Ligation sequencing DNA V14 - automated Hamilton NGS STAR 96 (SQK-LSK114-XL)
PromethION: Protocol
Ligation sequencing DNA V14 - automated Hamilton NGS STAR 96 (SQK-LSK114-XL) V GDA_9167_v114_revJ_24Aug2022
- This protocol uses genomic DNA
- Automation of library preparation
- Increased reproducibility and speed
- Reduces human error
- High sequencing output
- Library preparation time ~1.5 hours hands-on-time and ~3-4 hours automation time
- Fragmentation is optional
- No PCR required
- Multiple samples can be prepared simultaneously
- Compatible with R10.4.1 flow cells
For Research Use Only
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introduction to the protocol
Automated library preparation
- 4. DNA repair and end-prep
- 5. Adapter ligation and clean-up
- 6. Priming and loading the PromethION flow cell
Secuenciación y análisis
- 7. Data acquisition and basecalling
- 8. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo
- 9. Análisis
Troubleshooting
Descripción general
- This protocol uses genomic DNA
- Automation of library preparation
- Increased reproducibility and speed
- Reduces human error
- High sequencing output
- Library preparation time ~1.5 hours hands-on-time and ~3-4 hours automation time
- Fragmentation is optional
- No PCR required
- Multiple samples can be prepared simultaneously
- Compatible with R10.4.1 flow cells
For Research Use Only
1. Overview of the protocol
Ligation Sequencing Kit XL V14 features
This kit is recommended for users who:
- Would like to process multiple samples simultaneously, either with a multichannel pipette or a liquid-handling robot
- Would like to achieve raw read sequencing modal accuracy of Q20+ (99%) or above
- Require control over read length
- Would like to utilise upstream processes such as size selection, whole genome amplification, or enrichment for long reads
IMPORTANTE
Optional fragmentation and size selection
By default, the protocol contains no DNA fragmentation step, however in some cases it may be advantageous to fragment your sample. For example, when working with lower amounts of input gDNA (100 ng – 500 ng), fragmentation will increase the number of DNA molecules and therefore increase throughput. Instructions are available in the DNA Fragmentation section of Extraction methods.
Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments - instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.
IMPORTANTE
Kit 14 sequencing and duplex basecalling info sheet
The Kit 14 chemistry is a new development from Oxford Nanopore Technologies with improved duplex basecalling, which requires a different set of tools. For more information, please see the Kit 14 sequencing and duplex basecalling info sheet. We strongly recommend that you read it before proceeding with Kit 14 chemistry sequencing experiments and basecalling duplex data.
Introduction to the automated Ligation Sequencing protocol for DNA
This protocol describes how to carry out sequencing of a DNA sample using the Ligation Sequencing Kit XL (SQK-LSK114-XL).
We have developed this automated protocol on the Hamilton NGS STAR 96 liquid handling robot. The majority of the process is automated with minimal hands-on time which is required for sample quantification and deck re-loading.
It is highly recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.
To efficiently load multiple PromethION Flow Cells, we recommend using the Loading multiple PromethION Flow Cells protocol as a guideline.
Steps in the sequencing workflow:
Prepare for your experiment You will need to:
- Extract your DNA and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
- Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment, primed liquid-handling robot and third-party reagents
- Download the software for acquiring and analysing your data
- Check your flow cells to ensure they have enough pores for a good sequencing run
__Library preparation__ You will need to:
- Repair the DNA and prepare the DNA ends for adapter attachment
- Attach sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
- Prime the flow cell and load your DNA library into the flow cell
Sequencing and analysis You will need to:
- Start a sequencing run using the MinKNOW software which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
IMPORTANTE
Compatibility of this protocol
This protocol should only be used in combination with:
- Ligation Sequencing Kit XL V14 (SQK-LSK114-XL)
- R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M)
- Flow Cell Wash Kit XL (EXP-WSH004-XL)
2. Equipment and consumables
Material
- 1 µg (o 100-200 fmol) de ADN genómico de alto peso molecular
- o 100+ ng de ADN genómico de alto peso molecular (si se fragmenta el ADN).
