快速DNA测序V14 - 条形码（SQK-RBK114.24 或 SQK-RBK114.96）

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

快速DNA测序V14 - 条形码（SQK-RBK114.24 或 SQK-RBK114.96） V RBK_9176_v114_revO_20Nov2024

本中文版本对应的英文原文实验指南版本为：RBK_9176_v114_revO_30Sept2024。

  • 本实验指南使用基因组DNA
  • 用于为1-96个样本混样测序
  • 建库仅需约60分钟时间
  • 高产出
  • 片段化
  • 与R10.4.1 测序芯片兼容

仅供研究使用

FOR RESEARCH USE ONLY

概览

本中文版本对应的英文原文实验指南版本为：RBK_9176_v114_revO_30Sept2024。

  • 本实验指南使用基因组DNA
  • 用于为1-96个样本混样测序
  • 建库仅需约60分钟时间
  • 高产出
  • 片段化
  • 与R10.4.1 测序芯片兼容

仅供研究使用

Document version: RBK_9176_v114_revO_20Nov2024

1. 实验指南概览

快速条形码测序试剂盒 V14 简介

本实验指南详细描述了使用快速条形码测序试剂盒-24及96 V14（SQK-RBK114.24 或 SQK-RBK114.96）为基因组DNA样品快速添加条形码及测序的操作流程及常见问题的解决方法。上述试剂盒采用最新的试剂盒 14系列试剂，专为在实验室设备较少的情况下快速制备文库而设计。

测序工作流程：

准备您的实验

您将需要：

  • 提取DNA，并根据起始DNA/RNA质控实验指南评估DNA的长度、浓度和纯度。 质量评估步骤对确保实验成功至关重要。
  • 确保您已准备好测序试剂盒、正确的仪器以及第三方试剂。
  • 下载数据收集和分析软件。
  • 检查您的测序芯片上有足够多的活性纳米孔，以确保测序良好运行。

文库制备

下表概述了文库制备所需的步骤，包括时间安排和可以中止的节点。

文库制备 步骤 时间 中止节点
为DNA添加条形码 使用快速条形码测序试剂盒V14在切割模板分子的同时，将带有条形码的标签连接至酶切端。 15 分钟 4°C 过夜
样本合并及纯化 合并带条形码的文库，并使用 AMPure XP磁珠纯化 25 分钟 4°C 过夜
接头连接 将测序接头连接到DNA末端 10 分钟 我们强烈建议您在为文库连接接头后，尽快测序。
测序芯片预处理及上样 对测序芯片进行预处理，然后将制备好的文库加至芯片中进行测序。 5 分钟

中文 RBK114 gDNA Workflow

测序和分析

您将需要：

  • 使用MinKNOW软件开始测序。该软件会通过测序仪收集原始数据，并将其识别成碱基序列。
  • 通过MinKNOW、Guppy软件或EPI2ME中的条形码工作流程，根据条形码对序列进行拆分。
重要

实验方案适用性

本实验方案仅适用于与以下产品搭配使用：

  • 快速条形码测序试剂盒-24 V14 (SQK-RBK114.24)
  • 快速条形码测序试剂盒-96 V14 (SQK-RBK114.96)
  • R10.4.1测序芯片（FLO-MIN114）
  • 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）
  • 测序芯片预处理试剂盒 V14 (EXP-FLP004)
  • 测序辅助扩展包 V14 (EXP-AUX003)
  • 快速测序文库接头辅助扩展包 V14 (EXP-RAA114)
  • MinION Mk1C - MinION Mk1C IT 配置要求文件
  • MinION Mk1B - MinION Mk1B IT 配置要求文件

