Este protocolo explica la preparación de la biblioteca y la secuenciación mediante muestreo adaptativo de tres muestras por celda de flujo PromethION, que emplea el kit Native Barcoding y la función de enriquecimiento de secuencias objetivo mediante muestreo adaptativo de MinKNOW. Los paquetes de Muestreo adaptativo con multiplexación suministrados por Oxford Nanopore Technologies (links from Simon), que se fabrican en formato de 18 o 72 muestras, incluyen todos los reactivos necesarios en este protocolo. Los paquetes incluyen el kit Native Barcoding y los elementos necesarios en la secuenciación y constituyen la configuración habitual en este flujo de trabajo.

Es posible utilizar un panel digital listo para usar y de uso exclusivo en investigación de Oxford Nanopore como panel definido por el archivo BED o bien crear un panel digital personalizado con la herramienta de diseño de paneles digitales de muestreo adaptativo. Si desea crear un panel a medida, consulte la Guía técnica de muestreo adaptativo: Herramienta de diseño de paneles digitales.

El análisis de los datos no forma parte de este protocolo. La sección Datos generados y análisis (sección 13) explica qué archivo BED exportado utilizar y el flujo de trabajo correspondiente a cada panel: wf-hereditary-cancer para el Panel de cáncer hereditario y wf-human-variation para los paneles personalizados de línea germinal.

El protocolo Muestreo adaptativo con multiplexación está pensando sobre todo para aplicaciones de línea germinal, en las que cada muestra necesita una cobertura moderada en todo el panel, en lugar de la profundidad necesaria para detectar variantes de baja frecuencia.

En paneles que abarcan entre el 0,1 % y el 5 % del genoma, se espera que cada una de las tres muestras de la celda de flujo alcance una cobertura media de 30x en las regiones objetivo y que alrededor del 90 % de las bases de estas regiones quede cubierto con una profundidad de superior a 20x. Los paneles personalizados difieren de tamaño, contenido génico y contexto de secuencia, por lo que es posible que la cobertura que su panel sea distinta. La cobertura también depende del número de poros utilizables de la celda de flujo, la longitud de fragmentos de la biblioteca y el equilibrio con que las tres muestras estén representadas en el conjunto.

Recomendamos realizar un ensayo preliminar con su panel y comprobar la cobertura que necesita antes de procesar un gran número de muestras.

Oxford Nanopore digital panel specification

Ready-to-use digital panels:

	Hereditary Cancer	Pan-Caner	Pan-Haematological Cancer
Enriched genes	258 inherited cancer risk genes	723 cancer associated genes	144 haematological malignancies associated genes
Validated Adaptive Sampling protocols	Multiplex Adaptive Sampling	Ultra-rapid singleplex Adaptive Sampling Singleplex Adaptive Sampling	Singleplex Adaptive Sampling
Input amount†	1 µg	Ultra-rapid singleplex: 1 µg Singleplex: 500 ng to 1 µg*	1 µg
Input sample type	Blood	Solid tumour tissue	Blood Bone marrow
Recommended extraction kits	Genomic DNA extraction from human blood using the Qiagen Puregene kit‡	1. QIAamp Fast DNA Tissue Kit (Qiagen, 51404) Recommended for Ultra-rapid singleplex Adaptive Sampling 2. Puregene Tissue Kit (Qiagen, 158063) 3. MagAttract HMW DNA Kit (Qiagen, 67563)	1. Genomic DNA extraction from human blood using the Qiagen Puregene kit‡ 2. QIAamp DSP DNA Mini Kit (Qiagen, 61304) 3. GenFind V3 Genomic DNA Extraction Kit (Beckman Coulter, C34880)
QC info (Femto Pulse)	Extracted gDNA samples may be assessed on the Femto Pulse System to visualise the unsheared/sheared gDNA profiles. For example profiles refer to the Input DNA section.	Extracted gDNA samples may be assessed on the Femto Pulse System to visualise the unsheared/sheared gDNA profiles. For example profiles refer to the DNA QC section. For the Ultra-rapid singleplex AS protocol, perform gDNA quality control assessment after completion of the sequencing run using aliquots reserved during the relevant sample preparation steps.	Extracted gDNA samples may be assessed on the Femto Pulse System to visualise the unsheared/sheared gDNA profiles. For example profiles refer to the DNA QC section.
Shearing conditions (speed and time)	Three centrifugation steps at ~3,381 RCF for 1 minute each. Refer to the corresponding protocol step for further details.	Two centrifugation steps at ~3,381 RCF for 30 seconds each. Refer to the corresponding protocol step for further details.	Two centrifugation steps at ~4,868 RCF for 1 minute each. Refer to the corresponding protocol step for further details.
Reference genomes	GRCh38_GIABv3	GRCh38_GIABv3	GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fna
Enrichment BED file (links to the BED files can be found on the Adaptive Sampling page)	ONT_AS_HCP_GRCh38_enrichment_v1.bed	ONT_AS_PanCancer_GRCh38_enrichment_v1.bed	ONT_AS_PanHaem_GRCh38_enrichment_v1.bed

