cycler
  • Microcentrífuga
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Gradilla magnética
  • Cubeta con hielo

Preparar los reactivos NEBNext FFPE DNA Repair Mix y NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module siguiendo las instrucciones del fabricante y poner en hielo.

Para obtener un rendimiento óptimo, NEB recomienda lo siguiente:

  1. Descongelar todos los reactivos en hielo.

  2. Golpear suavemente los tubos de reactivos con el índice o invertirlos, para asegurarse de que estén bien mezclados.
    Nota: No mezclar en vórtex las mezclas FFPE DNA Repair Mix, ni Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Centrifugar los tubos antes de abrirlos.

  4. Los tampones Ultra II End Prep Buffer y FFPE DNA Repair Buffer pueden tener un poco de precipitado. Dejar que la mezcla alcance la temperatura ambiente y mezclar pipeteando varias veces para romper el precipitado; para solubilizarlo, agitar el tubo en vórtex durante 30 s.
    Nota: Es importante mezclar bien los tampones mediante vórtex.

  5. El tampón FFPE DNA Repair Buffer puede tener un matiz amarillo; no importa si está así; se puede utilizar.

Prepare the DNA in nuclease-free water.

  • Transfer 700 ng of amplicon DNA into a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
  • Adjust the volume to 48 μl with nuclease-free water
  • Mix thoroughly by flicking the tube
  • Spin down briefly in a microfuge
CONSEJO

If there is not enough PCR product for the 700 ng pool, the end-prep reaction below can be carried out at half the volume.

In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:

Between each addition, pipette mix 10-20 times

Reagent Volume
DNA 48 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer 3.5 µl
Ultra II End-prep reaction buffer 3.5 µl
Ultra II End-prep enzyme mix 3 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix 2 µl
Total 60 µl

Mix well by pipetting and spin down.

Incubar en el termociclador, primero a 20 ºC durante 5 minutos y después a 65 ºC durante 5 minutos más.

Transferir la muestra de ADN a un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 60 µl of resuspended AMPure XP beads to the end-prep reaction and mix by flicking the tube.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Prepare 500 μl of fresh 70% ethanol in nuclease-free water.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 70% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 25 µl nuclease-free water. Spin down and incubate for 5 minutes at room temperature.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Remove and retain 25 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

MEDIDA OPCIONAL

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

FIN DEL PROCESO

Take forward the repaired and end-prepped DNA into the native barcode ligation step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

7. Native barcode ligation

Material
  • Native Barcoding Expansion 1-12 (EXP-NBD104) and 13-24 (EXP-NBD114) if multiplexing more than 12 samples

Consumibles
  • Etanol al 70 % recién preparado en agua sin nucleasas
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)

Instrumental
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Mezclador vórtex
  • Cubeta con hielo
  • Microcentrífuga
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P10
Equipo opcional
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Select a unique barcode for every sample to be run together on the same flow cell, from the provided 24 barcodes. Up to 24 samples can be barcoded and combined in one experiment.

Thaw the native barcodes at room temperature. Use one barcode per sample. Individually mix the barcodes by pipetting, spin down, and place them on ice.

Dilute 500 ng of each end-prepped sample to be barcoded to 22.5 µl in nuclease-free water.

Add the reagents in the order given below, mixing by flicking the tube between each sequential addition:

Reagent Volume
500 ng end-prepped DNA 22.5 µl
Native Barcode 2.5 µl
Blunt/TA Ligase Master Mix 25 µl
Total 50 µl

Mix by pipetting up and down 10-20 times and spin down.

Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 50 µl of resuspended AMPure XP beads to the reaction and mix by pipetting.

Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Prepare 500 μl of fresh 70% ethanol in nuclease-free water.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 70% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 26 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Remove and retain 26 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Dispose of the pelleted beads

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

IMPORTANTE

Please first refer to the ligation step below to ensure that the library is diluted to the correct volume.

Pool equimolar amounts of each barcoded sample into a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, ensuring that sufficient sample is combined to produce a pooled sample of 700 ng total.

Quantify 1 µl of pooled and barcoded DNA using a Qubit fluorometer.

Dilute 700 ng pooled sample to 65 µl in nuclease-free water.

MEDIDA OPCIONAL

If 700 ng of pooled sample exceeds 65 µl in volume, perform an AMPure clean-up with 2.5x Agencourt AMPure XP beads to pooled sample volume, eluting in 65 µl of nuclease-free water.