2. 仪器及耗材

材料
  • 每个样本 200 ng gDNA
  • 快速条形码测序试剂盒-24 V14 （SQK-RBK114.24）或 快速条形码测序试剂盒-96 V14 （SQK-RBK114.96）
耗材
  • MinION及GridION测序芯片
  • Qubit dsDNA HS Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（Invitrogen, Q32851）
  • （非必需）牛血清白蛋白（BSA）（50 mg/mL）（例如 Invitrogen™ UltraPure™ BSA （50 mg/mL）， AM2616）
  • 新制备的80%乙醇（用无核酸酶水配制）
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
  • Eppendorf低吸附twin.tec®96孔PCR板，半裙边（Eppendorf™，0030129504）带热封
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • 0.2 ml 薄壁PCR管
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
  • MinION 或 GridION 测序仪
  • MinION 及GridION 测序芯片遮光片
  • 微孔板离心机，如Fisherbrand™ 微孔板迷你离心机（Fisher Scientific, 11766427）
  • 计时器
  • 热循环仪或恒温加热仪
  • 磁力架
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 盛有冰的冰桶
  • Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P2移液枪和枪头
  • 多通道移液枪和枪头

快速条形码使用要求

请注意： 请确保您根据样本数量选择适合的试剂盒：

  • 快速条形码测序试剂盒-24 V14 (SQK-RBK114.24) 内含条形码 RB01-24，可为24个样本混样测序。
  • 快速条形码测序试剂盒-96 V14 (SQK-RBK114.96) 内含条形码 RB01-96，可为96个样本混样测序。

为获得最优产出，我们建议用户每次使用至少4种不同的条形码。如果您希望对少于4个样品进行测序，请确保将这些样品拆分连接到至少4种不同的条形码上（例如，如有两个样品，对样品A使用条形码RB01-RB02，对样品B使用条形码RB03-RB04）。

请注意，每种条形码 所需的样本起始量为200ng gDNA。

如您只有少量样本需要测序，可以考虑使用我们的快速建库测序试剂盒 V14 (SQK-RAD114)。

测序芯片质检

我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到MinION /GridION /PremethION测序芯片12周之内进行，或者在您收到Flongle测序芯片四周内进行。Oxford Nanopore Technologies会对活性孔数量少于以下标准的芯片进行替换** ：

测序芯片 芯片上的活性孔数确保不少于
Flongle 测序芯片 50
MinION/GridION 测序芯片 800
PromethION 测序芯片 5000

** 请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于Oxford Nanopore Technologies推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两天内递交给我们。请您按照 测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。

快速条形码测序试剂盒-24 V14（SQK-RBK114.24）内容物

我们正在将试剂盒中的条形码包装更改为96孔板形式。这一改动将减少塑料浪费，并支持自动化应用。

孔板形式

SQK-RBK114.24 plate format

名称 缩写 管盖颜色 管数 每管溶液体积 (μl)
快速测序文库接头 RA 绿色 1 15
接头缓冲液 ADB 透明 1 100
AMPure XP 磁珠 AXP 琥珀色 2 1200
洗脱缓冲液 EB 黑色 1 500
测序缓冲液 SB 红色 1 700
文库颗粒 LIB 粉色 1 600
文库溶液 LIS 白色管盖，粉色标签 1 600
测序芯片冲洗液 FCF 透明管盖，浅蓝色标签 1 8000
测序芯片系绳 FCT 紫色 1 200
快速连接条形码 RB01-24 两板，每板三套条形码组合 每孔15µl

本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20°C 下储存（试剂稳定性将不受损害）。

管装形式

RBK114.24 tubes

名称 缩写 管盖颜色 管数 每管溶液体积 (μl)
快速测序文库接头 RA 绿色 1 15
接头缓冲液 ADB 透明 1 100
AMPure XP 磁珠 AXP 琥珀色 2 1200
洗脱缓冲液 EB 黑色 1 500
测序缓冲液 SB 红色 1 700
文库颗粒 LIB 粉色 1 600
文库溶液 LIS 白色管盖，粉色标签 1 600
测序芯片冲洗液 FCF 蓝色 6 1170
测序芯片系绳 FCT 紫色 1 200
快速连接条形码 RB01-24 透明 24 15

本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20°C 下储存（试剂稳定性将不受损害）。

快速条形码测序试剂盒-96 V14（SQK-RBK114.96）内容物

RBK114.96 tubes (1)

