Ligation sequencing DNA V14 - automated Hamilton NGS STAR 96 (SQK-LSK114-XL)

Oxford Nanopore Technologies
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PromethION: Protocol

Ligation sequencing DNA V14 - automated Hamilton NGS STAR 96 (SQK-LSK114-XL) V GDA_9167_v114_revJ_24Aug2022

  • This protocol uses genomic DNA
  • Automation of library preparation
  • Increased reproducibility and speed
  • Reduces human error
  • High sequencing output
  • Library preparation time ~1.5 hours hands-on-time and ~3-4 hours automation time
  • Fragmentation is optional
  • No PCR required
  • Multiple samples can be prepared simultaneously
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

抂芁

  • This protocol uses genomic DNA
  • Automation of library preparation
  • Increased reproducibility and speed
  • Reduces human error
  • High sequencing output
  • Library preparation time ~1.5 hours hands-on-time and ~3-4 hours automation time
  • Fragmentation is optional
  • No PCR required
  • Multiple samples can be prepared simultaneously
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: GDA_9167_v114_revJ_24Aug2022

1. Overview of the protocol

Ligation Sequencing Kit XL V14 features

This kit is recommended for users who:

  • Would like to process multiple samples simultaneously, either with a multichannel pipette or a liquid-handling robot
  • Would like to achieve raw read sequencing modal accuracy of Q20+ (99%) or above
  • Require control over read length
  • Would like to utilise upstream processes such as size selection, whole genome amplification, or enrichment for long reads
重芁

Optional fragmentation and size selection

By default, the protocol contains no DNA fragmentation step, however in some cases it may be advantageous to fragment your sample. For example, when working with lower amounts of input gDNA (100 ng – 500 ng), fragmentation will increase the number of DNA molecules and therefore increase throughput. Instructions are available in the DNA Fragmentation section of Extraction methods.

Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments - instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.

重芁

Kit 14 sequencing and duplex basecalling info sheet

The Kit 14 chemistry is a new development from Oxford Nanopore Technologies with improved duplex basecalling, which requires a different set of tools. For more information, please see the Kit 14 sequencing and duplex basecalling info sheet. We strongly recommend that you read it before proceeding with Kit 14 chemistry sequencing experiments and basecalling duplex data.

Introduction to the automated Ligation Sequencing protocol for DNA

This protocol describes how to carry out sequencing of a DNA sample using the Ligation Sequencing Kit XL (SQK-LSK114-XL).

We have developed this automated protocol on the Hamilton NGS STAR 96 liquid handling robot. The majority of the process is automated with minimal hands-on time which is required for sample quantification and deck re-loading.

It is highly recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.

To efficiently load multiple PromethION Flow Cells, we recommend using the Loading multiple PromethION Flow Cells protocol as a guideline.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment You will need to:

  • Extract your DNA and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment, primed liquid-handling robot and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cells to ensure they have enough pores for a good sequencing run

__Library preparation__ You will need to:
  • Repair the DNA and prepare the DNA ends for adapter attachment
  • Attach sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
  • Prime the flow cell and load your DNA library into the flow cell

2020 10 09 LSK109 hamilton workflow v1 DS

Sequencing and analysis You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
重芁

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

  • Ligation Sequencing Kit XL V14 (SQK-LSK114-XL)
  • R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M)
  • Flow Cell Wash Kit XL (EXP-WSH004-XL)

2. Equipment and consumables

材料
  • 1 µ gたたは100  200 fmol高分子ゲノムDNA
  • たたは、DNA断片化を行う堎合は100 ng以䞊の高分子ゲノムDNA
  • Ligation Sequencing Kit XL V14 (SQK-LSK114-XL)
消耗品
  • NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L). Alternatively, you can use the NEBNext® products below:
  • NEBNext FFPE Repair Mix (NEB, M6630)
  • NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™ cat # A63881)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • nuclease-free waterで調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235948)
  • Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235903)
  • Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235905)
  • Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid (Cat# 56694-01)
  • Hamilton PCR ComfortLid (Cat# 814300)
  • Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plates (Cat# HSP9601)
  • Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs (Cat# 96424-02)
  • Sarstedt Inc Screw Cap Micro tube 2 ml, PP 1000/case (e.g. FisherScientific, Cat# NC0418367)
  • Thermo Scientific™ Abgene™ 96 Well 0.8 ml Polypropylene Deepwell Storage Plate (Thermo Scientific™, cat # AB0859)
装眮
  • アむスバケツ氷入り
  • ボルテックスミキサヌ
  • Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
  • Hamilton NGS STAR 96 (NGS STAR with Multi-Probe Head 96)
  • Hamilton On-Deck Thermal Cycler (ODTC)
オプション装眮
  • Agilent Bioanalyzer (or equivalent)
  • Qubit fluorometer plate reader (or equivalent for QC check)

DNAサンプルの長さに応じお、サンプル䜿甚量を調敎しおください

DNAラむブラリヌ断片長 サンプルDNA量
非垞に短い (<1 kb) 200 fmol
短い (1-10 kb) 100–200 fmol
長い(>10 kb) 1 µg

ラむゲヌションシヌク゚ンスプロトコルのサンプル䜿甚量ずフロヌセルぞのロヌド量の詳现に぀いおは、our know-how documentをご芧ください。

Input DNA

How to QC your input DNA

It is important to use a plate reader to ensure the input DNA meets the quantity and quality requirements. Using too little or too much DNA, or DNA of poor quality (e.g. highly fragmented or containing RNA or chemical contaminants) can affect your library preparation.

For instructions on how to perform quality control of your DNA sample, please read the Input DNA/RNA QC protocol.

Input file worklist

A worklist input Excel file is required prior to running the protocol on the Hamilton NGS STAR 96. These contain information regarding the appropriate number of samples and well identifiers.

Example:

Source_SampleID Source_Well Target_Well
Sample_01 A1 A1
Sample_02 B1 B2
Sample_03 C1 C1

Hamilton NGS STAR 96

This method has been tested and validated using the Hamilton NGS STAR 96 (with 8 channels and MPH96) including an on deck thermal cycler (ODTC). An option to not use the ODTC is available in the method. The protocol may require some fine tuning for the NGS STAR 96 setup and the temperature/humidity of the customer laboratory.

Please contact your Hamilton representative for further details.