*A lower input limit of 500 ng can be used; however 1 µg is recommended whenever possible to improve pore occupancy.

^†A maximum of 2 µg input can be used to maximise pore occupancy.

^‡This Oxford Nanopore adapted extraction method uses the Puregene Blood Kit (Qiagen, 158023). It has gentler mixing conditions and resuspends the final DNA at 50°C rather than 65°C.

Preparación del experimento

Pasos:

• Extraer ADNg de gran masa molecular de cada muestra de sangre, siguiendo el protocolo Extracción de ADN genómico a partir de sangre humana con el kit Puregene de Qiagen.
• Diseñar un panel personalizado en Digital Panel Designer y exportar los archivos BED o descargar los archivos BED de un panel prediseñado y el archivo FASTA de referencia correspondiente (apartado 4).
• Tener a disposición el kit de secuenciación, el instrumental pertinente y los reactivos de otros fabricantes.
• Verificar la celda de flujo y comprobar que tiene poros suficientes para realizar una buena secuenciación.

Preparación de muestras, preparación de bibliotecas y secuenciación

Etapa	Proceso	Duración	Parada opcional
Preparación de muestras	Extraer el ADN genómico de la muestra, fragmentarlo y cuantificarlo. Comprobar la longitud, cantidad y pureza del material extraído. Los controles de calidad realizados durante el protocolo son esenciales para garantizar el éxito del experimento.	Depende del método de extracción utilizado 15 minutos aproximadamente en la fragmentación	En esta etapa, es posible guardar el ADN extraído o fragmentado a –20 °C y utilizarlo más adelante.
Reparación del ADN y preparación de los extremos	Reparar el ADNg y preparar los extremos para la ligación de adaptadores.	60 minutos	4 °C durante la noche
Ligación directa de códigos de barras	Ligar los códigos de barras (sin PCR) a los extremos del ADN.	70 minutos	4 °C durante la noche
Ligación de adaptadores de secuenciación y purificación	Ligar los adaptadores a los extremos de ADN.	60 minutos	a 4 °C durante la noche
Acondicionar y cargar la celda de flujo	Acondicionar la celda de flujo y cargar la biblioteca de ADN en ella.	10 minutos
Secuenciación	Secuenciar la biblioteca con el dispositivo de secuenciación.	72 horas
Análisis de datos	Análisis con uno de los flujos de trabajo de EPI2ME

Una secuenciación con muestreo adaptativo solo se lleva a cabo correctamente si MinKNOW dispone de dos archivos: un archivo BED enriquecido, que enumera las regiones que se desea enriquecer y un archivo FASTA de referencia de la misma versión del genoma. Los archivos BED enriquecidos se crean en la herramienta de diseño de paneles Digital Panel Designer o se empieza con uno de nuestros paneles predefinidos. Las instrucciones de la herramienta de diseño de paneles, incluidas las comprobaciones de diseño y los ajustes de margen, están en la Guía técnica de muestreo adaptativo.