名称 缩写 管盖颜色 管数 溶液体积 (μl)
快速测序文库接头 RA 绿色 2 15
接头缓冲液 ADB 透明 1 100
AMPure XP 磁珠 AXP 琥珀色 3 1200
洗脱缓冲液 EB 黑色 1 1500
测序缓冲液 SB 红色 1 1700
文库颗粒 LIB 粉色 1 1800
文库溶液 LIS 白色管盖，粉色标签 1 1800
测序芯片冲洗液 FCF 透明 1 15500
测序芯片系绳 FCT 紫色 2 200
快速连接条形码 RB01-96 - 3 盘 每孔 8 µl

本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20°C 下储存（试剂稳定性将不受损害）。

3. 文库制备

材料
  • 每个样本 200 ng gDNA
  • 快速连接条形码（RB01-24 或 RB01-96)
  • 快速测序文库接头（RA）
  • 接头缓冲液（ADB）
  • AMPure XP 磁珠（AXP）
  • Oxford Nanopore测序试剂盒中的洗脱缓冲液（EB）
耗材
  • Qubit dsDNA HS Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（Invitrogen, Q32851）
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • 新制备的80%乙醇（用无核酸酶水配制）
  • Eppendorf低吸附twin.tec®96孔PCR板，半裙边（Eppendorf™，0030129504）带热封
  • 0.2 ml 薄壁PCR管
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind离心管
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
仪器
  • 盛有冰的冰桶
  • 计时器
  • 热循环仪
  • 微孔板离心机，如Fisherbrand™ 微孔板迷你离心机（Fisher Scientific, 11766427）
  • 磁力架
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
  • P1000移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2移液枪和枪头
  • 多通道移液枪和枪头

快速条形码的最低使用要求

为获得最优产出，我们建议用户每次使用至少4种不同的条形码。如果您希望对少于4个样品进行测序，请确保将这些样品拆分连接到至少4种不同的条形码上：

  • 如有一个样品，则将该样品拆分连接至四种条形码（如，对样品A使用条形码RB01-RB04，每个条形码需要200ng的起始gDNA样品）。
  • 如有两个样品，则每个样品使用两种条形码（如，对样品A使用条形码RB01-RB02，对样品B使用条形码RB03-RB04）。
  • 如有三个样品，则选取其中两个样品各与一种条形码连接，再将第三个样品拆分连接至两种条形码（如，将样品A和B分别与条形码RB01和RB02连接，对样品C使用条形码RB03和RB04）。

注意，每种条形码 所需的样本起始量为200ng gDNA。

如果您只有少量样本需要测序，可以考虑使用我们的快速建库测序试剂盒 V14（SQK-RAD114）。

CHECKPOINT

测序芯片质检

我们强烈建议您在开始文库制备前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检，以确保测序实验顺利运行。

详情请参阅 MinKNOW 实验指南中的 测序芯片质检说明。

设定热循环仪的程序：30℃两分钟，后接80℃两分钟。

请根据下表，使用相应方法对各试剂进行解冻、瞬时离心和吹打混匀：

试剂 1. 室温下解冻 2. 迷你离心机瞬时离心 3. 吹打混匀
快速连接条形码（RB01-24 或 RB01-96） 未冻结 ✓ ✓
快速测序文库接头（RA） 未冻结 ✓ ✓
AMPure XP磁珠（AXP） ✓ ✓ 临使用前，吹打或涡旋混匀
洗脱缓冲液（EB） ✓ ✓ ✓
接头缓冲液（ADB） ✓ ✓ 涡旋混匀

准备起始DNA样本。

  1. 将每个含有200ng基因组DNA的样本转移至一支0.2ml的薄壁PCR管或Eppendorf低吸附 twin.tec®96孔PCR板的一个孔内。
  2. 如样本体积不足10μl，请加入无核酸酶水补足。
  3. 轻轻吹打每支PCR管或PCR板每孔内的液体10-15次，以避免不必要的打断。
  4. 使用迷你离心机瞬时离心。

在各0.2ml的薄壁PCR管或Eppendorf低吸附 twin.tec®96孔PCR板的孔内，混合以下试剂：

试剂 每个样本的体积
来自前一步骤的200ng的gDNA 10 μl
快速连接条形码（RB01-24 or RB01-96，每个样本使用一种条形码） 1.5 μl
Total 11.5 μl

