本指南介绍了如何结合免扩增条形码试剂盒与 MinKNOW 的适应性采样靶向富集功能，完成文库制备和适应性采样测序。每张 PromethION 测序芯片支持 3 个样本的混样测序。多样本混样适应性采样方案包包含本指南所需的全部 Oxford Nanopore Technologies 试剂，提供 18 个样本和 72 个样本两种规格，内含免扩增条形码试剂盒及测序所需的配套产品，是实施本工作流程的标准配置。

您可以直接使用 Oxford Nanopore 提供的即用型数字化基因集（仅供科研使用），其配套的 BED 文件中已列明需要富集的目标区域；也可通过适应性采样数字化基因集设计工具（Digital Panel Designer）创建自定义基因集。创建方法详见适应性采样技术指南 - 数字化基因集设计工具。

本方案不涵盖数据分析。第 13 节“数据输出与分析”说明了分析时应使用的 BED 文件和工作流程。其中，遗传性癌症基因集使用 wf-hereditary-cancer，自定义生殖系基因集使用 wf-human-variation。

多样本混样适应性采样方案主要用于生殖系分析。此类分析通常只需目标区域达到中等测序深度，无需达到低频变异检测所要求的较高测序深度。

对于目标区域占基因组 0.1–5% 的基因集，预计每张芯片上的三个样本均可达到约 30× 的目标区域平均测序深度，且各样本约 90% 的目标碱基测序深度超过 20×。实际测序深度因自定义基因集的大小、基因组成和序列特征而异，也受芯片可用纳米孔数量、文库片段长度及三个样本混合比例的影响。

我们建议您在批量处理样本前，先开展预实验，确认测序深度能否满足您的分析需求。

Oxford Nanopore 数字化基因集规格

即用型数字化基因集

项目	遗传性癌症	泛癌种	泛血液肿瘤
富集基因	258 个遗传性癌症风险相关基因	723 个癌症相关基因	144 个血液恶性肿瘤相关基因
经验证的适应性采样方案	多样本混样适应性采样	超快速单样本适应性采样 单样本适应性采样	单样本适应性采样
起始量†	1 µg	超快速单样本：1 µg 单样本：500 ng–1 µg*	1 µg
起始样本类型	血液	实体瘤组织	血液、骨髓
推荐提取试剂盒	使用 Qiagen Puregene 试剂盒从人类血液中提取基因组 DNA‡	1. QIAamp Fast DNA Tissue 试剂盒（Qiagen，51404）：推荐用于超快速单样本适应性采样。 2. Puregene Tissue 试剂盒（Qiagen，158063） 3. MagAttract HMW DNA 试剂盒（Qiagen，67563）	1. 使用 Qiagen Puregene 试剂盒从人类血液中提取基因组 DNA‡ 2. QIAamp DSP DNA Mini 试剂盒（Qiagen，61304） 3. GenFind V3 Genomic DNA Extraction 试剂盒（Beckman Coulter，C34880）
质量控制（Femto Pulse）	可使用 Femto Pulse 系统检测提取的 gDNA，查看机械打断前后的片段长度分布图谱。示例见“起始 DNA”一节。	可使用 Femto Pulse 系统检测提取的 gDNA，查看机械打断前后的片段长度分布图谱。示例见“DNA 质控”一节。	可使用 Femto Pulse 系统检测提取的 gDNA，查看机械打断前后的片段分布图谱。示例见“DNA 质控”一节。
机械打断条件（离心速度及时间）	以约 3,381 × g 离心 3 次，每次 1 分钟，每两次离心之间将管倒置。	以约 3,381 × g 离心 2 次，每次 30 秒，两次离心之间将管倒置。	以约 4,868 × g 离心 2 次，每次 1 分钟，两次离心之间将管倒置。
参考基因组	GRCh38_GIABv3	GRCh38_GIABv3	GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fna
富集用 BED 文件（下载链接见适应性采样页面）	ONT_AS_HCP_GRCh38_enrichment_v1.bed	ONT_AS_PanCancer_GRCh38_enrichment_v1.bed	ONT_AS_PanHaem_GRCh38_enrichment_v1.bed

• DNA 起始量最低为 500 ng，但建议尽可能使用 1 µg，以提高纳米孔利用率。

^†为提高纳米孔利用率，DNA 起始量最多可增加至 2 µg。

^‡该提取方法经 Oxford Nanopore 调整优化，使用 Puregene Blood 试剂盒（Qiagen，158023），采用更温和的混匀方式，并将最终 DNA 重悬步骤的温度由 65°C 调整为 50°C。