- Ligation Sequencing Kit XL V14 (SQK-LSK114-XL)
Consumibles
- NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB E7180S or E7180L) (módulo de acompañamiento NEBNext de secuenciación por ligación para Oxford Nanopore Technologies®) Como alternativa, se pueden utilizar los siguientes productos de NEBNext®:
- NEBNext FFPE Repair Mix (NEB M6630) (mezcla de reparación de ADN)
- NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (NEB E7546) (Módulo de reparación de extremos/Adición de dA)
- NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056) (Módulo de ligación rápida)
- Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™ cat # A63881)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235948)
- Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235903)
- Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235905)
- Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid (Cat# 56694-01)
- Hamilton PCR ComfortLid (Cat# 814300)
- Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plates (Cat# HSP9601)
- Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs (Cat# 96424-02)
- Sarstedt Inc Screw Cap Micro tube 2 ml, PP 1000/case (e.g. FisherScientific, Cat# NC0418367)
- Thermo Scientific™ Abgene™ 96 Well 0.8 ml Polypropylene Deepwell Storage Plate (Thermo Scientific™, cat # AB0859)
Instrumental
- Cubeta con hielo
- Mezclador vórtex
- Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
- Hamilton NGS STAR 96 (NGS STAR with Multi-Probe Head 96)
- Hamilton On-Deck Thermal Cycler (ODTC)
Equipo opcional
- Bioanalizador Agilent (o equivalente)
- Qubit fluorometer plate reader (or equivalent for QC check)
Ajuste la cantidad de muestra en función de la longitud de la muestra de ADN inicial:
| Longitud de fragmentos | Cantidad de muestra inicial |
|---|---|
| Muy cortos (<1 kb) | 200 fmol |
| Cortos (1-10 kb) | 100–200 fmol |
| Largos (>10 kb) | 1 µg |
Para más información acerca de las cantidades de muestra inicial y de carga de las celdas de flujo en los protocolos de secuenciación por ligación, consulte este documento técnico
Input DNA
How to QC your input DNA
It is important to use a plate reader to ensure the input DNA meets the quantity and quality requirements. Using too little or too much DNA, or DNA of poor quality (e.g. highly fragmented or containing RNA or chemical contaminants) can affect your library preparation.
For instructions on how to perform quality control of your DNA sample, please read the Input DNA/RNA QC protocol.
Input file worklist
A worklist input Excel file is required prior to running the protocol on the Hamilton NGS STAR 96. These contain information regarding the appropriate number of samples and well identifiers.
Example:
Source_SampleID | Source_Well | Target_Well |
|---|---|---|
| Sample_01 | A1 | A1 |
| Sample_02 | B1 | B2 |
| Sample_03 | C1 | C1 |
Hamilton NGS STAR 96
This method has been tested and validated using the Hamilton NGS STAR 96 (with 8 channels and MPH96) including an on deck thermal cycler (ODTC). An option to not use the ODTC is available in the method. The protocol may require some fine tuning for the NGS STAR 96 setup and the temperature/humidity of the customer laboratory.
Please contact your Hamilton representative for further details.
Deck layout 
- ODTC: On-Deck Thermal Cycler Module
- MIDI plates: Abgene™ 96 Well 0.8mL Polypropylene Deepwell Storage Plate
- Troughs: Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs
- HSP plates: Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plates
- Hamilton ComfortLid: Hamilton PCR ComfortLid
NEBNext® Companion Module para secuenciación por ligación, de Oxford Nanopore Technologies®
A los clientes que no conozcan la secuenciación por nanoporos, se les recomienda que adquieran el módulo de acompañamiento NEBNext® Ligation Sequencing para Oxford Nanopore Technologies® (NEB E7180S o E7180L), que contiene todos los reactivos NEB necesarios para usar con el kit Ligation Sequencing Kit.
Nótese que en los protocolos con amplicones no es necesario usar ni la mezcla de reparación de ADN NEBNext FFPE DNA Repair Mix, ni el tampón de reparación de ADN NEBNext FFPE DNA Repair Buffer.
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
IMPORTANTE
A fin de garantizar un elevado rendimiento de ligación del adaptador Ligation Adapter (LA), recomendamos el uso del tampón Ligation Buffer (LNB) incluido en el kit Ligation Sequencing Kit V14, en lugar del tampón de ligasa de otros fabricantes.
IMPORTANTE
El adaptador incluido en este kit, Ligation Adapter (LA), no es intercambiable con otros adaptadores de secuenciación.
Consumables and reagent quantities required:
| Consumables | X24 samples | X48 samples | X96 samples |
|---|---|---|---|
| Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter | 216 | 432 | 768 |
| Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter | 451 | 694 | 1176 |
| Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter | 64 | 64 | 64 |
| Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid | 3 | 3 | 3 |
| Hamilton PCR ComfortLid | 1 | 1 | 1 |
| Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plate | 2 | 2 | 2 |
| Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs | 2 | 2 | 2 |
| Sarstedt Inc Screw Cap Micro Tube 2ml | 2 | 4 | 5 |
| Abgene™ 96 Well 0.8mL Polypropylene Deepwell Storage Plate | 2 | 2 | 2 |
| Reagents/kits | X24 samples | X48 samples | X96 samples |
|---|---|---|---|
| 80% ethanol | 16.5 ml | 28 ml | 51 ml |
| AMPure XP Beads | 6.8 ml | 9.7 ml | 15.5 ml |
| Ligation Sequencing Kit XL V14 (SQK-LSK114-XL) | 1 kit | 1 kit | 2 kits |
| NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180L) | 1 kits | 1 kits | 1 kits |
| NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180S) | - | 1 kits | 1 kits |
| Alternatively: | - | - | - |
| NEBNext FFPE DNA Repair Mix (Cat# M6630L) | 1 kit | 1 kit | 2 kits |
| NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (Cat# E7546L) | 1 kit | 2 kits | 3 kits |
| NEBNext Quick Ligation Module (Cat# E6056L) | 1 kit | 2 kits | 3 kits |
Note: These are the number of kits required for one run through for the selected number of samples.