充分吹打混匀管中试剂，再瞬时离心。

将PCR管或96孔板在30℃下孵育两分钟，然后在80℃下孵育两分钟，随后短暂置于冰上冷却。

将PCR管或96孔板瞬时离心，收集管/板底的液体。

将所有带条码的样本合并至一支2ml 的Eppendorf DNA LoBind离心管中，记下管内液体总体积。

每个样本的体积 4个样本 12个样本 24个样本 48个样本 96个样本
总体积 11.5 µl 46 µl 138 µl 276 µl 552 µl 1104 µl

涡旋振荡以重悬AMPure XP磁珠（AXP）。

重要

请确保离心管有足够的容量，可以容纳后续步骤中的所有试剂。

为确保离心管容量足够，能够容纳后续步骤中的试剂，请在下一步骤中使用不超过1000 µl的合并后样本（即2ml Eppendorf DNA LoBind 离心管容量的一半）。

向合并后的带条码样本中，加入等体积的经过重悬的AMPure XP磁珠，轻弹离心管以混匀。

每个样本的体积 4个样本 12个样本 24个样本 48个样本 96个样本
需要添加的AMPure XP磁珠（AXP）的体积 11.5 µl 46 µl 138 µl 276 µl 552 µl 1000 µl

将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育10分钟。

准备不少于2ml的新制备的80％乙醇（用无核酸酶水配制）。

将样品瞬时离心，并静置于磁力架上待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去清液。

保持试管在磁力架上不动，以1ml新鲜制备的80%乙醇洗涤磁珠。小心不要扰动磁珠。用移液枪将乙醇吸走并弃掉。

重复上述步骤。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。 用移液枪吸走残留的乙醇。 让磁珠在空气中干燥约30秒，但不要干至表面开裂。

将离心管从磁力架上移开。每使用24种条形码，需要使用15μl洗脱缓冲液（EB）来重悬磁珠。

. 24种条形码 48种条形码 72种条形码 96种条形码
所需洗脱缓冲液（EB）的体积 15 µl 30 µl 45 µl 60 µl

室温下孵育10分钟。

将离心管静置于磁力架上至少一分钟，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将剩余的全部l洗脱液转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind管中。

  • 将含有DNA文库的洗脱液转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind管中
  • 将磁珠丢弃
CHECKPOINT

取1µl洗脱样品，用Qubit荧光计定量。

将11μl含样本的洗脱液转至一支干净的1.5 ml Eppendorf DNA LoBind离心管中。

在一支1.5ml Eppendorf DNA LoBind离心管内，按下表稀释快速测序文库接头（RA），并吹打混匀：

试剂 体积
快速测序文库接头（RA） 1.5 μl
接头缓冲液（ADB） 3.5 μl
总体积 5 μl

向11 μl带条形码的DNA洗脱液中加入1 μl 经过稀释的快速测序文库接头（RA）。

轻弹离心管以充分混合，并瞬时离心。

室温下孵育5分钟。

小提示： 在孵育的同时，您可以继续执行下一节“测序芯片的预处理和上样”中的步骤。

步骤结束

制备好的文库即可用于芯片上样。请在上样前，始终将文库置于冰上。

4. MinION 及 GridION 测序芯片的预处理及上样

材料
  • 测序芯片冲洗液（FCF）
  • 测序芯片系绳（FCT）
  • 文库溶液（LIS）
  • 文库颗粒（LIB）
  • 测序缓冲液（SB）
耗材
  • MinION及GridION测序芯片
  • （非必需）牛血清白蛋白（BSA）（50 mg/mL）（例如 Invitrogen™ UltraPure™ BSA （50 mg/mL）， AM2616）
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
  • MinION 或 GridION 测序仪
  • MinION 及GridION 测序芯片遮光片
  • P1000 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
重要