实验准备

您将需要：

• 提取起始样本（全血、gDNA）。 您可以采用以下推荐方案：使用 Qiagen Puregene 试剂盒从人全血中提取基因组 DNA。
• 通过数字化基因集设计工具（Digital Panel Designer）设计自定义基因集并导出 BED 文件，或直接下载即用型基因集的 BED 文件，并下载相应的 FASTA 参考文件（见第 4 节）。
• 确保您已准备好测序试剂盒、正确的仪器以及第三方试剂。
• 下载数据收集和分析软件。
• 检查您的测序芯片上有足够的活性纳米孔，以确保测序良好运行。

样本制备、建库及测序

实验步骤	流程	时间	中止节点
样本制备	从样本中提取 gDNA 并定量。将 gDNA 片段化并定量。 评估提取产物的长度、浓度和纯度。我们建议您在实验过程中进行各项质量评估，以确保实验顺利完成。	取决于采用的提取方法 机械打断约需 15 分钟	此时，可将提取的 gDNA 或片段化后的 gDNA 于 –20°C 保存，以备后续使用。
DNA 损伤及末端修复	修复 DNA，并对 DNA 进行末端修复以便与接头连接	60 分钟	4°C 过夜
免扩增条形码连接	将免扩增条形码连接至 DNA 末端。	70 分钟	4°C 过夜
测序接头连接与纯化	将测序接头连接到 DNA 末端。	60 分钟	4°C 过夜
测序芯片的预处理及上样	对测序芯片进行预处理，然后将制备好的 DNA 文库加入测序芯片。	10 分钟
测序	在测序设备上对文库进行测序。	72 小时
数据分析	采用适合的 EPI2ME 工作流程。

For a successful Adaptive Sampling run, MinKNOW needs two files: an enrichment BED file, which lists the regions to enrich for, and a reference FASTA file for the same genome build. Enrichment BED files can be created in the Digital Panel Designer, or you can start from one of our ready-to-use panels. Instructions for using the Digital Panel Designer, including the design checks and buffer settings, are given in the Adaptive Sampling technical guide.

The export produces three BED files and a summary report. The files are named by date and panel name, in the form:

YYYY-MM-DD_panel-name_enrichment.bed

Only the enrichment BED file is loaded into MinKNOW.

File	Contents	Used in
*_enrichment.bed	Two rows per target, one for the plus strand and one for the minus strand, each with buffer at the 5′ end.	MinKNOW in the Adaptive Sampling BED field (section 12).
*_analysis.bed	One row per target, with no buffer.	Coverage and variant calling over the targets (section 13).
*_exons.bed	One row per exon of the MANE Select transcript of each gene, or of the Ensembl canonical transcript where there is none.	Exon-level coverage analysis (section 13).
summary.html	Panel statistics, design checks, the target table and a genome browser view of the targets and buffers.	Your record of the panel design.

MinKNOW needs a reference FASTA file to align reads and make Adaptive Sampling decisions. The reference must be the same genome build that was selected in the Digital Panel Designer when the panel was exported. We recommend the following files:

Panel	Build	Reference FASTA file for MinKNOW	Source
Custom panel	GRCh38	GCA_ 000001405. 15_ GRCh38_ no_ alt_ analysis_ set. fna. gz	NCBI
Custom panel	GRCh37	hg19. fa. gz	UCSC
Hereditary Cancer Panel	GRCh38	GRCh38_ GIABv3_ no_ alt_ analysis_ set_ maskedGRC_ decoys_ MAP2K3_ KMT2C_ KCNJ18. fasta. gz	Genome in a Bottle

For the Hereditary Cancer Panel, we recommend the Genome in a Bottle (GIAB) v3 GRCh38 reference, which was used to establish the performance of the panel. It is the GRCh38 no-alt analysis set with falsely duplicated regions of the assembly masked, so it uses the same coordinates, and the panel BED files exported from the Digital Panel Designer can be used with it unchanged.

The GRCh38 files above contain no alternate locus contigs. If a reference that includes alternate contigs is used instead, reads from regions with alternate haplotypes, such as the HLA genes, can be split between the primary assembly and the alternate contigs. The hg19 file contains a small number of haplotype contigs in the MHC region, and the same applies to panels with targets in that region.