Deck layout Ligation XL deck layout

  • ODTC: On-Deck Thermal Cycler Module
  • MIDI plates: Abgene™ 96 Well 0.8mL Polypropylene Deepwell Storage Plate
  • Troughs: Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs
  • HSP plates: Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plates
  • Hamilton ComfortLid: Hamilton PCR ComfortLid

NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing

For customers new to nanopore sequencing, we recommend buying the NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (catalogue number E7180S or E7180L), which contains all the NEB reagents needed for use with the Ligation Sequencing Kit.

Please note, for our amplicon protocols, NEBNext FFPE DNA Repair Mix and NEBNext FFPE DNA Repair Buffer are not required.

サヌドパヌティヌ詊薬

このプロトコヌルで䜿甚されおいるすべおのサヌドパヌティヌ詊薬は、圓瀟が怜蚌し、䜿甚を掚奚しおいるものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以倖の詊薬を甚いたテストは行っおいたせん。

すべおのサヌドパヌティ補詊薬に぀いおは、補造元の指瀺に埓っお䜿甚の準備をするこずをお勧めしたす。

重芁

ラむゲヌションアダプタヌLAのラむゲヌション効率を高めるため、NEBNext Quick Ligation Module に付属しおいるリガヌれバッファヌではなく、Ligation Sequencing Kit V14 に付属のラむゲヌションバッファヌLNBのご䜿甚を匷くお勧めしたす。

重芁

本キットおよびプロトコヌルに含たれるラむゲヌションアダプタヌLAは、他のシヌク゚ンシングアダプタヌずの互換性はありたせん。

Consumables and reagent quantities required:

Consumables X24 samples X48 samples X96 samples
Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter 216 432 768
Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter 451 694 1176
Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter 64 64 64
Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid 3 3 3
Hamilton PCR ComfortLid 1 1 1
Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plate 2 2 2
Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs 2 2 2
Sarstedt Inc Screw Cap Micro Tube 2ml 2 4 5
Abgene™ 96 Well 0.8mL Polypropylene Deepwell Storage Plate 2 2 2
Reagents/kits X24 samples X48 samples X96 samples
80% ethanol 16.5 ml 28 ml 51 ml
AMPure XP Beads 6.8 ml 9.7 ml 15.5 ml
Ligation Sequencing Kit XL V14 (SQK-LSK114-XL) 1 kit 1 kit 2 kits
NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180L) 1 kits 1 kits 1 kits
NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180S) - 1 kits 1 kits
Alternatively: - - -
NEBNext FFPE DNA Repair Mix (Cat# M6630L) 1 kit 1 kit 2 kits
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (Cat# E7546L) 1 kit 2 kits 3 kits
NEBNext Quick Ligation Module (Cat# E6056L) 1 kit 2 kits 3 kits

Note: These are the number of kits required for one run through for the selected number of samples.

Ligation Sequencing Kit XL V14 (SQK-LSK114-XL) contents

SQK-LSK114-XL (1)

Name Acronym Vial colour Number of vials Fill volume per vial (µl)
DNA Control Strand DCS Yellow 1 100
Ligation Adapter LA Green 1 320
Ligation Buffer LNB White 1 1,500
Elution Buffer EB White cap, black strip label 1 10,000
Long Fragment Buffer LFB White cap, orange strip label 2 20,000
Short Fragment Buffer SFB White cap, blue strip label 2 20,000
Library Beads LIB Pink 2 1,800
Library Solution LIS White cap, pink label 2 1,800
Sequencing Buffer SB Red 3 1,700
Flow Cell Flush FCF Clear 4 15,500
Flow Cell Tether FCT Purple 1 1,600

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.

3. Computer requirements and software

PromethION 24/48 IT requirements

The PromethION device contains all the hardware required to control up to 24 (for the P24 model) or 48 (for the P48 model) sequencing experiments and acquire the data. The device is further enhanced with high performance GPU technology for real-time basecalling. Read more in the PromethION IT requirements document.

PromethION 2 Solo IT requirements

The PromethION 2 (P2) Solo is a device which directly connects into a GridION Mk1 or a stand-alone computer that meets the miminum specifications for real-time data streaming and analysis. Up to two PromethION flow cells can be can be run and each is independently addressable, meaning experiments can be run concurrently or individually. For information on the computer IT requirements, please see the PromethION 2 Solo IT requirements document.

Software for nanopore sequencing

MinKNOW

The MinKNOW software controls the nanopore sequencing device, collects sequencing data and basecalls in real time. You will be using MinKNOW for every sequencing experiment to sequence, basecall and demultiplex if your samples were barcoded.

For instructions on how to run the MinKNOW software, please refer to the MinKNOW protocol.

EPI2ME (optional)

The EPI2ME cloud-based platform performs further analysis of basecalled data, for example alignment to the Lambda genome, barcoding, or taxonomic classification. You will use the EPI2ME platform only if you would like further analysis of your data post-basecalling.

For instructions on how to create an EPI2ME account and install the EPI2ME Desktop Agent, please refer to this link.

フロヌセルのチェックをしおください

シヌク゚ンシング実隓を開始する前に、フロヌセルのポアの数を確認するこずを匷くお勧めしたす。このフロヌセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの堎合は代理店ぞの到着から週間以内に行っおください。たたはFlongle Flow Cellの堎合は代理店ぞの到着から4週間以内に行う必芁がありたす。Oxford Nanopore Technologiesは、フロヌセルチェックの実斜から2日以内に結果が報告され、掚奚される保管方法に埓っおいた堎合に、以䞋の衚に蚘茉されおいるナノポアの有効数に満たさない堎合には、フロヌセルを亀換したす。 フロヌセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指瀺に埓っおください。

Flow cell 保蚌する最小有効ポア数以䞋の数未満のフロヌセルが亀換察象ずなりたす
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000

4. DNA repair and end-prep

材料
  • 1 µ gたたは100  200 fmol高分子ゲノムDNA
消耗品
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • NEBNext FFPE DNA Repair Mix (NEB, M6630)
  • NEBNext® Ultra II End Repair / dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • nuclease-free waterで調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • Thermo Scientific™ Abgene™ 96 Well 0.8 ml Polypropylene Deepwell Storage Plate (Thermo Scientific™, cat # AB0859)
  • Sarstedt Inc Screw Cap Micro tube 2 ml, PP 1000/case (e.g. FisherScientific, Cat# NC0418367)
  • Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs (Cat# 96424-02)
  • Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plates (Cat# HSP9601)
  • Hamilton PCR ComfortLid (Cat# 814300)
  • Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid (Cat# 56694-01)
  • Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235905)
  • Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235903)
  • Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235948)
装眮
  • アむスバケツ氷入り
  • P1000 pipette and tips
  • P200 ピペットずチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
  • Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
  • ボルテックスミキサヌ