Ligation Sequencing Kit XL V14 (SQK-LSK114-XL) contents
| Name | Acronym | Vial colour | Number of vials | Fill volume per vial (µl) |
|---|---|---|---|---|
| DNA Control Strand | DCS | Yellow | 1 | 100 |
| Ligation Adapter | LA | Green | 1 | 320 |
| Ligation Buffer | LNB | White | 1 | 1,500 |
| Elution Buffer | EB | White cap, black strip label | 1 | 10,000 |
| Long Fragment Buffer | LFB | White cap, orange strip label | 2 | 20,000 |
| Short Fragment Buffer | SFB | White cap, blue strip label | 2 | 20,000 |
| Library Beads | LIB | Pink | 2 | 1,800 |
| Library Solution | LIS | White cap, pink label | 2 | 1,800 |
| Sequencing Buffer | SB | Red | 3 | 1,700 |
| Flow Cell Flush | FCF | Clear | 4 | 15,500 |
| Flow Cell Tether | FCT | Purple | 1 | 1,600 |
Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.
3. Computer requirements and software
PromethION 24/48 IT requirements
The PromethION device contains all the hardware required to control up to 24 (for the P24 model) or 48 (for the P48 model) sequencing experiments and acquire the data. The device is further enhanced with high performance GPU technology for real-time basecalling. Read more in the PromethION IT Requirements document.
PromethION 2 Solo IT requirements
The PromethION 2 (P2) Solo is a device which directly connects into a GridION Mk1 or a stand-alone computer that meets the miminum specifications for real-time data streaming and analysis. Up to two PromethION flow cells can be can be run and each is independently addressable, meaning experiments can be run concurrently or individually. For information on the computer IT requirements, please see the PromethION 2 Solo IT requirements document.
Software for nanopore sequencing
MinKNOW
The MinKNOW software controls the nanopore sequencing device, collects sequencing data and basecalls in real time. You will be using MinKNOW for every sequencing experiment to sequence, basecall and demultiplex if your samples were barcoded.
For instructions on how to run the MinKNOW software, please refer to the MinKNOW protocol.
EPI2ME (optional)
The EPI2ME cloud-based platform performs further analysis of basecalled data, for example alignment to the Lambda genome, barcoding, or taxonomic classification. You will use the EPI2ME platform only if you would like further analysis of your data post-basecalling.
For instructions on how to create an EPI2ME account and install the EPI2ME Desktop Agent, please refer to the EPI2ME Platform protocol.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| Flongle | 50 |
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
4. DNA repair and end-prep
Material
- 1 µg (o 100-200 fmol) de ADN genómico de alto peso molecular
Consumibles
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- NEBNext FFPE DNA Repair Mix (NEB M6630)
- NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB E7546)
- Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Thermo Scientific™ Abgene™ 96 Well 0.8 ml Polypropylene Deepwell Storage Plate (Thermo Scientific™, cat # AB0859)
- Sarstedt Inc Screw Cap Micro tube 2 ml, PP 1000/case (e.g. FisherScientific, Cat# NC0418367)
- Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs (Cat# 96424-02)
- Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plates (Cat# HSP9601)
- Hamilton PCR ComfortLid (Cat# 814300)
- Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid (Cat# 56694-01)
- Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235905)
- Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235903)
- Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235948)
Instrumental
- Cubeta con hielo
- P1000 pipette and tips
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P10
- Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
- Mezclador vórtex
Consumables and equipment quantities:
| Consumable/equipment | X24 samples | X48 samples | X96 samples |
|---|---|---|---|
| Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter | 96 | 192 | 384 |
| Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter | 201 | 298 | 490 |
| Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter | 32 | 32 | 32 |
| Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid | 2 (1 EtOH & H20) | 2 (1 EtOH & H20) | 2 (1 EtOH & H20) |
| Hamilton PCR ComfortLid | 1 | 1 | 1 |
| Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plate | 1 (1 input sample & 1 end prepped sample) | 1 (1 input sample & 1 end prepped sample) | 1 (1 input sample & 1 end prepped sample) |
| Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs | 1 | 1 | 1 |
| Sarstedt Inc Screw Cap Micro Tube 2 ml | 1 | 2 | 2 |
| Abgene™ 96 Well 0.8 ml Polypropylene Deepwell Storage Plate | 1 | 1 | 1 |
Reagents quantities:
| Reagents | X24 samples | X48 samples | X96 samples |
|---|---|---|---|
| 80% ethanol | 16.5 ml | 28 ml | 51 ml |
| AMPure XP Beads | 3.7 ml | 5.4 ml | 8.9 ml |
| NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180L) regarding the reagents below | 1 tubes | 1 tubes | 1 tubes |
| NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180S) regarding the reagents below | - | 1 tubes | 1 tubes |
| Alternatively: | - | - | - |
| NEBNext FFPE DNA Repair Buffer | 1 tube | 1 tube | 1 tube |
| NEBNext FFPE DNA Repair Mix | 1 tube | 1 tube | 2 tubes |
| Ultra II End-prep Reaction Buffer | 1 tube | 2 tubes | 3 tubes |
| Ultra II End-prep Enzyme Mix | 1 tube | 1 tube | 2 tubes |
Note: Dead volumes are included.