If you use another reference file whose chromosome names differ from the BED files, rename the chromosomes in the BED files to match the reference. Do not rename the reference. We do not advise pre-indexing the reference before uploading it, as MinKNOW indexes it automatically at the start of the run. Reference requirements are described in more detail in the Adaptive Sampling technical guide.

多样本混样适应性采样方案包 包含本指南所需的全部 Oxford Nanopore Technologies 试剂，提供 18 个样本或 72 个样本两种规格。

方案包内含免扩增条形码试剂盒及测序所需的配套产品，是实施本工作流程的标准配置。

有关方案包及其中产品的详细信息，请参阅 Nanopore 商城中的以下产品页面：

• 多样本混样适应性采样方案包 18：适用于 18 个样本
• 多样本混样适应性采样方案包 72：适用于 72 个样本

• 约 1 µg 经片段化的 gDNA

DNA 质控

选择符合质量和浓度要求的起始 DNA 至关重要。使用过少或过多的 DNA，或者质量较差的 DNA（如，高度碎片化、含有RNA或化学污染物）都会影响文库制备。

有关如何对 DNA 样品进行质控，请参考起始 DNA/RNA 质控实验指南。

化学污染物

不同的 DNA 提取方法可能导致纯化后的 DNA 中残留不同的化学污染物。这会影响文库的制备效率和测序质量。请参阅牛津纳米孔社区的污染物 页面了解更多信息。

Oxford Nanopore Technologies 推荐您使用本实验指南中列出的所有第三方试剂，并已对其进行验证。我们尚未对其它替代试剂进行测试。

除非指南中另有说明，所有第三方试剂均建议按照制造商的说明进行使用前准备。

我们强烈建议您在保修期内、开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。使用前，请从冷藏环境中取出测序芯片并拆除包装，在室温下回温 30 分钟。使用前，请从冰箱中取出测序芯片并拆除包装，在室温下回温 30 分钟。

请您按照测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。您可在质检过程中查看新测序芯片的活性纳米孔数。PromethION 测序芯片的质保标准为不低于 5000 个活性纳米孔。有关测序芯片的质保期、稳定性及储存条件等详细信息，请访问 Oxford Nanopore 商城。如有任何疑问，请联系 Oxford Nanopore 技术支持。

对于活性孔数少于 5000 且尚未投入测序的 PromethION 芯片，Oxford Nanopore Technologies 将予以更换，但芯片须自收货之日起始终按照 Oxford Nanopore Technologies 建议的条件储存，并在质检后两日内报告质检结果。

推荐使用以下方案从血液中提取基因组 DNA（gDNA）：

使用 Qiagen Puregene 试剂盒从人全血中提取基因组 DNA

MinKNOW软件负责仪器控制，数据采集和实时碱基识别。

请参阅以下链接，获取有关设备设置和测序运行的详细操作说明：

• PromethION 24：Starting a sequencing run with PromethION 24（使用 PromethION 24 进行测序）
• PromethION 2 Integrated：Starting a sequencing run on PromethION 2 Integrated（使用 PromethION 2 Integrated 进行测序）

两款设备均采用相同的测序运行设置。

启动测序前，请确认：

• 设备中已保存所需的 FASTA 参考文件（见第 4 节“参考基因组”）和富集用 BED 文件。
• 设备有足够的存储空间，可保存每张芯片产出的数据。
• 已根据下文说明，决定是否启用“仅对目标序列进行碱基识别”选项。

建议您使用高精准（HAC）模型进行实时碱基识别，并以 BAM 格式输出。在 MinKNOW 中，您可通过“仅对目标序列进行碱基识别”选项选择碱基识别的范围；是否启用该选项，取决于您是否需要分析被适应性采样拒绝的测序片段。

仅对目标序列进行碱基识别	测序期间进行碱基识别的片段	可同时运行的测序芯片数量
关闭	所有测序片段，包括适应性采样拒绝的短片段。这些短片段可作为目标区域数据的补充，提供低深度全基因组及甲基化信息。	较少，因为所有片段均需进行碱基识别。
开启	仅限目标片段。被拒绝的片段以原始信号形式保存至运行（run）文件夹下的 pod5skip 文件夹，如有需要，可在测序结束后进行碱基识别。	可使用设备的全部芯片位置。

有关各设备开启或关闭“仅对目标序列进行碱基识别”选项后，可同时支持多少张芯片进行实时碱基识别，请参阅《适应性采样技术指南》中的 设备限制 一节。若同时运行的芯片数量超过指南中列出的上限，碱基识别将无法跟上测序进度，可能降低富集效果。