Consumables and equipment quantities:

Consumable/equipment X24 samples X48 samples X96 samples
Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter 96 192 384
Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter 201 298 490
Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter 32 32 32
Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid 2 (1 EtOH & H20) 2 (1 EtOH & H20) 2 (1 EtOH & H20)
Hamilton PCR ComfortLid 1 1 1
Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plate 1 (1 input sample & 1 end prepped sample) 1 (1 input sample & 1 end prepped sample) 1 (1 input sample & 1 end prepped sample)
Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs 1 1 1
Sarstedt Inc Screw Cap Micro Tube 2 ml 1 2 2
Abgene™ 96 Well 0.8 ml Polypropylene Deepwell Storage Plate 1 1 1

Reagents quantities:

Reagents X24 samples X48 samples X96 samples
80% ethanol 16.5 ml 28 ml 51 ml
AMPure XP Beads 3.7 ml 5.4 ml 8.9 ml
NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180L)
regarding the reagents below		 1 tubes 1 tubes 1 tubes
NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180S)
regarding the reagents below		 - 1 tubes 1 tubes
Alternatively: - - -
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer 1 tube 1 tube 1 tube
NEBNext FFPE DNA Repair Mix 1 tube 1 tube 2 tubes
Ultra II End-prep Reaction Buffer 1 tube 2 tubes 3 tubes
Ultra II End-prep Enzyme Mix 1 tube 1 tube 2 tubes

Note: Dead volumes are included.

重芁

Optional fragmentation and size selection

By default, the protocol contains no DNA fragmentation step, however in some cases it may be advantageous to fragment your sample. For example, when working with lower amounts of input gDNA (100 ng – 500 ng), fragmentation will increase the number of DNA molecules and therefore increase throughput. Instructions are available in the DNA Fragmentation section of Extraction methods.

Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments - instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.

Prepare the NEBNext FFPE DNA Repair Mix and NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer’s instructions, and place on ice.

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Flick and/or invert the reagent tubes to ensure they are well mixed.
    Note: Do not vortex the FFPE DNA Repair Mix or Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The Ultra II End Prep Buffer and FFPE DNA Repair Buffer may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for 30 seconds to solubilise any precipitate.
    Note: It is important the buffers are mixed well by vortexing.

  5. The FFPE DNA Repair Buffer may have a yellow tinge and is fine to use if yellow.

Prepare each DNA sample per well with nuclease-free water in the input plate.

  • Per sample, transfer 1 ÎŒg (or 100-200 fmol) of input DNA into a well of the input plate
  • Adjust the volume to 48 ÎŒl with nuclease-free water
  • Mix thoroughly by pipetting
  • Spin down briefly in a microfuge

Quantify 1 µl of each eluted sample using a Qubit fluorometer plate reader off deck.

Switch on the Hamilton NGS STAR 96 robot and open 'Hamilton Run Control' on the computer by clicking the icon:

Hamilton icon

Click 'File' and 'Open' to choose the method to run on the liquid handling robot.

Click 'Process01: DNA repair and end-prep' to start.

Capture1

Click 'Process02: DNA repair and end-prep clean-up' to stop the automated library preparation and quantify the samples before the adapter ligation step.

Capture2

重芁

It is mandatory for users to have an MPH module installed and we recommend the use of an ODTC module.

Select whether an ODTC module is available to use in the run and select Yes to use the MPH (96 Head) module.

Capture3

Click 'Browse' to choose the Input File Worklist for the specific number of samples in the run and click 'OK'.

Capture4

An input file worklist for the number of samples in the run must be generated before the run. Example of an input file worklist:

Source_SampleID Source_Well Target_Well
Sample_01 A1 A1
Sample_02 B1 B1
Sample_03 C1 C1

Prepare the End Prep Mastermix with the following reagents according to the Hamilton user interface. Click either 'Yes' or 'No' to continue.

Note: It is user preference whether to print and save the instructions.

Reagent volumes for all sample numbers:

Reagent Volume X24 samples Volume X48 samples Volume X96 samples
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer 106.6 µl 213.3 µl 414.8 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix 60.9 µl 121.8 µl 237 µl
Ultra II End-prep Reaction Buffer 106.6 µl 213.3 µl 414.8 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 91.4 µl 182.8 µl 355.6 µl
Total 365.6 µl 731.2 µl 1422.2 µl

Capture5

Insert the ComfortLid position as displayed on screen. Click 'Ok' to continue.

Capture6

Insert plates to their corresponding positions. Click 'Ok' to continue.

Capture7

Load a full deck of 50 µl tips into the positions on screen. Click 'Ok' to continue.

Capture8

Highlight the 50 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window and click 'Ok' to continue.

Capture9

Load a full deck of 300 µl tips in the positions on screen. Click 'Ok' to continue.

Capture10

Highlight the 300 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window and click 'Ok' to continue.

Capture11

Freshly prepare 80% ethanol in nuclease-free water in a trough.

Reagents Volume X24 samples Volume X48 samples Volume X96 samples
80% ethanol 16.5 ml 28 ml 51 ml

Insert the trough of 80% ethanol in the position on screen and click 'Ok' to continue.

Capture12

ヒント

If the consumables used for troughs are not barcoded, click 'Exclude' on all the selected troughs inserted in the robot and click 'Execute' to continue.

Capture13

Prepare the AMPure XP beads by vortexing and load the 20 ml trough with the volume required:

Reagents Volume X24 samples Volume X48 samples Volume X96 samples
Beads 3.7 ml 5.4 ml 8.9 ml
重芁

Ensure the AMPure XP beads are well mixed before use by vortexing.

Insert the trough of AMPure XP beads and nuclease-free water in their positions on screen. Click 'Ok' to continue.

Capture14

ヒント

If the consumables used for troughs are not barcoded, click 'Exclude' on all the selected troughs inserted in the robot and click 'Execute' to continue.

