NO PUBLICADO - Extracción de ADN genómico a partir de sangre humana mediante el kit Puregene de Qiagen
Extraction Method
NO PUBLICADO - Extracción de ADN genómico a partir de sangre humana mediante el kit Puregene de Qiagen
FOR RESEARCH USE ONLY.
Contents
Introducción
Material
Método
Registro de cambios
Introducción
Este protocolo describe un método de extracción de ADN genómico a partir de muestras de sangre humana con el kit Puregene® Blood de Qiagen.
Material
- ≥1 ml de sangre humana fresca en un tubo de extracción con EDTA K2
Consumibles
- Kit Puregene Blood (Qiagen, 158023)
- Isopropanol al 100 % (Fisher Scientific, 10723124)
- Etanol al 80 %, recién preparado con agua sin nucleasas
- Amortiguador TE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH de 8,0) (Fisher Scientific 10224683)
- Agua sin nucleasas (p. ej., Thermo Scientific, AM9937)
- Material absorbente, como papel de cocina o pañuelos de papel
- Kit de ensayo Qubit™ dsDNA BR (Invitrogen, Q32850)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
- Tubos Falcon de 15 ml
- Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
Material opcional:
- Kit de análisis de ADN genómico de 165 kb (Agilent, FP-1002-0275)
Instrumental
- Centrífuga y rotor compatibles con tubos Falcon de 15 ml
- Incubadora o baño termostático ajustado a 37 °C y 50 °C
- Mezclador vórtex
- Microcentrífuga
- Fluorímetro Qubit™ (o equivalente a efectos de control de calidad)
- Cubeta con hielo
- Temporizador
- Puntas de pipeta de punta ancha
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
Material opcional
- Sistema Femto Pulse de Agilent (o equivalente, a efectos de control de calidad de la longitud de las lecturas)
Método
Extracción de ADN genómico
1. Añadir 3 ml de RBC Lysis Solution a un tubo Falcon de 15 ml.
2. Comprobar que la sangre esté bien mezclada en el tubo con EDTA K2; a continuación, transferir 1 ml de la muestra de sangre al tubo con la solución de lisis de eritrocitos (RBC).
3. Mezclar el contenido invirtiendo el tubo 10 veces.
4. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente (15–25 °C). Invertir al menos una vez durante la incubación.
5. Centrifugar durante 2 minutos a 2 000 × g a fin de que los leucocitos se sedimenten.
6. Desechar con cuidado el sobrenadante dejando aproximadamente 200 µl del líquido sobrante junto con el sedimento de leucocitos.
El sobrenadante se extrae con la pipeta o vertiendo el contenido sobre un material absorbente.
7. Dar suaves golpecitos al tubo o mezclar con una pipeta de punta ancha a fin de resuspender el sedimento en el líquido restante.
El sedimento debe quedar resuspendido por completo, lo que facilita la lisis celular en el siguiente paso.
8. Añadir 3 ml de solución de lisis celular.
Mezclar suavemente con la pipeta entre 10 y 15 veces a fin de lisar las células y homogeneizar la solución hasta que no queden grumos. Comprobar que la solución esté bien mezclada.
9. Incubar la reacción a 37 °C durante 30 minutos.
Al terminar la incubación, comprobar que esté homogeneizada y no queden grumos.
Si es necesario, mezclar con una pipeta de punta ancha o invertir el tubo con cuidado hasta homogeneizarla.
10. Añadir 15 μl de solución de ribonucleasa A e incubar la mezcla durante 15 minutos a 37 °C.
11. Trasladarla a una cubeta con hielo e incubarla durante 3 minutos hasta que la muestra se enfríe.
12. Añadir 1 ml de solución de precipitación de proteínas. Agitar el tubo en vórtex dos veces durante 5 segundos cada una.
13. Centrifugar brevemente la muestra durante 5 minutos a 2 000 × g.
La proteína precipitada debe formar un sedimento compacto de color marrón rojizo. Si no está bien formado, incubar el tubo en hielo durante 5 minutos y repetir la centrifugación.