如需同时运行更多测序芯片并保留非目标数据，可 开启 “仅对目标序列进行碱基识别”，在测序结束后再对被拒绝的片段进行碱基识别，但这会延长设备的使用时间。具体操作请参阅下文“数据输出与分析”中的“测序结束后对被拒绝的片段进行碱基识别”一节。

在 MinKNOW 中设置测序实验：

1. 在 MinKNOW 中，选择 开始测序（Start sequencing），然后输入芯片位置、实验名称和样本 ID。
   此处填写的样本 ID 由整张测序芯片共用。输出文件和文件夹以条形码编号（如 barcode01、barcode02 和 barcode03）区分三个样本。请记录每个样本对应的条形码编号。
   如需为每个样本单独命名，请通过样本列表启动测序，具体操作请见下文 “可选：通过样本列表启动测序实验”。

2. 请按下表配置测序参数，其余设置保持默认值。

   界面	设置项	设置
   试剂盒	选择试剂盒	免扩增条形码试剂盒-24 V14（SQK-NBD114.24）或 免扩增条形码试剂盒-96 V14（SQK-NBD114.96）
   实验运行配置	修饰碱基识别	开启，并选择 CpG 位点的 5mC 和 5hmC
   	序列比对	开启，并上传与基因集匹配的参考 FASTA 文件：遗传性癌症基因集使用 GIAB v3；对于自定义基因集，请上传设计该基因集时所用参考基因组版本的 FASTA 文件（参见第 4 节“参考基因组”）
   	适应性采样	开启，并选择富集（Enrich）。上传富集用 BED 文件（*_enrichment.bed）以及与序列比对设置中相同的 FASTA 参考文件。
   	仅对目标序列进行碱基识别	按上文说明开启或关闭。
   输出	FASTQ	关闭
   	POD5	默认关闭。如需在测序结束后对适应性采样中被拒绝的测序片段进行碱基识别，请开启。

3. 启动实验。

使用样本表启动测序时，您可为三个样本分别指定名称。MinKNOW 会按样本名称而非条形码编号命名输出文件和文件夹。测序参数仍按上表设置。

• 创建一个 CSV 文件，每个条形码对应一行。文件须包含以下列：

  • experiment_id （实验名称，所有行均填写同一名称）
  • kit（SQK-NBD114.24）
  • barcode（例如，barcode01）
  • alias （条形码对应的样本名称）
    名称长度为 1–40 个字符，仅可包含字母、数字、连字符（-）、下划线（_）和英文句点（.），不得包含空格。
  • position_id （设备上的测序位置编号），或
  • flow_cell_id （测序芯片 ID）

• 保存文件时，请确保文件名以 .csv 结尾，否则 MinKNOW 无法识别该文件。

• 在 MinKNOW 中，选择“通过样本列表启动测序实验”（Start from a sample sheet），而 非 “开始测序”（Start sequencing），并选择已保存的 CSV 文件。MinKNOW 会从文件中自动读取测序芯片位置、实验名称和样本名称。其余测序参数请按上表设置。

• 有关样本列表的其他选项，请参阅 MinKNOW 文档中的 sample sheet section（样本列表选择）一节。

测序结束后，三个样本的数据将分别保存于对应的条形码文件夹中。每个 BAM 文件均包含经碱基识别的测序片段及其比对结果。比对所用的参考序列来自您上传至 MinKNOW 的 FASTA 文件。CpG 位点的 5mC 和 5hmC 识别结果仅在测序配置中启用修饰碱基识别时才会写入测序片段记录。

关闭 仅对目标序列进行碱基识别 选项时，BAM 文件也包含适应性采样中被拒绝的短测序片段。启用该选项后，系统不会对这些片段进行碱基识别，而是将其原始信号数据保存至 pod5skip 文件夹。

输出文件	说明
比对后的 BAM 文件（每个条形码对应一个文件夹）	包含各样本经碱基识别和比对的测序片段。若启用修饰碱基识别，还会包含相应的识别结果。
测序摘要与实验运行报告	汇总本次测序的读长、数据产出和适应性采样决策等信息。

If Basecall on-target reads only was switched On, the reads rejected by Adaptive Sampling are written to the pod5skip folder in the run folder. They can only be basecalled if POD5 output was switched On when the run was set up. Wait until the sequencing run has finished before basecalling them, as both processes compete for the compute on the device. Use the same basecalling model, modified base setting, reference FASTA file and barcode kit as the run, so that the rejected reads can be analysed alongside the BAM files from the run.