Capture13

Load 1000 µl tips and insert the input plate of DNA samples into the position on screen. Click 'Ok' to continue.

Capture16

Highlight the 1000 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window and click 'Ok' to continue.

Capture17

泚意

Ensure the mastermix is well mixed and homogenous before loading the 2 ml Sarstedt tubes. Mixing in the robot is not effective.

Mix and insert the prepared End Prep Mastermix into the positions on screen.

Capture18

Click 'Ok' to start the DNA repair and end-prep automation process.

Once the automation process has finished, there will be an on screen prompt to unload the plate. Click 'Ok' to continue.

DNA repair and end prep

Quantify 1 µl of each eluted sample using a Qubit fluorometer plate reader off deck.

最終ステップ

Take forward the repaired and end repaired DNA into the adapter ligation and clean-up step.

5. Adapter ligation and clean-up

材料
  • Ligation Adapter (LA)
  • Ligation Buffer (LNB)
  • Long Fragment Buffer (LFB)
  • Short Fragment Buffer (SFB)
  • Elution Buffer (EB)
消耗品
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • Thermo Scientific™ Abgene™ 96 Well 0.8 ml Polypropylene Deepwell Storage Plate (Thermo Scientific™, cat # AB0859)
  • Sarstedt Inc Screw Cap Micro tube 2 ml, PP 1000/case (e.g. FisherScientific, Cat# NC0418367)
  • Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs (Cat# 96424-02)
  • Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plates (Cat# HSP9601)
  • Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid (Cat# 56694-01)
  • Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235905)
  • Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235903)
  • Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter (Cat# 235948)
装眮
  • P1000 pipette and tips
  • P200 ピペットずチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
  • Vortex mixer
  • Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
重芁

掚奚の他瀟補リガヌれligaseには専甚のバッファヌが付属しおいたすが、Ligation Sequencing Kitに付属のLigation Buffer (LNB)を䜿甚した方が、Ligation Adapter (LA)のラむゲヌション効率が高くなりたす。

Consumables and equipment quantities:

Consumable/equipment X24 samples X48 samples X96 samples
Hamilton 50 µl CO-RE tips with filter 120 240 384
Hamilton 300 µl CO-RE tips with filter 250 396 686
Hamilton 1000 µl CO-RE tips with filter 32 32 32
Hamilton 60 ml Reagent Reservoir, Self-Standing with Lid 2 (1 L/SFB & 1 EB) 2 (1 L/SFB & 1 EB) 2 (1 L/SFB & 1 EB)
Bio-Rad Hard-Shell® 96-Well PCR Plate 1 1 1
Hamilton 20 ml Reagent Reservoirs 1 1 1
Sarstedt Inc Screw Cap Micro Tube 2 ml 1 2 3
Abgene™ 96 Well 0.8 ml Polypropylene Deepwell Storage Plate 1 1 1

Reagents quantities:

Reagents X24 samples X48 samples X96 samples
Ligation adapter (LA) 2 tubes 4 tubes 8 tubes
Ligation Buffer (LNB) 2 tubes 4 tubes 8 tubes
Elution Buffer (EB) 1 bottle 1 bottle 1 bottle
Long Fragment Buffer (LFB) 2 bottles 4 bottles 8 bottles
Short Fragment Buffer (SFB) 2 bottles 4 bottles 8 bottles
AMPure XP Beads 3.1 ml 4.3 ml 6.6 ml
NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180L)
regarding the reagent below:		 1 tubes 1 tubes 1 tubes
NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (Cat# E7180S)
regarding the reagent below:		 - 1 tubes 1 tubes
Alternatively: - - -
Quick T4 DNA Ligase 1 tube 2 tubes 3 tubes

Note: Dead volumes are included.

Spin down the Ligation Adapter (LA) and Quick T4 Ligase, and place on ice.

Thaw the Ligation Buffer (LNB) at room temperature, spin down and combine all the required tubes. Place on ice immediately after thawing and mixing.

Thaw a bottle of Elution Buffer (EB) at room temperature, mix by vortexing and place on ice.

重芁

䜿甚するりォッシュバッファヌLFBたたはSFBに応じお、アダプタヌラむゲヌション埌のクリヌンアップステップは、3 kb以䞊のDNAの断片を濃瞮するか、党おの断片長を均等に粟補するように蚭蚈されおいたす。

  • 3kb以䞊のDNA断片を濃瞮するには、Long Fragment Buffer (LFB)を䜿甚しおください。
  • 䞀方であらゆるサむズの DNA 断片を保持するには、Short Fragment Buffer (SFB) を䜿甚しおください。

To enrich for DNA fragments of 3 kb or longer, thaw the Long Fragment Buffer (LFB) at room temperature, mix by vortexing and combine all the required bottles before storing on ice.

To retain DNA fragments of all sizes, thaw the Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature, mix by vortexing and combine all the required bottles before storing on ice.

Click 'Process03: Adapter ligation' to start.

Capture19

Click 'Process04: Adapter ligation and clean-up' to stop the automated library preparation and quantify the samples before sequencing.

Capture20

重芁

It is mandatory for the MPH module to be installed on the liquid handling robot. Select 'Yes' to use the MPH (96 Head) module.

Capture21

Click 'Browse' to choose the Input File Worklist used during DNA repair and end-prep.

Capture4

Prepare the Adapter Ligation Mastermix with the following reagents according to the Hamilton user interface. Select either 'Yes' or 'No' to continue.

Note: It is user preference whether to print and save the instructions.

Reagent volumes for all sample numbers:

Reagent Volume X24 samples Volume X48 samples Volume X96 samples
Ligation Adapter (LA) 140.5 µl 281 µl 559.5 µl
Ligation Buffer (LNB) 702.5 µl 1405 µl 2797.5 µl
Quick T4 DNA Ligase 281 µl 562 µl 1119 µl

LSK114XL Hamilton Adapter Ligation mastermix

泚意

Ensure the mastermix is well mixed and homogenous before loading the 2 ml Sarstedt tubes. Mixing in the robot is not effective.

Insert plates to their corresponding positions on screen. Click 'Ok' to continue.

Capture24

Load a full deck of 50 µl tips into the positions on screen. Click 'Ok' to continue.

Capture25

Highlight the 50 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window. Click 'Ok' to continue.

Capture26

Load a full deck of 300 µl tips in the positions on screen. Click 'Ok' to continue.