FIN DEL PROCESO

Take forward the pooled samples into the next step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

8. Adapter ligation and clean-up

Material
  • Long Fragment Buffer (LFB) (tampón para fragmentos largos)
  • Elution Buffer (EB) (tampón de elución) del kit de Oxford Nanopore
  • Adapter Mix II (AMII)

Consumibles
  • NEBNext® Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • NEBNext® Quick Ligation Reaction Buffer (NEB, B6058)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind

Instrumental
  • Microcentrífuga
  • Gradilla magnética
  • Mezclador vórtex
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
Equipo opcional
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Adapter Mix II Expansion use

Protocols that use the Native Barcoding Expansions require 5 μl of AMII per reaction. Native Barcoding Expansions EXP-NBD104/NBD114 contain sufficient AMII for 6 reactions (or 12 reactions when sequencing on Flongle). This assumes that all barcodes are used in one sequencing run.

The Adapter Mix II expansion provides additional AMII for customers who are running subsets of barcodes, and allows a further 12 reactions (24 on Flongle).

Thaw the Elution Buffer (EB) and NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5x) at room temperature, mix by vortexing, spin down and place on ice. Check the contents of each tube are clear of any precipitate.

Spin down the T4 Ligase and the Adapter Mix II (AMII), and place on ice.

Thaw one tube of Long Fragment Buffer (LFB) at room temperature and mix by vortexing, then spin down and place on ice.

Taking the pooled and barcoded DNA, perform adapter ligation as follows, mixing by flicking the tube between each sequential addition.

Reagent Volume
700 ng pooled barcoded sample 65 µl
Adapter Mix II (AMII) 5 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5X) 20 µl
Quick T4 DNA Ligase 10 µl
Total 100 µl

Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting, and spin down.

Incubate the reaction for 10 minutes at room temperature.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 40 µl of resuspended AMPure XP beads to the reaction and mix by pipetting.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Place on a magnetic rack, allow beads to pellet and pipette off supernatant.

Wash the beads by adding 250 μl Long Fragment Buffer (LFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 15 µl Elution Buffer (EB). Spin down and incubate for 10 minutes at 37°C to improve the recovery of long fragments.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 15 μl del eluido que contiene la biblioteca de ADN y conservar en un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.

Deshechar las microesferas precipitadas.

Quantify 1 µl of adapter ligated and barcoded DNA using a Qubit fluorometer - recovery aim ~430 ng.

FIN DEL PROCESO

The prepared library is used for loading onto the flow cell. Store the library on ice or at 4°C until ready to load.

CONSEJO

Library storage recommendations

We recommend storing libraries in Eppendorf DNA LoBind tubes at 4°C for short term storage or repeated use, for example, reloading flow cells between washes. For single use and long-term storage of more than 3 months, we recommend storing libraries at -80°C in Eppendorf DNA LoBind tubes. For further information, please refer to the DNA library stability Know-How document.

MEDIDA OPCIONAL

If quantities allow, the library may be diluted in Elution Buffer (EB) for splitting across multiple flow cells.

Additional buffer for doing this can be found in the Sequencing Auxiliary Vials expansion (EXP-AUX001), available to purchase separately. This expansion also contains additional vials of Sequencing Buffer (SQB) and Loading Beads (LB), required for loading the libraries onto flow cells.

9. Priming and loading the SpotON flow cell

Material
  • Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002)
  • Loading Beads (LB)
  • Sequencing Buffer (SQB)

Consumibles
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)

Instrumental
  • MinION device
  • SpotON Flow Cell
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pantalla protectora de celdas de flujo MinION/GridION
CONSEJO

Cebado y carga de la celda de flujo

Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Thaw the Sequencing Buffer (SQB), Loading Beads (LB), Flush Tether (FLT) and one tube of Flush Buffer (FB) at room temperature before mixing the reagents by vortexing, and spin down at room temperature.

To prepare the flow cell priming mix, add 30 µl of thawed and mixed Flush Tether (FLT) directly to the tube of thawed and mixed Flush Buffer (FB), and mix by vortexing at room temperature.

Open the MinION device lid and slide the flow cell under the clip.

Press down firmly on the flow cell to ensure correct thermal and electrical contact.

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:

  1. Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
  2. Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
  3. Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5 SPANISH

Thoroughly mix the contents of the Loading Beads (LB) by pipetting.