In the EPI2ME Desktop App, use the wf-basecalling workflow with the pod5skip folder as input, the HAC model and 5mC and 5hmC modified base model used for the run, the reference FASTA file, barcode kit SQK-NBD114.24 (or SQK-NBD114.96) and BAM output. The workflow writes aligned BAM files for each barcode.

On the command line, use the standalone Dorado software in two steps.
First basecall, align and identify the barcodes, replacing the file names with your own:

dorado basecaller hac,5mCG_5hmCG pod5skip/ --recursive --reference reference.fasta --kit-name SQK-NBD114.24 > rejected.bam 

Then split the reads by barcode, keeping the alignment:

dorado demux --output-dir rejected_by_barcode --no-classify --no-trim --sort-bam rejected.bam 

The --no-trim option is needed because dorado demux removes the alignment when it trims barcodes; the barcodes have already been trimmed during basecalling.
The --sort-bam option sorts and indexes the files for each barcode, and --recursive reads any sub-folders of the pod5skip folder.
The hac model name selects the current HAC model, which may be newer than the model used during the run; for an exact match, use the full model name shown in the run report.

请使用 *_analysis.bed 计算目标区域的测序深度，并仅在该文件列出的区域内检测变异。使用 *_enrichment.bed 计算测序深度会将缓冲区一并纳入统计，无法单独反映目标区域的测序深度。如需按外显子报告测序深度，请使用 *_exons.bed。

如您使用自定义生殖系基因集，可在 EPI2ME Desktop 中或通过命令行运行 wf-human-variation 工作流程，对每个样本分别进行变异检测、单倍型定相和甲基化分析。分析时需提供该样本条形码对应的 BAM 文件、参考序列 FASTA 文件和 *_analysis.bed 文件。

对于遗传性癌症基因集（Hereditary Cancer Panel），请使用 wf-hereditary-cancer 工作流程。

由于本实验测序时间较长，因此不建议在实验完成后重复使用该测序芯片，以免数据产出不足，无法满足后续分析需求。

以下表格列出了提取和文库制备过程中的常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的Support板块提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮（support@nanoporetech.com）或 纳米孔社区的在线支持（LiveChat）联系我们。

低质量样本

现象	可能原因	措施及备注
低纯度DNA（Nanodrop测定的DNA吸光度比值260/280<1.8， 260/230 <2.0-2.2）。	用户所使用的 DNA 提取方法未能达到所需纯度。	您可在污染物专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法 。 请考虑将样本再次用磁珠纯化。

经 AMPure 磁珠纯化后的 DNA 回收率低

现象	可能原因	措施及备注
低回收率	AMPure磁珠量与样本量的比例低于预期，导致DNA因未被捕获而丢失。	1.AMPure 磁珠沉降速度较快，因此在将磁珠加入样品前，请务必充分重悬混匀。 2.当AMPure磁珠量与样品量的比值低于0.4:1时，所有的DNA片段都会在纯化过程中丢失。
低回收率	DNA 片段短于预期。	AMPure磁珠量与样本量的比值越低，针对短片段的筛选就越严格。每次实验时，请先使用琼脂糖凝胶（或其他凝胶电泳方法）确定起始DNA的长度，据此计算出合适的AMPure磁珠用量。
末端修复后的 DNA 回收率低	清洗步骤所用乙醇的浓度低于70% 。	当乙醇浓度低于70%时，DNA会从磁珠上洗脱下来。请确保使用正确浓度的乙醇。

以下表格列出了提取和文库制备过程中的常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的Support板块提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮（support@nanoporetech.com）或 纳米孔社区的在线支持（LiveChat）联系我们。

MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数

现象	可能原因	措施及备注
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数	纳米孔阵列中引入了气泡。	在对通过质检的芯片进行预处理之前，请务必排出预处理孔附近的气泡。否则，气泡会进入纳米孔阵列对其造成不可逆转地损害。如何为 PromethION 测序芯片上样视频中演示了避免引入气泡的最佳操作方法。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数	测序芯片未正确插入测序仪。	停止运行测序，将芯片从测序仪中取出，再重新插入测序仪内。请确保测序芯片被牢固地嵌入测序仪中，且达到目标温度。您也可尝试将芯片插入仪器的其它芯片槽进行测序（如适用）。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数	文库中残留的污染物对纳米孔造成损害或堵塞。	在测序芯片质检阶段，我们用芯片储存缓冲液中的质控DNA分子来评估活性纳米孔的数量。而在测序开始时，我们使用DNA文库本身来评估活性纳米孔的数量。因此，活性纳米孔的数量在这两次评估中会有约10%的浮动。如测序开始时报告的孔数明显降低，则可能是由于文库中的污染物对膜结构造成了损坏或将纳米孔堵塞。用户可能需要使用其它的 DNA 提取或纯化方法，以提高起始核酸的纯度。您可在 污染物专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法。