Capture27

Highlight the 300 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window. Click 'Ok' to continue.

Capture28

Prepare the AMPure XP beads by vortexing and load the 20 ml trough with the volume required:

Reagents Volume X24 samples Volume X48 samples Volume X96 samples
Beads 3.1 ml 4.3 ml 6.6 ml
重芁

Ensure the AMPure XP beads are well mixed before use by vortexing.

Insert troughs of AMPure XP beads, LFB/SFB and EB in the positions on screen. Click 'Ok' to continue.

Reagent Volume X24 samples Volume X48 samples Volume X96 samples
Long/Short Fragment Buffer 2 bottles 4 bottles 8 bottles
Elution Buffer 1 bottle 1 bottle 1 bottle

Capture29

ヒント

If the troughs are not barcoded, click 'Exclude' on all the selected troughs inserted in the robot and click 'Execute' to continue.

Capture13

Insert 1000 µl tips and the Clean End Prep Plate to the correct positions on screen. Click 'Ok' to continue.

Capture31

Highlight the 1000 µl tips available to use on the 'Edit Tip Count' window. Click 'Ok' to continue.

Capture32

Insert the prepared Adapter Ligation Mastermix into the positions on screen. Click 'Ok' to continue.

Capture33

泚意

Ensure the mastermix is well mixed and homogenous before loading the 2 ml Sarstedt tubes. Mixing in the robot is not effective.

Once the automation process has finished, there will be an on screen prompt to unload the plate. Click 'Ok' to continue.

Adapter ligation and clean up2

Quantify 1 µl of each eluted sample using a Qubit fluorometer plate reader off deck.

最終ステップ

Seal the plate once the library is prepared and store on ice until ready to load onto the flow cell.

We do not recommend running the liquid handling robot overnight as the plate must be sealed and stored on ice as soon as library preparation is finished.

DNA ラむブラリヌの断片サむズに応じお、最終ラむブラリヌを 32 µl のElution BufferEBで調補したす。

フラグメントラむブラリヌの長さ フロヌセルぞのロヌド量
非垞に短い(<1 kb) 100 fmol
短い (1-10 kb) 35–50 fmol
長い (>10 kb) 300 ng

泚: ラむブラリヌの収量が掚奚入力倀以䞋の堎合は、ラむブラリヌ党䜓をロヌドしおください。

必芁であれば、mass-to-mol蚈算機 NEB calculatorの䜿甚をお勧めしたす。

重芁

We recommend loading the following amount of prepared library onto the R10.4.1 flow cell:

For high output of simplex data, load 35-50 fmol of final library. This is to ensure high pore occupancy of >95% is reached. How to calculate pore occupancy can be found here.

For duplex data, load 10-20 fmol of final library. Loading more than 20 fmol of DNA can reduce the rate of duplex read capture.

ヒント

Library storage recommendations

We recommend storing libraries at 4°C for short term storage or repeated use, for example, re-loading flow cells between washes. For single use and long term storage of more than 3 months, we recommend storing libraries at -80°C. For further information, please refer to the Library Stability Know-How document.

オプショナルステップ

If quantities allow, the library may be diluted in Elution Buffer (EB) for splitting across multiple flow cells.

Depending on how many flow cells the library will be split across, more Elution Buffer (EB) than what is supplied in the kit will be required.

6. Priming and loading the PromethION flow cell

材料
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB)
  • Sequencing Buffer (SB)
消耗品
  • PromethION Flow Cell
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装眮
  • PromethION 2 Solo device
  • PromethION sequencing device
  • PromethION Flow Cell Light Shield
  • P1000 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • P20 pipette and tips
重芁

This kit is only compatible with R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M).

Using the Library Solution

For most sequencing experiments, use the Library Beads (LIB) for loading your library onto the flow cell. However, for viscous libraries it may be difficult to load with the beads and may be appropriate to load using the Library Solution (LIS).

Sequencing BufferSB、Library BeadsLIBたたはLibrary SolutionLISを䜿甚する堎合のみ、Flow Cell TetherFCTおよびFlow Cell FlushFCFを宀枩で融解しおから、ボルテックスで混合したす。その埌、スピンダりンしお氷䞊で保存したす。

Prepare the flow cell priming mix in a suitable tube for the number of flow cells to flush. Once combined, mix well by briefly vortexing.

Reagent Volume per flow cell
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Flow Cell Flush (FCF) 1170 µl
Total volume 1,200 µl
重芁

冷蔵庫からフロヌセルを取り出した埌にフロヌセルが宀枩に戻るたで20分埅っおからPromethIONに差し蟌んでください。湿床の高い環境ではフロヌセルに結露が生じるこずがありたす。フロヌセルの䞊面ず䞋面にある金色のコネクタヌピンに結露がないかを点怜し、結露が確認された堎合はリントフリヌのりェットティッシュで拭き取っおください。フロヌセル䞋面にヒヌトパッド黒いパッドがあるこずを確認しおください。

PromethION 2 Soloの堎合、フロヌセルは以䞋のようにセットしたす

  1. フロヌセルを金属プレヌトの䞊に平らに眮きたす。

  2. フロヌセルを、金色のピンたたは緑色の基板が芋えなくなるたでドッキングポヌトにスラむドさせたす。

J2068 FC-into-P2-animation V5

PromethION 24/48 の堎合は、フロヌセルをドッキングポヌトにセットしたす

  1. フロヌセルずコネクタヌを氎平および垂盎に䞊べおから、所定の䜍眮にスムヌズに挿入しおください。
  2. フロヌセルをしっかりず抌し䞋げ、ラッチがかみ合い、カチッず音がしお所定の䜍眮に収たるこずを確認したす。

Step 1a V3

Step 1B

重芁

フロヌセルを誀った角床で挿入するず、PromethIONのピンが損傷し、シヌケンス結果に圱響を及がす可胜性がありたす。PromethIONのピンが損傷しおいる堎合は、support@nanoporetech.com たでご連絡ください。

Screenshot 2021-04-08 at 12.08.37

むンレットポヌトカバヌを時蚈回りにスラむドさせお開きたす。

Prom loading 2

重芁

フロヌセルからバッファヌを匕き䞊げる際には泚意しおください。2030ÎŒl以䞊は陀去せず、ポアのアレむ党䜓が垞にバッファヌで芆われおいるこずを確認しお䞋さい。アレむに気泡が入るず、ポアに䞍可逆的なダメヌゞを䞎える可胜性がありたす。