IMPORTANTE

The Loading Beads (LB) tube contains a suspension of beads. These beads settle very quickly. It is vital that they are mixed immediately before use.

CONSEJO

Using the Loading Beads

Demo of how to use the Loading Beads.

In a new tube, prepare the library for loading as follows:

Reagent Volume per flow cell
Sequencing Buffer (SQB) 37.5 µl
Loading Beads (LB), mixed immediately before use 25.5 µl
DNA library 12 µl
Total 75 µl

Note: Load the library onto the flow cell immediately after adding the Sequencing Buffer (SQB) and Loading Beads (LB) because the fuel in the buffer will start to be consumed by the adapter.

Completar el cebado de la celda de flujo:

  1. Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
  2. Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

Flow Cell Loading Diagrams Step 5

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5 SPANISH 2

Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.

Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.

Flow Cell Loading Diagram Step 07 V5 SPANISH

Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.

Step 8 update - SPANISH

Flow Cell Loading Diagrams Step 9 SPANISH

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:

  1. Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.

  2. Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised. SPANISH

ATENCIÓN

La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.

FIN DEL PROCESO

Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.

10. Data acquisition and basecalling

Aspectos generales del análisis de datos de nanoporos

Para obtener una descripción completa del análisis de datos de nanoporos, que incluya distintas posibilidades para el análisis de identificación y postidentificicación de bases, consultar el documento Data Analysis.

Cómo empezar a secuenciar

El programa MinKNOW realiza el control del dispositivo de secuenciación, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Una vez que el usuario ha instalado MinKNOW en su ordenador, hay diferentes maneras de llevar a cabo la secuenciación:

1. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el programa MinKNOW.

Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run".

2. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo GridION.

Seguir las instrucciones del manual de usuario de GridION.

3. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo MinION Mk1C.

Seguir las instrucciones del manual de usuario de MinION Mk1C.

4. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo PromethION.

Seguir las instrucciones de los manuales de usuario de PromethION o PromethION 2 Solo.

5. Adquisición de datos e identificación de bases posterior mediante MinKNOW.

Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run". Al configurar los parámetros del experimento, ajustar la pestaña Basecalling (Identificación de bases) en posición de APAGADO. Al terminar el experimento de secuenciación, seguir las instrucciones del apartado "Post-run analysis" del protocolo de MinKNOW.

11. Downstream analysis

Additional resources for analysing your ASFV data

Bioinformatic processing of ASFV genomes sequenced with shotgun sequencing

The shotgun sequencing data were basecalled and demultiplexed using MinKNOW (v19.06.8) using Fast basecalling. Following basecalling the reads were aligned to an ASFV genome using minimap2 to identify ASFV reads, the .fast5 files for these reads were extracted using fast5_subset from the ont_fast5_api and these again using high accuracy basecalling (this reduces basecalling time, suitable for when working with lower spec laptops/computers that have low GPU capacity). The reads were assembled with Flye (v2.6) - additional Flye resources available following the link: Assembly of long, error-prone reads using repeat graphs and polished three times with Medaka (v0.7.1). Comparisons of quantity of data produced and the proportion of which were ASFV reads were done using NanoComp (v1.28.1) - additional Nanopack resources available following the link: NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data.

Bioinformatic processing of ASFV genomes from tiled amplicons with Lilo

The data were basecalled and demultiplexed using Guppy (v5.0.14) using high or super accuracy model on a GPU.

The snakemake pipeline Lilo was used, taking the following steps:

  1. Use Porechop (v0.2.3) to remove any sequencing adapters or barcodes that have made it through demultiplexing.
  2. Align to a reference with minimap2 (v2.22) and samtools (v1.12) and separate reads into amplicons by alignment position with bedtools (v2.30.0).
  3. Select reads of the expected amplicon length (+/-5%) and subset to 300X
  4. Select the read with highest average base quality within +/-1% of the median length of reads for the amplicon to be the “reference” using bioawk v1 and remove any amplicons with fewer than 40 reads (targeting the median length allows for flexibility for large insertions or deletions).
  5. Pool amplicon reads and references back into their original non-overlapping pools.
  6. Polish the pools three times with Medaka (v1.4.4) and combine resulting polished amplicons.
  7. Align to the reference with minimap2 and remove soft clipped bases (these likely represent missed barcodes or adapters).
  8. Run porechop to remove primers from the amplicons.
  9. Merge the amplicons with scaffold_builder (v2.3).

