本指南介绍了使用 Qiagen Puregene® Blood Kit（血液 DNA 提取试剂盒）从人血样本中提取基因组 DNA 的方法。

• 人全血：≥ 1 ml（使用 EDTA K2 真空采血管采集）

• Puregene Blood Kit（血液 DNA 提取试剂盒，Qiagen, 158023）
• 异丙醇，100%（Fisher, 10723124）
• 新制备的 80% 乙醇（用无核酸酶水配制）
• TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0）（Fisher scientific，10224683）
• 无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
• 吸水材料（如吸水纸或纸巾）
• Qubit™ dsDNA BR Assay（双链DNA宽范围检测）试剂盒（Invitrogen，Q32850）
• Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
• 15 ml Falcon 离心管
• 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管

可选耗材：

• 基因组 DNA 165 kb 分析试剂盒（Agilent，FP-1002-0275）

• 适用于 15 ml Falcon 管的离心机及转子
• 设定为 37°C 和 50°C 的培养箱或水浴锅
• 涡旋混匀仪
• 迷你离心机
• Qubit™ 荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
• 盛有冰的冰桶
• 计时器
• 宽口移液枪头
• P1000 移液枪和枪头
• P200移液枪和枪头
• P20 移液枪和枪头
• P10 移液枪和枪头
• P2 移液枪和枪头

可选仪器：

• Agilent Femto Pulse 系统（或用于读长质控的等效仪器）

1.向 15 ml Falcon 管中加入 3 ml 红细胞裂解液（RBC Lysis Solution）。

2.充分混匀 EDTA K2 采血管中的血液，然后取 1 ml 血液样本加入含有红细胞裂解液的离心管中。

3.将离心管上下颠倒混匀 10 次。

4.室温（15–25°C）下孵育5分钟。孵育期间，至少将离心管颠倒混匀 1 次。

5.以 2000 x g 离心两分钟以沉淀白细胞。

6.小心弃去上清液，确保管内留有白细胞沉淀及约 200 μL 液体。

上清液可用移液枪吸除，或直接倾倒至吸水材料上。

7.轻弹离心管，并/或用宽口枪头轻轻吹打，将白细胞沉淀重悬于残留液体中。

细胞沉淀在重悬后应完全分散，以利于后续的细胞裂解步骤。

8.加入 3 ml 细胞裂解液（Cell Lysis Solution）。

使用宽口枪头轻柔吹打 10–15 次，直至样品完全均一、无结块。确保溶液混合均匀。

9.37℃ 下孵育 30 分钟。

孵育结束时，请确保溶液充分均一，且无结块残留。
必要时，可使用宽口移液枪头吹打混匀，或轻柔倒转各管以促进溶液混匀。

10.加入 15 μl RNase A 溶液，在 37°C 孵育 15 分钟。

11.将反应管转移至冰浴中，冷却 3 分钟，使样本迅速降温。

12.向样本中加入 1 ml 蛋白沉淀液（Protein Precipitation Solution）。将离心管涡旋振荡两次，每次 5 秒。

13.2000 × g 离心 5 分钟。

蛋白应形成紧实的红褐色沉淀。若蛋白沉淀不够紧实，可将离心管在冰上放置 5 分钟后重复离心。

14.在一支新的 15 ml Falcon 管中加入 3 ml 异丙醇。

15.将样品管中的上清液小心倒入装有异丙醇的 15 ml Falcon 管中。

倾倒过程中应确保蛋白沉淀保持完整，不被扰动。

或者，您也可使用移液枪转移上清液，操作过程中同样应确保蛋白沉淀保持完整，不被扰动。

注意： 如蛋白沉淀在任何步骤中被扰动，请重新以 2000 × g 离心 10 分钟。请确保仅转移澄清的上清液，防止蛋白污染最终洗脱液。

16.轻柔倒转离心管约 50 次混匀，直至 DNA 呈丝状或结块。

17.2000 × g 离心 3 分钟。

DNA 可能在管底形成小的白色沉淀。

18.小心弃去上清液，并将离心管倒置在干净的吸水纸上以沥干残液。确保 DNA 沉淀未被扰动且留在管内。

上清液可用移液枪吸除，或直接倾倒至吸水材料上。操作时需小心，DNA 沉淀可能较为松散，容易脱落。

19.准备 300μl 新制备的 80％ 乙醇（用无核酸酶水配制），置于冰上。

20.向样品中加入 300 μl 预冷、新鲜配制的 80% 乙醇，轻轻倒转数次以清洗 DNA 沉淀。

21.将 DNA 沉淀及全部 300 μl 乙醇转移至一支新的 1.5 ml Eppendorf 离心管中。

22.2,000 × g 离心 1 分钟。

23.小心弃去上清液，并将离心管倒置在干净的吸水纸上以沥干残液。确保 DNA 沉淀未被扰动且留在管内。

上清液可用移液枪吸除，或直接倾倒至吸水材料上。操作时需小心，DNA 沉淀可能较为松散，容易脱落。

24.打开管盖，将 DNA 沉淀在空气中干燥 1 分钟。

请避免过度干燥，DNA 沉淀不应干燥至开裂。

25.向 DNA 沉淀中加入 100 μl TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0）。轻弹离心管以重悬沉淀。

26.在 50°C 下孵育 2 小时，期间使用宽口枪头不时混匀全部体积（100 μl）。

DNA 沉淀可能需要一定时间才能完全溶解；定量前请确保溶液已充分混匀。

可选：孵育步骤亦可在室温下过夜完成。

• 使用 Qubit dsDNA BR Assay(双链 DNA 宽范围检测）试剂盒对样品进行三次定量。在继续后续步骤前，请确认三次测量结果一致。

核酸提取后，通常可获得 10–30 μg 的 gDNA。
Qubit 测得浓度的预期范围为 100–300 ng/μl。

• 如果 Qubit 测量结果存在较大差异，可能是由于 DNA 未充分重悬混匀所致。

此时建议延长孵育时间，以促进 DNA 完全溶解。

注意： 将样品置于恒温混匀仪内，在 50°C 条件下以 300 RPM 轻柔振荡孵育，可促进洗脱，或使用翻转式混匀仪。

• 您可使用 Femto-Pulse（Agilent）评估所提取 gDNA 的长度和质量。

下图为使用 Puregene Blood Kit（血液 DNA 提取试剂盒）从人血样本中提取的 gDNA 片段长度分布示例：