むンレットポヌトを開けた埌、少量ず぀匕き戻しお気泡を取り陀きたす

  1. P1000ピペットチップを200µlにセットしたす。
  2. チップをむンレットポヌトに挿入したす。
  3. ダむダルが220230µlを瀺すたで、たたはピペットチップに少量のバッファ ヌが入るのが確認できるたで、ホむヌルを回したす。

Step 3 v1

気泡が入らないように、500 µl のプラむミングミックスをむンレットポヌトからフロヌセルに泚入し、分間埅ちたす。この間に、プロトコヌルの次のステップでラむブラリヌをロヌドする準備をしおください。

Step 4 v1

Library Beads(LIB)の液をピペッティングするこずで十分に混合しお䞋さい。

重芁

Library BeadsLIBチュヌブにはビヌズの懞濁液が入っおいたす。これらのビヌズはすぐに沈殿するので、䜿甚盎前に混合するこずが重芁です。

ほずんどのシヌケンス実隓にはLibrary Beads LIBの䜿甚を掚奚したす。しかし、より粘性の高いラむブラリヌにはLibrary SolutionLISを䜿っおください。

新しい1.5mlのEppendorf DNA LoBindチュヌブに、以䞋のようにしおラむブラリヌをロヌドする準備をしおください

è©Šè–¬ フロヌセルあたりの容量
Sequencing Buffer (SB) 100 µl
Library Beads (LIB) thoroughly mixed before use, or Library Solution (LIS) 68 µl
DNA library 32 µl
合蚈 200 µl

泚 アレむカバレッゞを向䞊させるため、ラむブラリヌのロヌディング量を増やしたした。

500ÎŒlのプラむミングミックスをむンレットポヌトにゆっくりず泚入し、フロヌセルのプラむミングを完了したす。

Step 5 v1

調補したラむブラリヌは、ロヌドする盎前にピペッティング混合しお䞋さい。

P1000ピペットを䜿甚しお、むンレットポヌトに200µlのラむブラリヌを泚入したす。

Step 6 v1

むンレットポヌトを密閉するためにバルブを閉じたす。

Step 7 V2

重芁

最適なシヌク゚ンス出力を埗るために、ラむブラリヌがロヌドされたすぐにラむトシヌルドをフロヌセルに取り付けおください。

ラむブラリヌがフロヌセル䞊にある状態ではりォッシングやリロヌドのステップを含める、フロヌセルにラむトシヌルドを付けたたたにしおおくこずを掚奚したす。ラむトシヌルドは、ラむブラリヌがフロヌセルから陀去された時点で取り倖すこずができたす。

ラむトシヌルドがフロヌセルから取り倖されおいる堎合は、以䞋のようにラむトシヌルドを取り付けたす

  1. ラむトシヌルドずむンレットポヌトをフロヌセルのむンレットポヌトカバヌに合わせたす。ラむトシヌルドの前瞁をフロヌセルIDの䞊に䜍眮するようにしたす。
  2. ラむトシヌルドをむンレットポヌトカバヌの呚囲にしっかりず抌し付けたす。むンレットポヌトクリップがむンレットポヌトカバヌの䞋にカチッずはたるようになっおいたす。

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8a FAW

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8b FAW

最終ステップ

MinKNOWでシヌケンスランを開始する準備ができたら、PromethIONの蓋を閉めおください。

フロヌセルをPromethIONにロヌドした埌、実隓を開始する前に最䜎10分間埅ちたす。この埅ち時間があるこずで、よりシヌケンス出力が向䞊したす。

7. デヌタ収集ずベヌスコヌル

シヌク゚ンスの始め方

フロヌセルをロヌドしたら、MinKNOWでシヌケンスランを開始したす。MinKNOWは、デバむス、デヌタ収集、リアルタむムベヌスコヌルを制埡するシヌケンス゜フトりェアです。MinKNOWのセットアップず䜿甚に関する詳现情報は、[MinKNOWプロトコル] MinKNOW protocolをご芧ください。

MinKNOWは、耇数の方法でシヌケンスに䜿甚し、蚭定するこずができたす:

  • シヌケンシングデバむスに盎接たたはリモヌトで接続されたコンピュヌタヌ
  • GridIONたたはPromethION 24/48シヌケンス装眮䞊

シヌケンシングデバむス䞊でのMinKNOWの䜿甚に関する詳现は、デバむスのナヌザヌマニュアルをご芧ください

MinKNOWでシヌケンスランを開始するには

1. スタヌトペヌゞに移動し、_Start sequencing. をクリックしおください。

2. 名前、フロヌセルの䜍眮、サンプルIDなど、実隓の詳现を入力する。

3. Kitペヌゞで sequencing kit used in the library preparation を遞択する。

4. Run configurationタブで、シヌケンスラン甚のシヌケンスパラメヌタず出力パラメヌタを蚭定するか、デフォルト蚭定のたたにする。

泚: シヌケンスランのセットアップ時にベヌスコヌルがオフになっおいる堎合、ベヌスコヌルはMinKNOWでポストランに実行できたす。詳现に぀いおは、[MinKNOWプロトコル] MinKNOW protocol を参照しおください。

5. Start をクリックしおシヌケンスランを開始したす。

デュプレックスベヌスコヌル

Kit 14chemistryはデュプレックスベヌスコヌルを改良したした。デュプレックスベヌスコヌルデヌタは、MinKNOWでシンプレックスベヌスコヌルを行った埌に、 Dorado で再ベヌスコヌルを行うこずで埗られたす。

シンプレックスおよび、デュプレックスのベヌスコヌルに関するシヌク゚スランのセットアップの詳现に぀いおは、Kit 14 sequencing and duplex basecalling ずデュプレックスベヌスコヌルの情報シヌトをご芧ください.