IMPORTANTE
Optional fragmentation and size selection
By default, the protocol contains no DNA fragmentation step, however in some cases it may be advantageous to fragment your sample. For example, when working with lower amounts of input gDNA (100 ng – 500 ng), fragmentation will increase the number of DNA molecules and therefore increase throughput. Instructions are available in the DNA Fragmentation section of Extraction methods.
Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments - instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.
Preparar los reactivos NEBNext FFPE DNA Repair Mix y NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module siguiendo las instrucciones del fabricante y poner en hielo.
Para obtener un rendimiento óptimo, NEB recomienda lo siguiente:
Descongelar todos los reactivos en hielo.
Golpear suavemente los tubos de reactivos con el índice o invertirlos, para asegurarse de que estén bien mezclados.
Nota: No mezclar en vórtex las mezclas FFPE DNA Repair Mix, ni Ultra II End Prep Enzyme Mix.Centrifugar los tubos antes de abrirlos.
Los tampones Ultra II End Prep Buffer y FFPE DNA Repair Buffer pueden tener un poco de precipitado. Dejar que la mezcla alcance la temperatura ambiente y mezclar pipeteando varias veces para romper el precipitado; para solubilizarlo, agitar el tubo en vórtex durante 30 s.
Nota: Es importante mezclar bien los tampones mediante vórtex.El tampón FFPE DNA Repair Buffer puede tener un matiz amarillo; no importa si está así; se puede utilizar.
Prepare each DNA sample per well with nuclease-free water in the input plate.
- Per sample, transfer 1 μg (or 100-200 fmol) of input DNA into a well of the input plate
- Adjust the volume to 48 μl with nuclease-free water
- Mix thoroughly by pipetting
- Spin down briefly in a microfuge
Quantify 1 µl of each eluted sample using a Qubit fluorometer plate reader off deck.
Switch on the Hamilton NGS STAR 96 robot and open 'Hamilton Run Control' on the computer by clicking the icon:
Click 'File' and 'Open' to choose the method to run on the liquid handling robot.
Click 'Process01: DNA repair and end-prep' to start.
Click 'Process02: DNA repair and end-prep clean-up' to stop the automated library preparation and quantify the samples before the adapter ligation step.
IMPORTANTE
It is mandatory for users to have an MPH module installed and we recommend the use of an ODTC module.
Select whether an ODTC module is available to use in the run and select Yes to use the MPH (96 Head) module.
Click 'Browse' to choose the Input File Worklist for the specific number of samples in the run and click 'OK'.
An input file worklist for the number of samples in the run must be generated before the run. Example of an input file worklist:
Source_SampleID | Source_Well | Target_Well |
|---|---|---|
| Sample_01 | A1 | A1 |
| Sample_02 | B1 | B1 |
| Sample_03 | C1 | C1 |
Prepare the End Prep Mastermix with the following reagents according to the Hamilton user interface. Click either 'Yes' or 'No' to continue.
Note: It is user preference whether to print and save the instructions.
Reagent volumes for all sample numbers:
| Reagent | Volume X24 samples | Volume X48 samples | Volume X96 samples |
|---|---|---|---|
| NEBNext FFPE DNA Repair Buffer | 106.6 µl | 213.3 µl | 414.8 µl |
| NEBNext FFPE DNA Repair Mix | 60.9 µl | 121.8 µl | 237 µl |
| Ultra II End-prep Reaction Buffer | 106.6 µl | 213.3 µl | 414.8 µl |
| Ultra II End-prep Enzyme Mix | 91.4 µl | 182.8 µl | 355.6 µl |
| Total | 365.6 µl | 731.2 µl | 1422.2 µl |
Insert the ComfortLid position as displayed on screen. Click 'Ok' to continue.
Insert plates to their corresponding positions. Click 'Ok' to continue.
Load a full deck of 50 µl tips into the positions on screen. Click 'Ok' to continue.
Highlight the 50 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window and click 'Ok' to continue.
Load a full deck of 300 µl tips in the positions on screen. Click 'Ok' to continue.
Highlight the 300 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window and click 'Ok' to continue.