请注意：本试剂盒仅兼容R10.4.1测序芯片（FLO-MIN114）。

提示

测序芯片的预处理及上样

我们建议所有新用户在首次运行测序芯片前，观看视频测序芯片的预处理及上样。

使用文库溶液

对大多数测序实验，我们建议您使用文库颗粒（LIB）给测序芯片上样。然而，对于粘稠的文库，借助文库颗粒上样可能会比较困难，此时使用文库溶液（LIS）可能更为合适。

于室温下解冻测序缓冲液（SB）、文库颗粒（LIB）或文库溶液（LIS）、测序芯片系绳（FCT）和一管测序芯片冲洗液（FCF）。完全解冻后，涡旋振荡混匀，然后瞬时离心并置于冰上。

重要

为在MinION及GridION R10.4.1测序芯片（FLO-MIN114）上获得最优的测序表现并提高测序产出，我们推荐您向测序芯片预处理液中加入终浓度为0.2 mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）。

请注意： 我们不推荐使用其它类型的白蛋白（例如重组人血清白蛋白）。

在一支洁净的 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind离心管中，按下表制备测序芯片的预处理液，室温下颠倒离心管并吹打混匀：

试剂 体积（每张芯片）
测序芯片冲洗液 (FCF) 1170 µl
50mg/ml的牛血清白蛋白 (BSA) 5 µl
测序芯片系绳 (FCT) 30 µl
总体积 1205 µl

打开MinION或GridION测序仪的盖子，将测序芯片插入金属固定夹的下方。用力向下按压芯片，以确保正确的热、电接触。

中文-测序芯片预处理上样1a

中文-测序芯片预处理上样1b

可选操作

为文库上样前，完成测序芯片检测，查看可用孔数目。

如此前已对测序芯片进行过质检，则此步骤可省略。

更多信息，请查看MinKNOW实验手册的 测序芯片质检 部分。

顺时针转动预处理孔孔盖，使预处理孔显露出来。

中文-测序芯片预处理上样2

重要

从测序芯片中反旋排出缓冲液。请勿吸出超过20-30µl的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。

将预处理孔打开后，检查孔周围是否有小气泡。请按照以下方法，从孔中排出少量液体以清除气泡：

  1. 将P1000移液枪转至200µl刻度。
  2. 将枪头垂直插入预处理孔中。
  3. 反向转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在220-230 µl之间，或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。
    __请注意：__ 肉眼检查，确保从预处理孔到传感器阵列的缓冲液连续且无气泡。

中文-测序芯片预处理上样3

通过预处理孔向芯片中加入800µl预处理液，避免引入气泡。等待5分钟。在此期间，请按照以下步骤准备用于上样的DNA文库。

中文-测序芯片预处理上样4

将含有文库颗粒的LIB管用移液枪吹打混匀。

重要

LIB管内的文库颗粒分散于悬浮液中。由于颗粒沉降速度非常快，因此请在混匀颗粒后立即使用。

对于大多数测序实验，我们建议您使用文库颗粒（LIB）。但如文库较为粘稠，您可考虑使用文库溶液（LIS）。

在一支新的1.5ml Eppendorf LoBind离心管中，按下表所示准备上样文库：

试剂 体积（每张测序芯片）
测序缓冲液（SB） 37.5 µl
文库颗粒（LIB），使用前即时混匀；或文库溶液（LIS） 25.5 µl
DNA文库 12 µl
总体积 75 µl

完成测序芯片的预处理：

  1. 轻轻地翻起SpotON上样孔盖，使SpotON上样孔显露出来。 中文-测序芯片预处理上样5
  2. 通过预处理孔（而 非 SpotON加样孔）向芯片中加入200µl预处理液，避免引入气泡。 中文-测序芯片预处理上样6