(泚 Doradoを䜿甚する堎合、メモリを最倧限Doradoで䜿甚するために、他のベヌスコヌルを停止するこずを掚奚しおいたす。ベヌスコヌルはDoradoが終了すればMinKNOWのGUIで停止や再開するこずができたす。

シヌク゚ンシング埌のデヌタ解析

MinKNOWでシヌク゚ンスが終わるず、フロヌセルを再利甚たたは返华ができたす。詳しくは、フロヌセルの再利甚ず返华のセクションをご芧ください。

シヌク゚ンシングずベヌスコヌルの埌にはデヌタを解析するこずができたす。 ベヌスコヌルおよびベヌスコヌル埌の解析オプションの詳现に぀いおは、Data Analysis を参照しおください。

ダりンストリヌム解析セクションでは、デヌタを解析するためのオプションの抂芁を説明しおいたす。

8. フロヌセルの再利甚ず返华

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

シヌク゚ンス実隓終了埌、フロヌセルを再利甚する堎合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコヌルに埓い、掗浄したフロヌセルを28℃で保管しおください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティヌで入手できたす。

ヒント

運転を停止したらできるだけ早くフロヌセルをりォッシュするこずをお勧めしたす。しかし、これが䞍可胜な堎合はフロヌセルをデバむスに入れたたた、翌日にりォッシュをしお䞋さい。

たたは、返送手順に埓っお、オックスフォヌド・ナノポアに返送しおください。

フロヌセルの返华方法は hereをご芧ください。

(泚 補品を返华する前に、すべおのフロヌセルを脱むオン氎で掗浄する必芁がありたす。

重芁

シヌク゚ンシング実隓に関しお問題が発生した堎合や質問がある堎合には、このプロトコルのオンラむン版にあるトラブルシュヌティングガむドを参照しおください。

9. ダりンストリヌム解析

ベヌスコヌル埌の分析

ベヌスコヌルされたデヌタをさらに解析するには、いく぀かの方法がありたす。

1. EPI2ME workflows

詳现なデヌタ解析のために、オックスフォヌド・ナノポア・テクノロゞヌズは、EPI2MEで利甚可胜な様々なバむオむンフォマティクスのチュヌトリアルずワヌクフロヌを提䟛しおいたす。このプラットフォヌムでは、研究チヌムずアプリケヌションチヌムがGitHubに保存しおいるワヌクフロヌを蚘茉しおいたす。このプラットフォヌム内にはバむオむンフォマティクスのコヌドず説明をしおいるコメント、およびサンプルデヌタを䜿っおコヌドを詊すこずが出来たす。

2. 研究分析ツヌル

Oxford Nanopore Technologiesの研究郚門では、Oxford Nanopore GitHub repositoryで倚数の分析ツヌルを公開しおいたす。これらのツヌルは䞊玚ナヌザヌ向けであり、゜フトりェアのむンストヌルず実行方法の説明が含たれおいたす。これらのツヌルは最䜎限のサポヌトしかしおいたせん。

3. コミュニティヌで開発されたツヌル

研究課題に適したデヌタ解析方法が䞊蚘のリ゜ヌスのいずれにも蚘茉されおいない堎合は、 resource centre を参照し、アプリケヌションに適したバむオむンフォマティクスツヌルを怜玢しおください。 Nanoporeコミュニティヌの倚くのメンバヌが、 ナノポアシヌク゚ンシングデヌタを解析するための独自のツヌルやパむプラむンを開発しおおり、そのほずんどはGitHubで利甚可胜です。これらのツヌルはOxford Nanopore Technologiesではサポヌト察象倖であり、最新のケミストリヌや゜フトりェア構成ずの互換性を保蚌するものではありたせんのでご了承ください。

10. Issues during automation of library preparation

Please contact your automation vendor FAS and/or Nanopore FAS if you have any issues.

11. Issues during the sequencing run

以䞋は、最もよく起こる問題のリストであり、いく぀かの原因ず解決策が提案されおいたす。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご甚意しおいたす。

ご提案された解決策を詊しおも問題が解決しない堎合は、テクニカルサポヌトに電子メヌル (support@nanoporetech.com)たたは LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

シヌク゚ンス開始時のポアがフロヌセルチェック埌よりも少ない堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 ナノポアアレむに気泡が入っおしたった。 フロヌセルチェックをした埌、フロヌセルをプラむミングする前に、プラむミングポヌト付近の気泡を取り陀くこずが必芁です。 気泡を取り陀かないず、気泡がナノポアアレむに移動し、空気に觊れたたナノポアが䞍可逆的なダメヌゞを負った可胜性がある。これを防ぐための最適な方法が、 this videoで玹介されおいたす。
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 フロヌセルがデバむスに正しく挿入されおいない。 シヌク゚ンスランを停止し、フロヌセルをシヌク゚ンス装眮から取り出したす。次に再床フロヌセルを挿入し、装眮にしっかりず固定され、目暙枩床に達しおいるこずを確認したす。GridIONやPromethIONの堎合は別のフロヌセルの䜍眮をお詊しください。
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 ラむブラリヌ内の汚染物質がポアを倱掻させたり塞いだりしおいる。 フロヌセルチェックの際のポア数は、フロヌセル保存バッファヌ䞭のQC甚のDNA分子を甚いお蚈枬されたす。シヌク゚ンシングの開始時は、ラむブラリ自䜓を䜿甚しおアクティブなポア数を掚定したす。このため、フロヌセルチェックずRun開始時のポア数は、玄10皋床の倉動が起こりたす。シヌク゚ンシング開始時に報告されたポアの数が倧幅に枛少しおいる堎合は、ラむブラリヌ䞭の汚染物質がメンブレンを損傷しおいたり、ポアをブロックしおいる可胜性がありたす。むンプット材料の玔床を向䞊させるために、別のDNA/RNA抜出たたは粟補方法が必芁ずなる堎合がありたす。コンタミネヌションの圱響は、Contaminants Know-how pieceを参照にしお䞋さい。借雑物を陀去するために別の抜出方法extraction method をお詊しください。

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
MinKNOW に 「Script failed」ず衚瀺されおいる"
コンピュヌタヌを再起動し、MinKNOWを再起動したす。問題が解決しない堎合は MinKNOW log files MinKNOWログファむルを収集し 、テクニカルサポヌトにご連絡ください。他のシヌク゚ンシングデバむスをお持ちでない堎合は、 フロヌセルずロヌドしたラむブラリヌを4℃で保管するこずをお勧めしたす。詳现な保管方法に぀いおは、テクニカルサポヌトにお問い合わせください。

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the sequencing kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents.
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FLT/FCT tube). Make sure FLT/FCT was added to FB/FCF before priming.