Freshly prepare 80% ethanol in nuclease-free water in a trough.
| Reagents | Volume X24 samples | Volume X48 samples | Volume X96 samples |
|---|---|---|---|
| 80% ethanol | 16.5 ml | 28 ml | 51 ml |
Insert the trough of 80% ethanol in the position on screen and click 'Ok' to continue.
CONSEJO
If the consumables used for troughs are not barcoded, click 'Exclude' on all the selected troughs inserted in the robot and click 'Execute' to continue.
Prepare the AMPure XP beads by vortexing and load the 20 ml trough with the volume required:
| Reagents | Volume X24 samples | Volume X48 samples | Volume X96 samples |
|---|---|---|---|
| Beads | 3.7 ml | 5.4 ml | 8.9 ml |
IMPORTANTE
Ensure the AMPure XP beads are well mixed before use by vortexing.
Insert the trough of AMPure XP beads and nuclease-free water in their positions on screen. Click 'Ok' to continue.
CONSEJO
If the consumables used for troughs are not barcoded, click 'Exclude' on all the selected troughs inserted in the robot and click 'Execute' to continue.
Load 1000 µl tips and insert the input plate of DNA samples into the position on screen. Click 'Ok' to continue.
Highlight the 1000 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window and click 'Ok' to continue.
ATENCIÓN
Ensure the mastermix is well mixed and homogenous before loading the 2 ml Sarstedt tubes. Mixing in the robot is not effective.
Mix and insert the prepared End Prep Mastermix into the positions on screen.
Click 'Ok' to start the DNA repair and end-prep automation process.
Once the automation process has finished, there will be an on screen prompt to unload the plate. Click 'Ok' to continue.
Quantify 1 µl of each eluted sample using a Qubit fluorometer plate reader off deck.
FIN DEL PROCESO
Take forward the repaired and end repaired DNA into the adapter ligation and clean-up step.
5. Adapter ligation and clean-up
Material
- Ligation Adapter (LA) (adaptador de ligación)
- Ligation Buffer (LNB) (tampón de ligación) del kit Ligation Sequencing Kit
- Long Fragment Buffer (LFB) (tampón para fragmentos largos)
- Short Fragment Buffer (SFB)
- Elution Buffer (EB) (tampón de elución) del kit de Oxford Nanopore
Consumibles
- NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056) (Módulo de ligación rápida)
- Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
- Thermo Scientific™ Abgene™ 96 Well 0.8 ml Polypropylene Deepwell Storage Plate (Thermo Scientific™, cat # AB0859)
- Sarstedt Inc Screw Cap Micro tube 2 ml, PP 1000/case (e.g. FisherScientific, Cat# NC0418367)
- Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs (Cat# 96424-02)
- Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plates (Cat# HSP9601)
- Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid (Cat# 56694-01)
- Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235905)
- Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235903)
- Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235948)
Instrumental
- P1000 pipette and tips
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P10
- Vortex mixer
- Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
IMPORTANTE
Aunque la ligasa recomendada de otros fabricantes se suministra con su propio tampón, la eficiencia del adaptador, Ligation Adapter (LA), es mayor cuando se usa el tampón Ligation Buffer (LNB) suministrado en el kit Ligation Sequencing Kit.
Consumables and equipment quantities:
| Consumable/equipment | X24 samples | X48 samples | X96 samples |
|---|---|---|---|
| Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter | 120 | 240 | 384 |
| Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter | 250 | 396 | 686 |
| Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter | 32 | 32 | 32 |
| Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid | 2 (1 L/SFB & 1 EB) | 2 (1 L/SFB & 1 EB) | 2 (1 L/SFB & 1 EB) |
| Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plate | 1 | 1 | 1 |
| Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs | 1 | 1 | 1 |
| Sarstedt Inc Screw Cap Micro Tube 2 ml | 1 | 2 | 3 |
| Abgene™ 96 Well 0.8 ml Polypropylene Deepwell Storage Plate | 1 | 1 | 1 |
Reagents quantities:
| Reagents | X24 samples | X48 samples | X96 samples |
|---|---|---|---|
| Ligation adapter (LA) | 2 tubes | 4 tubes | 8 tubes |
| Ligation Buffer (LNB) | 2 tubes | 4 tubes | 8 tubes |
| Elution Buffer (EB) | 1 bottle | 1 bottle | 1 bottle |
| Long Fragment Buffer (LFB) | 2 bottles | 4 bottles | 8 bottles |
| Short Fragment Buffer (SFB) | 2 bottles | 4 bottles | 8 bottles |
| AMPure XP Beads | 3.1 ml | 4.3 ml | 6.6 ml |
| NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180L) regarding the reagent below: | 1 tubes | 1 tubes | 1 tubes |
| NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180S) regarding the reagent below: | - | 1 tubes | 1 tubes |
| Alternatively: | - | - | - |
| Quick T4 DNA Ligase | 1 tube | 2 tubes | 3 tubes |
Note: Dead volumes are included.
Centrifugar los viales Ligation Adapter (LA) y Quick T4 Ligase y poner en hielo.