La exportación genera tres archivos BED y un informe de resumen. Los archivos se nombran con fecha y nombre del panel de la siguiente manera: YYYY-MM-DD_panel-name_enrichment.bed

Solo se carga en MinKNOW el archivo BED de enriquecimiento.

| Archivo | Contenido | Se utiliza en | | --- | --- | --- | | *_enrichment.bed | Dos filas por región objetivo, una de la hebra positiva y otra de la negativa, cada una con margen en el extremo 5′. | MinKNOW, en el campo BED de Muestreo adaptativo (sección 12). | | *_analysis.bed | Una fila por región objetivo, sin margen. | Cobertura e identificación de variantes en las regiones objetivo (sección 13). | | *_exons.bed | Una fila por exón en el transcrito MANE Select de cada gen o, si no existe, del transcrito canónico de Ensembl. | Análisis de cobertura por exón (sección 13). | | summary.html | Datos estadísticos del panel, comprobaciones del diseño, tabla de regiones objetivo y vista de las regiones objetivo y los márgenes de un navegador genómico. | Registro del diseño del panel. |

MinKNOW necesita archivo de referencia FASTA con el que alinear las lecturas y tomar las decisiones de muestreo adaptativo. La referencia debe ser la misma versión del genoma que se seleccionó en la herramienta Digital Panel Designer cuando se exportó el panel. Recomendamos los siguientes archivos:

Panel	Versión	Archivo de referencia FASTA (MinKNOW)	Origen
Panel personalizado	GRCh38	GCA_ 000001405. 15_ GRCh38_ no_ alt_ analysis_ set. fna. gz	NCBI
Panel personalizado	GRCh37	hg19. fa. gz	UCSC
Panel de cáncer hereditario	GRCh38	GRCh38_ GIABv3_ no_ alt_ analysis_ set_ maskedGRC_ decoys_ MAP2K3_ KMT2C_ KCNJ18. fasta. gz	Genome in a Bottle

En el caso del Panel de cáncer hereditario, recomendamos la referencia Genome in a Bottle (GIAB) v3 GRCh38, con la que se determinó el rendimiento del panel. Es el conjunto de análisis GRCh38 no-alt en el que se han enmascarado las regiones del ensamblaje duplicadas por error; por ello, utiliza las mismas coordenadas y los archivos BED del panel exportados desde Digital Panel Designer son compatibles con ella sin necesidad de modificarlos.

Los archivos GRCh38 anteriores no contienen cóntigos de loci alternativos. Si en su lugar se utiliza una referencia que los incluya, las lecturas de regiones con haplotipos alternativos, como los genes HLA, se reparten entre el ensamblaje primario y los cóntigos alternativos. El archivo hg19 contiene unos pocos cóntigos de haplotipos en la región MHC y la misma situación afecta a los paneles con regiones objetivo en esa región.

Si utiliza otro archivo de referencia con nombres de cromosomas distintos de los figuran en los archivos BED, cambie los nombres de los cromosomas en los archivos BED por los de la referencia. No cambie los nombres de los cromosomas de la referencia. No recomendamos indizar la referencia antes de cargarla, ya que MinKNOW la indiza de manera automática al inicio de la secuenciación. Los requisitos de la referencia se describen con detalle en la Guía técnica de muestreo adaptativo.

Los reactivos de Oxford Nanopore Technologies necesarios en este protocolo están incluidos en los paquetes de Muestreo adaptativo con multiplexación, de venta en la tienda Nanopore en formato de 18 o 72 muestras.

Esos paquetes incluyen el kit Native Barcoding junto con el resto de elementos de secuenciación que constituyen la configuración de referencia en este flujo de trabajo.

Si desea más información sobre elementos concretos del kit incluidos en los paquetes, consulte los productos correspondientes en la tienda Nanopore:

• Paquete Muestreo adaptativo con multiplexación 18 (18 muestras)
• Paquete Muestreo adaptativo con multiplexación 72 (72 muestras)

• ~1 µg de ADNg fragmentado

Hemos homologado este protocolo con ADNg extraído de sangre humana fresca, recogida en tubos con EDTA K2. La extracción se realizó con el kit Puregene Blood (Qiagen, 158023), a partir de 1 ml de sangre y con un método adaptado de Oxford Nanopore, que mezcla con más suavidad y resuspende el ADN final a 50 °C en lugar de a 65 °C. El método está detallado en el protocolo Extracción de ADN genómico a partir de sangre humana con el kit Puregene de Qiagen.