MinKNOW脚本失败

现象	可能原因	措施及备注
MinKNOW 显示 "Script failed”（脚本失败）。		重启计算机及 MinKNOW。如问题仍未得到解决，请收集 MinKNOW日志文件并联系我们的技术支持。如您没有其他可用的测序设备，我们建议您先将装有文库的测序芯片置于4°C 储存，并联系我们的技术支持团队获取进一步储存上的建议。

纳米孔利用率低于40%

现象	可能原因	措施及备注
纳米孔利用率<40%	测序芯片中的文库量不够。	请确保您按照相应实验指南，向测序芯片中加入正确浓度和体积的测序文库。请在上样前对文库进行定量。
纳米孔利用率接近0	在接头连接后的纯化步骤中并未使用 LFB 或 SFB 洗涤，而是使用了酒精。	酒精可导致测序接头上的马达蛋白变性。请确保在测序接头连接后使用洗涤缓冲液（LFB或SFB）。
纳米孔利用率接近0	测序芯片中无系绳。	测序系绳（FCT）是随着预处理液加至芯片的。请确保在制备预处理液时，将测序芯片系绳（FCT）加入测序芯片冲洗液（FCF）中。

读长短于预期

现象	可能原因	措施及备注
读长短于预期	DNA样本降解	读长反映了起始DNA片段的长度。起始DNA在提取和文库制备过程中均有可能被打断。 1.请查阅纳米孔社区中的 提取方法 以获得最佳DNA提取方案. 2.在进行文库制备之前，请先跑电泳，查看起始DNA片段的长度分布。 在上图中，样本 1 为高分子量 DNA，而样本 2 为降解样本。 3.在制备文库的过程中，请避免使用吹打或/和涡旋振荡的方式来混合试剂。轻弹或上下颠倒离心管即可。

大量纳米孔处于不可用状态

现象	可能原因	措施及备注
大量纳米孔处于失活状态（在通道面板和纳米孔活动状态图上以蓝色表示。 上方的纳米孔活动状态图显示：状态为不可用的纳米孔的比例随着测序进程而不断增加。	样本中含有污染物。	使用MinKNOW中的“Unblocking”（疏通）功能，可对一些污染物进行清除。如疏通成功，纳米孔的状态会变为"测序孔"（sequencing pore）。若疏通后，状态为不可用的纳米孔的比例仍然很高甚至增加： 用户可使用 测序芯片冲洗试剂盒 (EXP-WSH004)进行核酸酶冲洗 操作。

大量纳米孔处于“失活”（Inactive）状态

现象	可能原因	措施及备注
大量纳米孔处于失活状态（在通道面板和纳米孔活动状态图上以浅蓝色表示。膜结构或纳米孔遭受不可逆转地损伤）。	测序芯片中引入了气泡。	在芯片预处理和文库上样过程中引入的气泡会对纳米孔带来不可逆转地损害。请观看如何为 PromethION 测序芯片上样了解最佳操作方法。
大量纳米孔处于失活/不可用状态	存在与DNA共纯化的化合物	已知的化合物包括多糖等。 使用 QIAGEN PowerClean Pro 试剂盒进行纯化。
大量纳米孔处于失活/不可用状态	样本中含有污染物。	您可在污染物专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法。

温度波动

现象	可能原因	措施及备注
温度波动	测序芯片和仪器接触不良	检查芯片背面的金属板是否有热垫覆盖。重新插入测序芯片，用力向下按压，以确保芯片的连接器引脚与测序仪牢固接触。如问题仍未得到解决，请联系我们的技术支持。

未能达到目标温度

现象	可能原因	措施及备注
MinKNOW显示“未能达到目标温度”	测序仪所处环境低于标准室温，或通风不良（以致芯片过热）。	MinKNOW 会限定测序芯片达到目标温度的时间。当超过限定时间后，系统会显示出错信息，但测序实验仍会继续。值得注意的是，在错误温度下测序可能会导致通量和数据质量（Q值）的降低。请调整测序仪的摆放位置，确保将其置于室温下、通风良好的环境中，再在MinKNOW中重启进程。