临上样前，用移液枪轻轻吹打混匀制备好的文库。

通过SpotON加样孔向芯片中逐滴加入75µl样品。确保液滴流入孔内后，再加下一滴。

中文-测序芯片预处理上样7

轻轻合上SpotON加样孔孔盖，确保塞头塞入加样孔内。逆时针转动预处理孔孔盖，盖上预处理孔。

中文-测序芯片预处理上样8

中文-测序芯片预处理上样9

重要

为获得最佳测序产出，在文库样本上样后，请立即在测序芯片上安装遮光片。

我们建议在清洗芯片并重新上样时，将遮光片保留在测序芯片上。一旦文库从测序芯片中吸出，即可取下遮光片。

按下述步骤安装测序芯片遮光片：

  1. 小心将遮光片的前沿（平端）与金属固定夹的边沿对齐。 请注意： 请勿将遮光片强行压到固定夹下方。

  2. 将遮光片轻轻盖在测序芯片上。遮光片的SpotON加样孔孔盖缺口应与芯片上的SpotON加样孔孔盖接合，遮盖住整个测序芯片的前部。

MinION加装遮光片

注意

MinION测序芯片的遮光片并非固定在测序芯片上，因此当为芯片加装遮光片后，请小心操作。

步骤结束

小心合上测序设备上盖并在MinKNOW上设置测序实验。

5. 数据采集和碱基识别

纳米孔数据分析概览

有关纳米孔数据分析的完整概述，包括碱基识别和次级分析，请参阅 数据分析 文档。

如何开始测序

MinKNOW软件负责仪器控制，数据采集和实时碱基识别。如您已在计算机上安装MinKNOW，则可选择以下几种途径开展测序：

1. 使用计算机上的MinKNOW进行实时数据采集和碱基识别

请按照 MinKNOW 实验指南 的说明：从“开始测序”部分起，到“MinKNOW运行结束”部分止。

2. 使用GridION进行实时数据采集和碱基识别

请参照 GridION 用户手册 中的说明。

3. 使用MinION Mk1C测序仪进行实时数据采集和碱基识别

请参照 MinION Mk1C 使用指南中的说明。

4. 使用PromethION测序仪进行实时数据采集和碱基识别

请参照 PromethION 使用指南 或 PromethION 2 Solo 使用指南中的说明。

5. 使用计算机上的MinKNOW进行数据采集，过后再用NinKNOW进行线下碱基识别

请按照 MinKNOW 实验指南 中的说明：从“开始测序”部分起，到“MinKNOW运行结束”部分止。 当您设置实验参数时，请将 碱基识别 选项设为“关”。 测序实验结束后，请按照 MinKNOW 实验指南的本地分析 部分操作。

6. 下游分析

下游分析

您可以选择以下几个途径来进一步分析经过碱基识别的数据：

1. EPI2ME 工作流程

Oxford Nanopore Technologies通过EPI2ME Labs平台提供了一系列针对高阶数据分析的生物信息学教程和工作流程。上述资源汇总于纳米孔社区的 EPI2ME Labs 板块。该平台通过描述性文字、生物信息学代码和示例数据，具象化地展示出我们的研究和应用团队发布在 GitHub 上的工作流程。

2. 科研分析工具

Oxford Nanopore Technologies的研发部门开发了许多分析工具，您可在Oxford Nanopore的 GitHub 资料库中找到。这些工具面向有一定经验的用户，并包含如何安装和运行软件的说明。工具以源代码形式提供，因此我们仅提供有限的技术支持。

3. 纳米孔社区用户开发的分析工具

如果以上工具仍无法为您提供解决研究问题的分析方法，请参考资源中心的生物信息学板块。该板块汇总了许多由纳米孔社区成员开发、且在Github上开源的、针对纳米孔数据的生信分析工具。请注意，Oxford Nanopore Technologies不为这些工具提供支持，也不能保证它们与测序所用的最新的化学试剂/软件配置兼容。

7. 测序芯片的重复利用及回收

材料
  • 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）

完成测序实验后，如您希望再次使用测序芯片，请按照测序芯片清洗试剂盒的说明进行操作，并将清洗后的芯片置于2-8℃保存。

您可在纳米孔社区获取 测序芯片清洗试剂盒实验指南。

提示

我们建议您在停止测序实验后尽快清洗测序芯片。如若无法实现，请将芯片留在测序设备上，于下一日清洗。

请按照“回收程序”清洗好芯片，以便送回Oxford Nanopore。

您可在 此处找到回收测序芯片的说明。

请注意： 在将测序芯片寄回之前，请使用去离子水对每张芯片进行冲洗。

重要

如果您遇到问题或对测序实验有疑问，请参阅本实验指南在线版本中的“疑难解答指南”一节。

8. DNA/RNA提取和文库制备过程中可能出现的问题

以下表格列出了常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的“Support”板块 提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮(support@nanoporetech.com)）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们。