No hemos probado otros kits de extracción con este protocolo. Es posible que el ADNg de sangre extraído con otro kit ofrezca un buen rendimiento si cumple los requisitos siguientes, pero cumplirlos no es una garantía, ya que el perfil de longitud de fragmentos y de pureza del ADN influye en el enriquecimiento y en la cantidad de datos generados. Si utiliza otro kit, recomendamos realizar un experimento preliminar y comprobar que se obtiene la cobertura necesaria antes de procesar un gran número de muestras.

Requisito	Valor	Cómo comprobarlo
Cantidad	Más de 1 µg por muestra, con una concentración de al menos 20 ng/µl, de modo que 1 µg quepa en los 50 µl que admite el tubo g-TUBE (Covaris)	Qubit dsDNA BR Assay, por triplicado
Pureza	DO 260/280 ≥ 1,8 y DO 260/230 de 2,0 a 2,2	NanoDrop o equivalente
Longitud de los fragmentos	ADNg de alto peso molecular (HMW) En la figura 1 se muestra una extracción típica con Puregene.	Femto Pulse o equivalente (opcional)

Figura 1. Ejemplo de perfil de longitudes de fragmentos de ADNg extraído de sangre humana con el método Puregene adaptado.

El tubo g-TUBE fragmenta ADN hasta una longitud objetivo, pero no lo alarga. El ADNg que tras la extracción es más corto de lo previsto, lo seguirá siendo tras la fragmentación y como resultado, la longitud de lectura será menor.

Realizar el control de calidad

Es importante que el ADN de partida cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), afecta a la preparación de la biblioteca.

Siga las instrucciones sobre cómo realizar un control de calidad de la muestra de ADN, en el protocolo Input DNA/ RNA QC.

Contaminantes químicos

Según cómo se extraiga el ADN de la muestra original, ciertos contaminantes químicos quedan en el ADN purificado y afectan tanto a la eficacia de la preparación de la biblioteca como a la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

Hemos probado y recomendamos el uso de todos los reactivos de otros fabricantes usados en este protocolo. Oxford Nanopore Technologies no ha evaluado otras alternativas.

A menos que se especifique en el protocolo, recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Antes de iniciar un experimento de secuenciación y dentro del plazo de garantía, recomendamos encarecidamente comprobar el número de poros presente en la celda de flujo. Las celdas de flujo deben sacarse de la nevera y de su envoltorio y se debe esperar 30 minutos a que se pongan a temperatura ambiente.

Siga las instrucciones del documento Comprobación de celdas de flujo; al realizar la comprobación, verá el número de poros que tiene. La garantía cubre un mínimo de 5 000 poros en celdas PromethION. Encontrará más información sobre el plazo de garantía, la estabilidad y las condiciones de almacenamiento en la tienda de Oxford Nanopore. Si tiene alguna duda o pregunta, contacte con Oxford Nanopore.

Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo PromethION con menos de 5 000 poros, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento.

A continuación incluimos un protocolo recomendado de extracción de ADN genómico a partir de sangre:

Extracción de ADN genómico a partir de sangre humana mediante el kit Puregene de Qiagen

MinKNOW gestiona el dispositivo de secuenciación, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real.

En la documentación del PromethION 24 o del PromethION 2 Integrated encontrará instrucciones de configuración del dispositivo y de la secuenciación. En ambos dispositivos se usan los mismos parámetros de secuenciación.

Antes de iniciar la secuenciación:

• Comprobar que el archivo FASTA de referencia del panel (véase «Genoma de referencia» en el apartado 4) y el archivo BED de enriquecimiento se encuentran en el dispositivo.

• Comprobar que hay espacio de almacenamiento suficiente en el dispositivo por cada celda de flujo.

• Decidir si se activa la opción «Identificar bases solo en las lecturas de las regiones de interés», como se describe a continuación.