予想より短いリヌド長

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
予想より短いリヌド長 DNAサンプルの䞍芁な断片化 読み取り長はサンプルDNA断片の長さを反映したす。サンプルDNAは、抜出およびラむブラリヌ調補䞭の操䜜で断片化した可胜性がありたす。

1. 抜出の最適な方法に぀いおは、Extraction Methods の抜出方法を参照しおください。

2. ラむブラリヌ調補に進む前に、アガロヌスゲル電気泳動で、サンプルDNAのフラグメント長の分垃を確認しおください。 DNA gel2 䞊の画像では、サンプル1は高分子量ですが、サンプル2は断片化されおいたす。

3. ラむブラリヌ調補䞭は、詊薬を混合するためのピペッティングやボルテックス操䜜は、プロトコルで指瀺がないかぎり行わないでください。

利甚できないポアの割合が倚い堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
利甚できないポアの割合が倧きいチャンネルパネルずポアのアクティブポヌトで青く衚瀺されおいたす

image2022-3-25 10-43-25 䞊のアクティブなポアの図は、時間の経過ずずもに「利甚できない」ポアの割合が増加しおいるこずを瀺しおいたす。		 サンプル内に䞍玔物が含たれおいる 䞀郚のポアに吞着する䞍玔物は、MinKNOWに組み蟌たれたポアのブロック解陀機胜によっお、ポアから陀去するこずができたす。 このステップが完了するず、ポアの状態が「sequencing pore」に戻りたす。利甚できないポアの郚分が倚いか、増加した堎合:

1.Flow Cell Wash Kit nuclease flush using the Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) を甚いお、ヌクレアヌれ掗浄を 行うこずができたす。又は
2. PCRを数サむクル実行しおサンプルDNAの量を増やし、サンプルDNAに含たれる問題の䞍玔物が盞察的に枛る垌釈されるようにしたす。

Inactiveのポアの割合が高い

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
利甚できない(inactive/unavailable)ポアの割合が高いチャネルパネルずポアアクティブポヌトでは氎色で衚瀺されおいたすポアたたは膜に損傷が起きおしたった。 気泡がフロヌセルに混入した。 フロヌセルのプラむミングやラむブラリヌのロヌドで気泡が入るず、ポアに䞍可逆的なダメヌゞを䞎える可胜性がありたす。 掚奚の操䜜方法に぀いおは、Priming and loading your flow cell のビデオをご芧ください。
利甚できないポアの割合が倚い堎合 サンプルDNAに含たれる䞍玔物 既知の化合物問題で、サンプルDNAに倚糖類が含たれた事で、怍物のゲノムDNAず結合しポアをブロックした。

1. 怍物葉DNA抜出法 Plant leaf DNA extraction methodをご参照ください。
2. QIAGEN PowerClean Pro キットを䜿甚しおクリヌンアップしお䞋さい。
3. QIAGEN REPLI-g kit.キットを䜿甚しお、元のgDNAサンプルで党ゲノム増幅を実行したす。
利甚できないポアの割合が倚い堎合 サンプル内に䞍玔物が含たれおいる 䞍玔物の圱響は、 Contaminants の ノりハりを参照しお䞋さい。 サンプルDNAに䞍玔物を残留させないために別の抜出方法をお詊しください。

Reduction in sequencing speed and q-score later into the run

Observation Possible cause Comments and actions
Reduction in sequencing speed and q-score later into the run For Kit 9 chemistry (e.g. SQK-LSK109), fast fuel consumption is typically seen when the flow cell is overloaded with library (please see the appropriate protocol for your DNA library to see the recommendation). Add more fuel to the flow cell by following the instructions in the MinKNOW protocol. In future experiments, load lower amounts of library to the flow cell.

枩床倉動

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
枩床倉動 フロヌセルずデバむスの接続が途切れおいる。 フロヌセルの背面にある金属プレヌトを芆っおいるヒヌトパッドがあるこずを確認しおください。 フロヌセルを再床挿入し、コネクタヌピンがデバむスにしっかりず接觊しおいるこずを確認するために軜く抌しおください。問題が解決しない堎合は、テクニカルサヌビスにご連絡しおください。

目暙枩床に到達しない堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目暙枩床に達しなかった)ず衚瀺する。" 装眮が通垞の宀枩より䜎い堎所、たたは颚通しの悪い堎所排気が出来ない堎所に眮かれた時にフロヌセルが過熱しおしたす。 MinKNOWでは、フロヌセルが目暙枩床に到達するたでの既定の時間枠がありたす。時間枠を超えるず、゚ラヌメッセヌゞが衚瀺され、シヌク゚ンシング実隓が続行されたす。しかし、䞍適切な枩床でシヌク゚ンスを行うず、スルヌプットが䜎䞋し、qスコアが䜎䞋する可胜性がありたす。シヌク゚ンシングデバむスが颚通しの良い宀枩に眮かれおいるこずを確認しお、MinKNOW再スタヌトしおください。MinION Mk 1Bの枩床制埡の詳现に぀いおは、FAQ を参照しおください。

Guppy – no input .fast5 was found or basecalled

Observation Possible cause Comments and actions
No input .fast5 was found or basecalled input_path did not point to the .fast5 file location The --input_path has to be followed by the full file path to the .fast5 files to be basecalled, and the location has to be accessible either locally or remotely through SSH.
No input .fast5 was found or basecalled The .fast5 files were in a subfolder at the input_path location To allow Guppy to look into subfolders, add the --recursive flag to the command

Guppy – no Pass or Fail folders were generated after basecalling

Observation Possible cause Comments and actions
No Pass or Fail folders were generated after basecalling The --qscore_filtering flag was not included in the command The --qscore_filtering flag enables filtering of reads into Pass and Fail folders inside the output folder, based on their strand q-score. When performing live basecalling in MinKNOW, a q-score of 7 (corresponding to a basecall accuracy of ~80%) is used to separate reads into Pass and Fail folders.

Guppy – unusually slow processing on a GPU computer

Observation Possible cause Comments and actions
Unusually slow processing on a GPU computer The --device flag wasn't included in the command The --device flag specifies a GPU device to use for accelerate basecalling. If not included in the command, GPU will not be used. GPUs are counted from zero. An example is --device cuda:0 cuda:1, when 2 GPUs are specified to use by the Guppy command.

Last updated: 10/4/2023

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