Thaw the Ligation Buffer (LNB) at room temperature, spin down and combine all the required tubes. Place on ice immediately after thawing and mixing.
Thaw a bottle of Elution Buffer (EB) at room temperature, mix by vortexing and place on ice.
IMPORTANTE
La fase de lavados tras la ligación de los adaptadores está diseñada para enriquecer los fragmentos de ADN de >3 kb o para purificar todos los fragmentos por igual, según el tampón que se utilice -Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).
Para enriquecer fragmentos de ADN de 3 kb o mayores, utilizar el tampón para fragmentos largos, Long Fragment Buffer (LFB).
Para conservar fragmentos de ADN de todos los tamaños, utilizar el tampón para fragmentos cortos, Short Fragment Buffer (SFB).
To enrich for DNA fragments of 3 kb or longer, thaw the Long Fragment Buffer (LFB) at room temperature, mix by vortexing and combine all the required bottles before storing on ice.
To retain DNA fragments of all sizes, thaw the Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature, mix by vortexing and combine all the required bottles before storing on ice.
Click 'Process03: Adapter ligation' to start.
Click 'Process04: Adapter ligation and clean-up' to stop the automated library preparation and quantify the samples before sequencing.
IMPORTANTE
It is mandatory for the MPH module to be installed on the liquid handling robot. Select 'Yes' to use the MPH (96 Head) module.
Click 'Browse' to choose the Input File Worklist used during DNA repair and end-prep.
Prepare the Adapter Ligation Mastermix with the following reagents according to the Hamilton user interface. Select either 'Yes' or 'No' to continue.
Note: It is user preference whether to print and save the instructions.
Reagent volumes for all sample numbers:
| Reagent | Volume X24 samples | Volume X48 samples | Volume X96 samples |
|---|---|---|---|
| Ligation Adapter (LA) | 140.5 µl | 281 µl | 559.5 µl |
| Ligation Buffer (LNB) | 702.5 µl | 1405 µl | 2797.5 µl |
| Quick T4 DNA Ligase | 281 µl | 562 µl | 1119 µl |
ATENCIÓN
Ensure the mastermix is well mixed and homogenous before loading the 2 ml Sarstedt tubes. Mixing in the robot is not effective.
Insert plates to their corresponding positions on screen. Click 'Ok' to continue.
Load a full deck of 50 µl tips into the positions on screen. Click 'Ok' to continue.
Highlight the 50 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window. Click 'Ok' to continue.
Load a full deck of 300 µl tips in the positions on screen. Click 'Ok' to continue.
Highlight the 300 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window. Click 'Ok' to continue.
Prepare the AMPure XP beads by vortexing and load the 20 ml trough with the volume required:
| Reagents | Volume X24 samples | Volume X48 samples | Volume X96 samples |
|---|---|---|---|
| Beads | 3.1 ml | 4.3 ml | 6.6 ml |
IMPORTANTE
Ensure the AMPure XP beads are well mixed before use by vortexing.
Insert troughs of AMPure XP beads, LFB/SFB and EB in the positions on screen. Click 'Ok' to continue.
| Reagent | Volume X24 samples | Volume X48 samples | Volume X96 samples |
|---|---|---|---|
| Long/Short Fragment Buffer | 2 bottles | 4 bottles | 8 bottles |
| Elution Buffer | 1 bottle | 1 bottle | 1 bottle |
CONSEJO
If the troughs are not barcoded, click 'Exclude' on all the selected troughs inserted in the robot and click 'Execute' to continue.
Insert 1000 µl tips and the Clean End Prep Plate to the correct positions on screen. Click 'Ok' to continue.
Highlight the 1000 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window. Click 'Ok' to continue.
Insert the prepared Adapter Ligation Mastermix into the positions on screen. Click 'Ok' to continue.
ATENCIÓN
Ensure the mastermix is well mixed and homogenous before loading the 2 ml Sarstedt tubes. Mixing in the robot is not effective.
Once the automation process has finished, there will be an on screen prompt to unload the plate. Click 'Ok' to continue.
Quantify 1 µl of each eluted sample using a Qubit fluorometer plate reader off deck.
FIN DEL PROCESO
Seal the plate once the library is prepared and store on ice until ready to load onto the flow cell.
We do not recommend running the liquid handling robot overnight as the plate must be sealed and stored on ice as soon as library preparation is finished.
Depending on your DNA library fragment size, prepare your final library in 32 µl of Elution Buffer (EB).
| Fragment library length | Flow cell loading amount |
|---|---|
| Very short (<1 kb) | 100 fmol |
| Short (1-10 kb) | 35–50 fmol |
| Long (>10 kb) | 300 ng |
Note: If the library yields are below the input recommendations, load the entire library.
If required, we recommend using a mass to mol calculator such as the NEB calculator.
IMPORTANTE
Recomendamos cargar una de las siguientes cantidades de biblioteca, en la celda de flujo R10.4.1.