14. Añadir 3 ml de isopropanol a un tubo Falcon de 15 ml.
15. Verter con cuidado el sobrenadante de la muestra en el tubo Falcon de 15 ml que contiene isopropanol.
Tener cuidado de que el sedimento no se desprenda durante el vertido.
Otra posibilidad es transferir el sobrenadante con la pipeta; en ese caso, evitar alterar el sedimento proteico y procurar que permanezca intacto.
Nota: si en algún momento el sedimento se altera, repetir la centrifugación a 2 000 × g durante 10 minutos. Transferir solo el sobrenadante transparente a fin de evitar la contaminación por proteínas en el eluido resultante.
16. Mezclar suavemente invirtiendo el tubo 50 veces, hasta que el ADN se vea en forma de hilos o un grumo.
17. Centrifugar el tubo durante 3 minutos a 2 000 × g.
El ADN aparecerá en forma pequeño sedimento blanco en el fondo del tubo.
18. Desechar el sobrenadante con cuidado y vaciar el tubo invirtiéndolo sobre un trozo de papel absorbente. Procurar que el sedimento de ADN permanezca intacto.
El sobrenadante se extrae con la pipeta o vertiendo el contenido sobre un material absorbente. Tenga cuidado ya que el sedimento tal vez esté suelto y se desprenda con facilidad.
19. Preparar 300 µl de etanol al 80 % con agua sin nucleasas y colocar en hielo.
20. Añadir 300 µl de etanol frío, recién preparado, al tubo de la muestra. Lavar el sedimento de ADN invirtiendo el tubo con cuidado varias veces.
21. Transferir el sedimento y el volumen entero de 300 µl de etanol a un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
22. Centrifugar el tubo de la muestra durante 1 minuto a 2 000 × g.
23. Desechar el sobrenadante con cuidado y vaciar el tubo invirtiéndolo sobre un trozo de papel absorbente. Procurar que el sedimento de ADN permanezca intacto en el tubo.
El sobrenadante se extrae con la pipeta o vertiendo el contenido sobre un material absorbente. Tenga cuidado ya que el sedimento tal vez esté suelto y se desprenda con facilidad.
24. Destapar el tubo y dejar secar el sedimento durante 1 minuto.
Evite secarlo en exceso; no deje que se agriete.
25. Añadir 100 μl de amortiguador TE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH de 8,0) en el tubo que contiene el sedimento de muestra. Resuspender el sedimento con cuidado mediante ligeros golpecitos con el dedo.
26. Incubar el tubo durante 2 horas a 50 °C, mezclando de vez en cuando el contenido (100 μl) con una pipeta de punta ancha.
El sedimento de ADN tal vez tarde un poco en solubilizarse. Comprobar que la solución esté bien homogeneizada antes de cuantificarla.
Opcional: otra posibilidad es realizar la incubación a temperatura ambiente durante la noche.
Cuantificación del ADN
- Cuantificar la muestra tres veces con el kit Qubit dsDNA BR Assay. Comprobar que las lecturas sean coherentes antes de pasar al siguiente paso.
Tras la extracción de la muestra, por lo general se obtendrán entre 10 y 30 µg de ADNg.
Los valores previstos en las lecturas están entre 100 y 300 ng/μl.
- Si los resultados no son coherentes, es posible que el ADN no se haya resuspendido de manera homogénea.
Si se da el caso, recomendamos aumentar el tiempo de incubación y dar tiempo a que el sedimento de ADN se solubilice.
Nota: la incubación a 50 °C en un agitador térmico a 300 rpm facilita la elución. Otra alternativa es utilizar un agitador rotatorio de volteo.
- También es posible analizar el ADNg extraído con Femto Pulse (de Agilent), que analiza su tamaño y calidad.
A continuación se muestra un perfil de longitud de fragmentos de ADNg extraído de sangre humana con el kit Puregene Blood:
Registro de cambios
| Fecha | Versión | Cambios realizados |
|---|---|---|
| 11 nov 2026 | v1 | Publicación del documento |