Recomendamos identificar las bases en tiempo real con el modelo de gran precisión (HAC) y utilizar BAM como formato de salida. El parámetro «Identificar bases solo en las lecturas de las regiones de interés» de MinKNOW determina en qué lecturas se identifican las bases durante la secuenciación. La opción adecuada depende de si se necesitan las lecturas que rechaza el muestreo adaptativo.

Identificar bases solo en las lecturas de las regiones de interés	Lecturas identificadas durante la secuenciación	Celdas de flujo simultáneas
Desactivado	Todas las lecturas, incluso las lecturas cortas rechazadas por el muestreo adaptativo. Además de los datos de las regiones de interés, las lecturas rechazadas ofrecen una visión del genoma completo y de su metilación a poca profundidad.	Menos, porque se identifican las bases de todas las lecturas
Activado	Solo las lecturas de las regiones de interés. Las lecturas rechazadas se guardan en la carpeta pod5skip dentro de la carpeta de la secuenciación y, si hace falta, se les puede aplicar la identificación de bases posejecución.	Todas las posiciones del dispositivo

El número de celdas de flujo cuyas bases identifica cada dispositivo en tiempo real, con y sin el parámetro «Identificar bases solo en las lecturas de las regiones de interés», se indica en el apartado Device limits de la guía técnica de muestreo adaptativo. Si se secuencian más celdas de flujo de las que el dispositivo puede procesar en tiempo real, la identificación de bases se retrasa con respecto a la secuenciación y es posible que disminuya el enriquecimiento.

Si se quiere secuenciar más celdas de flujo a la vez y conservar igualmente los datos de las lecturas no seleccionadas, establecer el parámetro «Identificar bases solo en las lecturas de las regiones de interés» en Activado e identificar las bases de las lecturas rechazadas después de la secuenciación. Este proceso requiere tiempo adicional en el dispositivo una vez finalizada la secuenciación. Las instrucciones se encuentran en «Identificación de bases de las lecturas rechazadas tras la secuenciación», en el apartado «Datos de salida y análisis» más adelante.

Configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW

1. Seleccionar Iniciar secuenciación en MinKNOW; a continuación, introducir la posición de la celda de flujo, el nombre del experimento y el ID de la muestra.
   El ID de la muestra se aplica a toda la celda de flujo no a cada muestra; las tres muestras se identifican por su número de código de barras (por ejemplo, barcode01, barcode02 y barcode03) en las carpetas y archivos de salida. Tome nota de qué muestra corresponde a cada código de barras.
   Si prefiere dar un nombre a cada muestra, parta de una hoja de muestras como se explica más abajo en la sección Opcional: partir de una hoja de muestras.

2. Aplicar los parámetros indicados a continuación. Dejar el resto en sus valores predeterminados.

Pantalla	Parámetro	Valor
Kit	Selección de kit	Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) o Native Barcoding Kit 96 V14 (SQK-NBD114.96)
Configuración de la secuenciación	Bases modificadas	Activado, con los contextos CG 5mC y 5hmC seleccionados
	Alineamiento	Activado. Cargar el archivo FASTA de referencia de su panel. Si se usa el panel de cáncer hereditario, cargar el archivo GIAB v3; si se usa un panel personalizado, cargar el archivo de la versión correspondiente (véase «Genoma de referencia» en la sección 4).
	Muestreo adaptativo	Activado, con Enriquecimiento seleccionado. Cargar el archivo BED de enriquecimiento (*_enrichment.bed) y el mismo archivo de referencia FASTA.
	Identificar bases solo en las lecturas de las regiones de interés	Desactivado o activado, según se describe arriba
Salida	FASTQ	Desactivado
	POD5	Desactivado o activado si se tiene previsto identificar las bases de las lecturas rechazadas después de la secuenciación

3. Iniciar la secuenciación

Partir de una hoja de muestras permite dar un nombre a cada una de las tres muestras, que aparece en las carpetas y los archivos de salida con el número de código de barras. Utilizar la misma configuración indicada en la tabla anterior.