低质量样本

现象 可能原因 措施及备注
低纯度DNA（Nanodrop测定的DNA吸光度比值260/280<1.8，260/230 <2.0-2.2） 用户所使用的DNA提取方法未能达到所需纯度 您可在 污染物专题技术文档 中查看污染物对后续文库制备和测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法。

请考虑将样品再次用磁珠纯化。
RNA完整度低（RNA完整值（RIN）<9.5，或rRNA在电泳凝胶上的条带呈弥散状） RNA在提取过程中降解 请尝试其它 RNA 提取方法。您可在 RNA完整值专题技术文档 中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅 DNA/RNA 操作 页面。
RNA的片段长度短于预期 RNA在提取过程中降解 请尝试其它 RNA 提取方法。 您可在 RNA完整值专题技术文档中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅DNA/RNA 操作 页面。

我们建议用户在无RNA酶污染的环境中操作，并确保实验设备没有受RNA酶污染.

经AMPure磁珠纯化后的DNA回收率低

现象 可能原因 措施及备注
低回收率 AMPure磁珠量与样品量的比例低于预期，导致DNA因未被捕获而丢失 1. AMPure磁珠的沉降速度很快。因此临加入磁珠至样品前，请确保将磁珠重悬充分混匀。

2. 当AMPure磁珠量与样品量的比值低于0.4:1时，所有的DNA片段都会在纯化过程中丢失。
低回收率 DNA片段短于预期 AMPure磁珠量与样品量的比值越低，针对短片段的筛选就越严格。每次实验时，请先使用琼脂糖凝胶（或其他凝胶电泳方法）确定起始DNA的长度，并据此计算出合适的AMPure磁珠用量。 SPRI cleanup
末端修复后的DNA回收率低 清洗步骤所用乙醇的浓度低于70% 当乙醇浓度低于70%时，DNA会从磁珠上洗脱下来。请确保使用正确浓度的乙醇。

9. 在使用快速测序试剂盒测序的过程中，可能产生的问题

以下表格列出了常见问题，以及可能的原因和解决方法。

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Mux扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 纳米孔阵列中引入了气泡 在对通过质控的芯片进行预处理之前，请务必排出预处理孔附近的气泡。否则，气泡会进入纳米孔阵列对其造成不可逆转地损害。 视频中演示了避免引入气泡的最佳操作方法。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 测序芯片没有正确插入测序仪 停止测序，将芯片从测序仪中取出，再重新插入测序仪内。请确保测序芯片被牢固地嵌入测序仪中，且达到目标温度。如用户使用的是GridION/PromethION测序仪，也可尝试将芯片插入仪器的其它位置进行测序。
inKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 文库中残留的污染物对纳米孔造成损害或堵塞 在测序芯片质检阶段，我们用芯片储存缓冲液中的质控DNA分子来评估活性纳米孔的数量。而在测序开始时，我们使用DNA文库本身来评估活性纳米孔的数量。因此，活性纳米孔的数量在这两次评估中会有约10%的浮动。

如测序开始时报告的孔数明显降低，则可能是由于文库中的污染物对膜结构造成了损坏或将纳米孔堵塞。用户可能需要使用其它的DNA/RNA提取或纯化方法，以提高起始核酸的纯度。您可在 污染物专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法 。

MinKNOW脚本失败

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示 "Script failed”（脚本失败）
重启计算机及MinKNOW。如问题仍未得到解决，请收集 MinKNOW 日志文件 并联系我们的技术支持。 如您没有其他可用的测序设备，我们建议您先将装有文库的测序芯片置于4°C 储存，并联系我们的技术支持团队获取进一步储存上的建议。