Para obtener un rendimiento elevado de datos simplex, tome 35-50 fmol de biblioteca. De este modo se garantiza una elevada ocupación de poros >95 %. Aquí puede consultar cómo calcular la ocupación de poros.
Para obtener datos duplex, cargue 10-20 fmol de biblioteca. Cargar más de 20 fmol de ADN puede reducir la velocidad de recogida de lecturas duplex.
CONSEJO
Library storage recommendations
We recommend storing libraries at 4°C for short term storage or repeated use, for example, re-loading flow cells between washes. For single use and long term storage of more than 3 months, we recommend storing libraries at -80°C. For further information, please refer to the Library Stability Know-How document.
MEDIDA OPCIONAL
If quantities allow, the library may be diluted in Elution Buffer (EB) for splitting across multiple flow cells.
Depending on how many flow cells the library will be split across, more Elution Buffer (EB) than what is supplied in the kit will be required.
6. Priming and loading the PromethION flow cell
Material
- Flow Cell Flush (FCF)
- Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
- Library Solution (LIS)
- Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
- Sequencing Buffer (SB)
Consumibles
- Celda de flujo PromethION
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- PromethION 2 Solo device
- Dispositivo PromethION 24/48
- PromethION Flow Cell Light Shield
- P1000 pipette and tips
- P200 pipette and tips
- Pipeta y puntas P20
IMPORTANTE
This kit is only compatible with R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M).
Uso de Library Solution (LIS)
En la mayoría de experimentos de secuenciación, recomendamos usar Library Beads (LIB) para cargar la biblioteca en la celda de flujo. Nótese, si previamente se ha usado agua para cargar la biblioteca, se deberá usar Library Solution (LIS) en su lugar. Nota: Algunos clientes han notado que las bibliotecas viscosas pueden cargarse con mayor facilidad cuando no se usan Library Beads (LIB).
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
Prepare the flow cell priming mix in a suitable tube for the number of flow cells to flush. Once combined, mix well by briefly vortexing.
| Reagent | Volume per flow cell |
|---|---|
| Flow Cell Tether (FCT) | 30 µl |
| Flow Cell Flush (FCF) | 1170 µl |
| Total volume | 1,200 µl |
IMPORTANTE
Una vez sacadas de la nevera, esperar 20 minutos antes de insertar las celdas de flujo en el dispositivo y así darles tiempo a que estén a temperatura ambiente. En entornos húmedos se puede formar condensación. Inspeccione las clavijas doradas del conector, situadas en la parte superior e inferior de la celda de flujo, en busca de condensación y si la hubiera, límpiela con una toallita sin pelusa. Procure que la almohadilla térmica (color gris oscuro) esté enganchada en la parte posterior.
For PromethION 2 Solo, load the flow cell(s) as follows:
Place the flow cell flat on the metal plate.
Slide the flow cell into the docking port until the gold pins or green board cannot be seen.
For the PromethION 24/48, load the flow cell(s) into the docking ports:
- Line up the flow cell with the connector horizontally and vertically before smoothly inserting into position.
- Press down firmly onto the flow cell and ensure the latch engages and clicks into place.
IMPORTANTE
Insertion of the flow cells at the wrong angle can cause damage to the pins on the PromethION and affect your sequencing results. If you find the pins on a PromethION position are damaged, please contact support@nanoporetech.com for assistance.
Slide the inlet port cover clockwise to open.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
After opening the inlet port, draw back a small volume to remove any air bubbles:
- Set a P1000 pipette tip to 200 µl.
- Insert the tip into the inlet port.
- Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, or until you see a small volume of buffer entering the pipette tip.
Load 500 µl of the priming mix into the flow cell via the inlet port, avoiding the introduction of air bubbles. Wait five minutes. During this time, prepare the library for loading using the next steps in the protocol.
Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).
IMPORTANTE
Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.
En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.
In a new 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare the library for loading as follows:
| Reagent | Volume per flow cell |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 100 µl |
| Library Beads (LIB) thoroughly mixed before use, or Library Solution (LIS) | 68 µl |
| DNA library | 32 µl |
| Total | 200 µl |
Note: Library loading volume has been increased to improve array coverage.
Complete the flow cell priming by slowly loading 500 µl of the priming mix into the inlet port.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Load 200 µl of library into the inlet port using a P1000 pipette.
Close the valve to seal the inlet port.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
If the light shield has been removed from the flow cell, install the light shield as follows:
- Align the inlet port cut out of the light shield with the inlet port cover on the flow cell. The leading edge of the light shield should sit above the flow cell ID.
- Firmly press the light shield around the inlet port cover. The inlet port clip will click into place underneath the inlet port cover.
FIN DEL PROCESO
Close the PromethION lid when ready to start a sequencing run on MinKNOW.
Wait a minimum of 10 minutes after loading the flow cells onto the PromethION before initiating any experiments. This will help to increase the sequencing output.