• Preparar un archivo CSV con una fila por código de barras. Debe contener las siguientes columnas:

  • experiment_id: el nombre del experimento, el mismo en todas las filas.
  • kit: SQK-NBD114.24.
  • código de barras: por ejemplo, barcode01.
  • alias: el nombre de la muestra asociado a ese código de barras
    Los nombres de muestras en la columna alias solo deben contener letras, números, guiones, guiones bajos y puntos, sin espacios y deben tener entre 1 y 40 caracteres.
  • position_id: la posición en el dispositivo, o bien
  • flow_cell_id: el ID impreso en la celda de flujo.

• Guardar el archivo con la extensión .csv visible; de lo contrario, MinKNOW no lo reconocerá.

• En MinKNOW, seleccionar Partir de una hoja de muestras en lugar de Iniciar secuenciación y elegir el archivo CSV. La posición de la celda de flujo, el nombre del experimento y de las muestras se leen del archivo, no hace falta introducirlos en la pantalla. A continuación, aplicar la configuración indicada en la tabla anterior.

• Las demás opciones de la hoja de muestras se explican en la sección sobre la hoja de muestras de la documentación de MinKNOW.

Al final de la secuenciación, los datos de cada una de las tres muestras está en su propio carpeta de código de barras. Cada archivo BAM contiene las lecturas identificadas y alineadas con el archivo de referencia FASTA que se cargó en MinKNOW. Las de bases modificadas (5mC y 5hmC en contexto CpG), solo se guardan en los registros de lectura si al configurar la secuenciación se activó la función de identificación de bases modificadas.

Con la función Identificar bases solo en las lecturas de las regiones de interés desactivada, los archivos BAM también contiene las lecturas cortas rechazadas por el muestreo adaptativo. Con la función activada, las lecturas rechazadas no se identifican y se escriben en la carpeta pod5skip.

Salida	Descripción
Archivos BAM alineados, una carpeta por código de barras	Lecturas identificadas y alineadas de cada muestra, con las bases modificadas si se activó la identificación.
Resumen e informe de secuenciación	Parámetros globales de secuenciación, como la longitud de lectura, el rendimiento y las decisiones del muestreo adaptativo.

Calcular la cobertura de las regiones objetivo y limitar a ellas la identificación de variantes con *_analysis.bed, en lugar de *_enrichment.bed. Si se calcula la cobertura con el archivo BED de enriquecimiento, el resultado incluye el margen y deja de describir las regiones objetivo. Utilizar _exons.bed cuando se indica la cobertura por exón.

En paneles personalizados de línea germinal, la identificación de variantes, la determinación de la fase de variantes y el análisis de metilación se realizan por muestra con el flujo de trabajo wf-human-variation en la aplicación EPI2ME Desktop o en la línea de comandos, a partir de los archivos BAM de un código de barras, el archivo de referencia FASTA y el archivo BED de análisis.

Con el Panel de cáncer hereditario, utilizar el flujo bioinformático wf-hereditary-cancer.

Debido al prolongado tiempo de secuenciación, no recomendamos reutilizar las celdas de flujo que se utilicen en este protocolo.

Reutilizar las celdas de flujo en experimentos posteriores provoca que se generen datos insuficientes, lo que dificulta su análisis.

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una sección de Preguntas frecuentes (FAQ) en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat en directo de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop del ADN con una relación OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2)	El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria	Los efectos de los contaminantes se muestran en el documento Contaminants. Probar con otro método de extracción que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza con microesferas AMPure.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas AMPure

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación	Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas AMPure por muestra inferior a lo previsto.	1. Las microesferas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra deben estar bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación	Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado	Cuanto menor sea la proporción de microesferas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel y a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas AMPure que se debe utilizar.
Escasa recuperación tras la preparación de extremos	En el paso de lavado se utilizó etanol en una concentración inferior al 70 %	Si se utiliza etanol a una concentración inferior al 70 %, el ADN se eluye de las microesferas. Compruebe que utiliza el porcentaje correcto.