The required input to Lilo are demultiplexed reads in FASTQ format in a directory named “raw/”, a reference FASTA, a .bed file of primer alignments (as output by primal scheme), and a .csv of primer sequences (if there are ambiguous bases it is advised to expand them first) and a config file, described on the GitHub page. It is adaptable to any species (with a single genome fragment/chromosome) with any tiled primer scheme. The pipeline outputs a FASTA file containing the assembled genome.

ARTIC assemblies

A subset of genomes were also assembled using the ARTIC pipeline (v1.2.1) following the bioinformatics SOP using the Medaka method.

Quality control of assembled genomes

Quast (v5.0.2) was used to compare the assembled genomes to the most closely related publicly available ASFV assembly according to BLAST alignment (MN715134.1) - links and additional resources available following the link: Short and Long-Read Sequencing Survey of the Dynamic Transcriptomes of African Swine Fever Virus and the Host Cells. Samples where both WGS and tiled sequencing were used were compared for overall structure using nucmer (v4.0.0beta2) - links and aditional reources available following the link: MUMmer4: A fast and versatile genome alignment system.

Phylogeny

The phylogeny analysis was limited to the tiled genomes, as these were the most accurate assemblies, and publicly available genomes. These were aligned using Mafft (v7.467) and maximum likelihood trees constructed using iqtree (v2.0.5).

12. Reutilización y devolución de celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a entre 2 °C y 8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

13. Issues during DNA extraction and library preparation

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Low output from PCR

Observation Possible cause Comments and actions
Low output from PCR Insufficient primer Increase the amount of primer pool in the PCR reaction by 0.25-1 µl, decrease water proportionally.
- Insufficient DNA template Use undiluted DNA.
- Thermocycler fault Ensure that you use a thermocycler that has been recently calibrated.
- Insufficient viral DNA and an abundance of host DNA Use a host depletion method such as NEBNext® Microbiome DNA Enrichment Kit before PCR*.
- Low representation of a particular primer in the sequencing data Spike in a small quantity of the primer in the 100 µM pool before future runs

* This may be prohibitively expensive at scale, but for precious samples this will have a noticeable impact on amplicon yield.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <70 % Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

14. Issues during the sequencing run

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the sequencing kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents.
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FLT/FCT tube). Make sure FLT/FCT was added to FB/FCF before priming.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.
Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones:

1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Reducción de la velocidad de secuenciación y del índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Reducción de la velocidad de secuenciación y el índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación En la química del kit 9 (p. ej., SQK-LSK109), cuando la celda de flujo está sobrecargada con la biblioteca se observa un consumo rápido de combustible (consulte el protocolo correspondiente a su biblioteca de ADN para ver las recomendaciones) Añadir más combustible a la celda de flujo, siguiendo las instrucciones en el protocolo de MinKNOW. En futuros experimentos, cargar cantidades menores de biblioteca en la celda de flujo.

Fluctuación de la temperatura

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace.

Guppy – no input .fast5 was found or basecalled

Observation Possible cause Comments and actions
No input .fast5 was found or basecalled input_path did not point to the .fast5 file location The --input_path has to be followed by the full file path to the .fast5 files to be basecalled, and the location has to be accessible either locally or remotely through SSH.
No input .fast5 was found or basecalled The .fast5 files were in a subfolder at the input_path location To allow Guppy to look into subfolders, add the --recursive flag to the command

Guppy – no Pass or Fail folders were generated after basecalling

Observation Possible cause Comments and actions
No Pass or Fail folders were generated after basecalling The --qscore_filtering flag was not included in the command The --qscore_filtering flag enables filtering of reads into Pass and Fail folders inside the output folder, based on their strand q-score. When performing live basecalling in MinKNOW, a q-score of 7 (corresponding to a basecall accuracy of ~80%) is used to separate reads into Pass and Fail folders.

Guppy – unusually slow processing on a GPU computer

Observation Possible cause Comments and actions
Unusually slow processing on a GPU computer The --device flag wasn't included in the command The --device flag specifies a GPU device to use for accelerate basecalling. If not included in the command, GPU will not be used. GPUs are counted from zero. An example is --device cuda:0 cuda:1, when 2 GPUs are specified to use by the Guppy command.

Last updated: 3/10/2023

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