7. Data acquisition and basecalling
How to start sequencing
Once you have loaded your flow cell, the sequencing run can be started on MinKNOW, our sequencing software that controls the device, data acquisition and real-time basecalling. For more detailed information on setting up and using MinKNOW, please see the MinKNOW protocol.
MinKNOW can be used and set up to sequence in multiple ways:
- On a computer either direcly or remotely connected to a sequencing device.
- Directly on a GridION, MinION Mk1C or PromethION 24/48 sequencing device.
For more information on using MinKNOW on a sequencing device, please see the device user manuals:
To start a sequencing run on MinKNOW:
1. Navigate to the start page and click Start sequencing.
2. Fill in your experiment details, such as name and flow cell position and sample ID.
3. Select the sequencing kit used in the library preparation on the Kit page.
4. Configure the sequencing and output parameters for your sequencing run or keep to the default settings on the Run configuration tab.
Note: If basecalling was turned off when a sequencing run was set up, basecalling can be performed post-run on MinKNOW. For more information, please see the MinKNOW protocol.
5. Click Start to initiate the sequencing run.
Identificación de bases duplex
La química del kit 14 ha mejorado la identificación de bases duplex, la cual requiere, tras realizar la identificación de bases simplex en MinKNOW, volver a identificar las bases en el programa Dorado con herramientas de identificación de bases duplex.
Para obtener información detallada sobre la configuración de un experimento de secuenciación, tanto para la identificación de bases simplex, como para la duplex, consultar la hoja informativa Kit 14 sequencing and duplex basecalling.
Nota: Mientras Dorado se esté ejecutando, recomendamos parar otros procesos de identificación de bases, para potenciar la memoria disponible en el programa. Esta acción se puede detener y reiniciar, cuando Dorado haya terminado, a través de la interfaz gráfica de MinKNOW.
Análisis de datos
Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.
Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y de análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.
En la sección Análisis posterior, se describen otras opciones para analizar los datos.
8. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
CONSEJO
Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.
Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.
IMPORTANTE
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
9. Análisis
Análisis posterior a la identificación de bases
Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de identificación de bases:
1. Procesos de trabajo en EPI2ME
Para realizar un análisis de datos exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y procesos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, situados en la sección EPI2ME Labs de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los procesos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
2. Herramientas de análisis
El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.
3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad
Si en ninguno de los recursos anteriores se proporciona un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.
10. Issues during automation of library preparation
Please contact your automation vendor FAS and/or Nanopore FAS if you have any issues.
11. Issues during the sequencing run
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales. |
Pore occupancy below 40%
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Pore occupancy <40% | Not enough library was loaded on the flow cell | Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol" |
| Pore occupancy close to 0 | The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA | Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the sequencing kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents. |
| Pore occupancy close to 0 | The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation | Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters. |
| Pore occupancy close to 0 | No tether on the flow cell | Tethers are adding during flow cell priming (FLT/FCT tube). Make sure FLT/FCT was added to FB/FCF before priming. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.  En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)  Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles. | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Reducción de la velocidad de secuenciación y del índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Reducción de la velocidad de secuenciación y el índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación | En la química del kit 9 (p. ej., SQK-LSK109), cuando la celda de flujo está sobrecargada con la biblioteca se observa un consumo rápido de combustible (consulte el protocolo correspondiente a su biblioteca de ADN para ver las recomendaciones) | Añadir más combustible a la celda de flujo, siguiendo las instrucciones en el protocolo de MinKNOW. En futuros experimentos, cargar cantidades menores de biblioteca en la celda de flujo. |
Fluctuación de la temperatura
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ. |
Guppy – no input .fast5 was found or basecalled
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| No input .fast5 was found or basecalled | input_path did not point to the .fast5 file location | The --input_path has to be followed by the full file path to the .fast5 files to be basecalled, and the location has to be accessible either locally or remotely through SSH. |
| No input .fast5 was found or basecalled | The .fast5 files were in a subfolder at the input_path location | To allow Guppy to look into subfolders, add the --recursive flag to the command |
Guppy – no Pass or Fail folders were generated after basecalling
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| No Pass or Fail folders were generated after basecalling | The --qscore_filtering flag was not included in the command | The --qscore_filtering flag enables filtering of reads into Pass and Fail folders inside the output folder, based on their strand q-score. When performing live basecalling in MinKNOW, a q-score of 7 (corresponding to a basecall accuracy of ~80%) is used to separate reads into Pass and Fail folders. |
Guppy – unusually slow processing on a GPU computer
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Unusually slow processing on a GPU computer | The --device flag wasn't included in the command | The --device flag specifies a GPU device to use for accelerate basecalling. If not included in the command, GPU will not be used. GPUs are counted from zero. An example is --device cuda:0 cuda:1, when 2 GPUs are specified to use by the Guppy command. |
Last updated: 10/4/2023
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