A continuación, hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una sección de preguntas frecuentes (FAQ) en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que tras la evaluación de la celda de flujo

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo	Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos.	Tras comprobar la celda de flujo y antes de acondicionarla, es imprescindible quitar las burbujas de aire que haya cerca del puerto de purgado. Si no se quitan, las burbujas son capaces de desplazarse hacia la matriz de nanoporos y dañar los nanoporos expuestos al aire de manera irreversible. En el vídeo Cómo cargar una celda de flujo PromethION se muestran algunas buenas prácticas evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo	La celda de flujo no está colocada correctamente.	Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo	La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros.	El recuento de poros durante la evaluación de la celda de flujo se efectúa utilizando las moléculas de ADN del control de calidad presentes en el amortiguador de almacenamiento. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca a fin de calcular el número de poros activos. Por este motivo, se estima que existe una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación suele estar relacionado con la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. En algunos casos, recomendamos emplear métodos alternativos de extracción o purificación de ADN/ARN a fin de mejorar la pureza del material de partida. Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción diferente que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"		Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema persiste, reúna los archivos de registro de MinKNOW y contacte con el departamento de Asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica, que proporcionará instrucciones de almacenamiento adicionales.

Ocupación de poros por debajo del 40 %

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación de poros inferior al 40 %	No se cargó suficiente biblioteca en la celda de flujo.	En protocolos de secuenciación de genoma humano, deben cargarse 250-300 ng de biblioteca de buena calidad en una celda de flujo R10.4.1; así, la ocupación de poros se mantendrá elevada.
Ocupación de poros próxima a 0	Tras la ligación de los adaptadores, en lugar de utilizar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) se utilizó etanol.	El etanol desnaturaliza la proteína motor en los adaptadores de secuenciación. Después de la ligación de los adaptadores se debe utilizar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).
Ocupación de poros próxima a 0	No hay anclaje en la celda de flujo.	Los anclajes se añaden durante el acondicionamiento de la celda de flujo (tubo FCT). Añadir FCT al vial FCF antes de acondicionar la celda de flujo.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado	Fragmentación no deseada de la muestra de ADN	La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN tiende a fragmentarse durante la extracción y la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de longitudes de fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. En la imagen superior, la muestra 1 contiene un elevado peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado. 3. Durante la preparación de la biblioteca, evite pipetear y agitar en vórtex al mezclar los reactivos. Dar suaves golpecitos con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros inutilizables

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inutilizables (se muestran en azul en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros) Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros "no disponibles».	Hay contaminantes presentes en la muestra	Algunos contaminantes se eliminan de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "poro en secuenciación". Si la porción de poros inutilizables se mantiene elevada o aumenta: realizar un lavado con nucleasa con el kit Flow Cell Wash (EXP-WSH004).

Gran proporción de poros inactivos

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas han sufrido daños irreversibles)	Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo	Si se introducen burbujas de aire durante el acondicionamiento de la celda de flujo y la carga de la biblioteca, se corre el riesgo de dañar irreversiblemente los poros.. La forma más eficaz de evitar que esto ocurra se muestra en el vídeo Cómo cargar celdas de flujo PromethION.
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles	Ciertos compuestos copurificados con ADN	Ciertos compuestos, incluyen polisacáridos. Purificar con el kit PowerClean Pro de QIAGEN.
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles	Hay contaminantes presentes en la muestra	Los efectos de los contaminantes se muestran en el documento técnico Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Fluctuación de la temperatura

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura	La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo	Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar hasta que las clavijas del conector estén firmemente en contacto con el dispositivo. Si el problema persiste, contacte con el servicio de Asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje «Error al intentar alcanzar la temperatura deseada»	El dispositivo se colocó en una ubicación con una temperatura ambiente inferior a la media o con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo).	MinKNOW establece un intervalo de tiempo para que la celda de flujo alcance la temperatura fijada. Si se supera el tiempo establecido, aparecerá un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continuará. Secuenciar a una temperatura incorrecta suele provocar una disminución en el rendimiento y generar índices de calidad Q score menores. Corregir la ubicación del dispositivo, procurando que esté a temperatura ambiente y con buena ventilación; a continuación, reiniciar el proceso en MinKNOW.