纳米孔利用率低于40%

现象 可能原因 措施及备注
纳米孔利用率<40% 测序芯片中的文库量不足 请确保您按照相应实验指南，向MinION Mk1B/GridION测序芯片中加入正确浓度的优质测序文库。请在上样前对文库进行定量，并使用 Promega Biomath Calculator 等工具中的“ dsDNA：µg to pmol”功能来计算DNA分子的摩尔量。
纳米孔利用率接近0 尽管您使用了快速建库测序试剂盒 V14/快速条形码测序试剂盒V14，但测序接头并未与DNA连接 请务必严格遵照实验指南的操作步骤，并确保使用正确的试剂体积和孵育温度。您可制备Lambda对照文库来检验试剂的质量和有效性。
纳米孔利用率接近0 测序芯片中无系绳 系绳（FCT管）随预处理液加入芯片。因此在制备预处理液时，请确保将FCT加入测序芯片冲洗液（FCF）中。

读长短于预期

现象 可能原因 措施及备注
读长短于预期 DNA样本降解 读长反映了起始DNA片段的长度。起始DNA在提取和文库制备过程中均有可能被打断。

1. 1. 请查阅纳米孔社区中的 提取方法 以获得最佳DNA提取方案。

2. 在进行文库制备之前，请先跑电泳，查看起始DNA片段的长度分布。DNA gel2 在上图中，样本1为高分子量DNA，而样本2为降解样本。

3. 在制备文库的过程中，请避免使用吹打或/和涡旋振荡的方式来混合试剂。轻弹或上下颠倒离心管即可。

大量纳米孔处于不可用状态

现象 可能原因 Comments and actions
大量纳米孔处于不可用状态 (在通道面板和纳米孔活动状态图上以蓝色表示)

image2022-3-25 10-43-25 上方的纳米孔活动状态图显示：状态为不可用的纳米孔的比例随着测序进程而不断增加。		 样本中含有污染物 使用MinKNOW中的“Unblocking”（疏通）功能，可对一些污染物进行清除。 如疏通成功，纳米孔的状态会变为"测序孔". 若疏通后，状态为不可用的纳米孔的比例仍然很高甚至增加：

1. 用户可使用 测序芯片冲洗试剂盒（EXP-WSH004）进行核酸酶冲洗 can be performed, 操作，或
2. 使用PCR扩增目标片段，以稀释可能导致问题的污染物。

大量纳米孔处于失活状态

现象 可能原因 措施及备注
大量纳米孔处于失活状态（在通道面板和纳米孔活动状态图上以浅蓝色表示。膜结构或纳米孔遭受不可逆转地损伤） 测序芯片中引入了气泡 在芯片预处理和文库上样过程中引入的气泡会对纳米孔带来不可逆转地损害。请观看 测序芯片的预处理及上样 视频了解最佳操作方法。
大量纳米孔处于失活/不可用状态 文库中存在与DNA共纯化的化合物 与植物基因组DNA相关的多糖通常能与DNA一同纯化出来。

1. 请参考 植物叶片DNA提取方法。
2. 使用QIAGEN PowerClean Pro试剂盒进行纯化。
3. 利用QIAGEN REPLI-g试剂盒对原始gDNA样本进行全基因组扩增。
大量纳米孔处于失活/不可用状态 样本中含有污染物 您可在 污染物专题技术文档 中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法。

温度波动

现象 可能原因 措施及备注
温度波动 测序芯片和仪器接触不良 检查芯片背面的金属板是否有热垫覆盖。重新插入测序芯片，用力向下按压，以确保芯片的连接器引脚与测序仪牢固接触。如问题仍未得到解决，请联系我们的技术支持。

未能达到目标温度

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示“未能达到目标温度” 测序仪所处环境低于标准室温，或通风不良（以致芯片过热） MinKNOW会限定测序芯片达到目标温度的时间。当超过限定时间后，系统会显示出错信息，但测序实验仍会继续。值得注意的是，在错误温度下测序可能会导致通量和数据质量（Q值）降低。请调整测序仪的摆放位置，确保其置于室温下、通风良好的环境中后，再在MinKNOW中继续实验。有关MinION MK1B温度控制的更多信息，请参考此 FAQ （常见问题）文档。

Last updated: 11/14/2024

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