本实验指南详细描述了使用快速条形码测序试剂盒-24及96 V14（SQK-RBK114.24 或 SQK-RBK114.96）为基因组DNA样品快速添加条形码及测序的操作流程及常见问题的解决方法。上述试剂盒采用最新的试剂盒 14系列试剂，专为在实验室设备较少的情况下快速制备文库而设计。

测序工作流程：

准备您的实验

您将需要：

• 提取DNA，并根据起始DNA/RNA质控实验指南评估DNA的长度、浓度和纯度。 质量评估步骤对确保实验成功至关重要。
• 确保您已准备好测序试剂盒、正确的仪器以及第三方试剂。
• 下载数据收集和分析软件。
• 检查您的测序芯片上有足够多的活性纳米孔，以确保测序良好运行。

文库制备

下表概述了文库制备所需的步骤，包括时间安排和可以中止的节点。

文库制备	步骤	时间	中止节点
为DNA添加条形码	使用快速条形码测序试剂盒V14在切割模板分子的同时，将带有条形码的标签连接至酶切端。	15 分钟	4°C 过夜
样本合并及纯化	合并带条形码的文库，并使用 AMPure XP磁珠纯化	25 分钟	4°C 过夜
接头连接	将测序接头连接到DNA末端	10 分钟	我们强烈建议您在为文库连接接头后，尽快测序。
测序芯片预处理及上样	对测序芯片进行预处理，然后将制备好的文库加至芯片中进行测序。	5 分钟

测序和分析

您将需要：

• 使用MinKNOW软件开始测序。该软件会通过测序仪收集原始数据，并将其识别成碱基序列。
• 通过MinKNOW、Guppy软件或EPI2ME中的条形码工作流程，根据条形码对序列进行拆分。

请注意： 请确保您根据样本数量选择适合的试剂盒：

• 快速条形码测序试剂盒-24 V14 (SQK-RBK114.24) 内含条形码 RB01-24，可为24个样本混样测序。
• 快速条形码测序试剂盒-96 V14 (SQK-RBK114.96) 内含条形码 RB01-96，可为96个样本混样测序。

为获得最优产出，我们建议用户每次使用至少4种不同的条形码。如果您希望对少于4个样品进行测序，请确保将这些样品拆分连接到至少4种不同的条形码上（例如，如有两个样品，对样品A使用条形码RB01-RB02，对样品B使用条形码RB03-RB04）。

请注意，每种条形码 所需的样本起始量为200ng gDNA。

如您只有少量样本需要测序，可以考虑使用我们的快速建库测序试剂盒 V14 (SQK-RAD114)。

我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到MinION /GridION /PremethION测序芯片三个月之内进行，或者在您收到Flongle测序芯片四周内进行。Oxford Nanopore Technologies会对活性孔数量少于以下标准的芯片进行替换** ：

测序芯片	芯片上的活性孔数确保不少于
Flongle 测序芯片	50
MinION/GridION 测序芯片	800
PromethION 测序芯片	5000

** 请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于Oxford Nanopore Technologies推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两天内递交给我们。请您按照 测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。

名称	缩写	管盖颜色	管数	每管溶液体积 (μl)
快速测序文库接头	RA	绿色	1	15
接头缓冲液	ADB	透明	1	100
AMPure XP 磁珠	AXP	琥珀色	2	1200
洗脱缓冲液	EB	黑色	1	500
测序缓冲液	SB	红色	1	700
文库颗粒	LIB	粉色	1	600
文库溶液	LIS	白色管盖，粉色标签	1	600
测序芯片冲洗液	FCF	蓝色	6	1170
测序芯片系绳	FCT	紫色	1	200
快速连接条形码	RB01-24	透明	24	15

本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20°C 下储存（试剂稳定性将不受损害）。

名称	缩写	管盖颜色	管数	溶液体积 (μl)
快速测序文库接头	RA	绿色	2	15
接头缓冲液	ADB	透明	1	100
AMPure XP 磁珠	AXP	琥珀色	3	1200
洗脱缓冲液	EB	黑色	1	1500
测序缓冲液	SB	红色	1	1700
文库颗粒	LIB	粉色	1	1800
文库溶液	LIS	白色管盖，粉色标签	1	1800
测序芯片冲洗液	FCF	透明	1	15500
测序芯片系绳	FCT	紫色	2	200
快速连接条形码	RB01-96	-	3 盘	每孔 8 µl

本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20°C 下储存（试剂稳定性将不受损害）。

为获得最优产出，我们建议用户每次使用至少4种不同的条形码。如果您希望对少于4个样品进行测序，请确保将这些样品拆分连接到至少4种不同的条形码上：

• 如有一个样品，则将该样品拆分连接至四种条形码（如，对样品A使用条形码RB01-RB04，每个条形码需要200ng的起始gDNA样品）。
• 如有两个样品，则每个样品使用两种条形码（如，对样品A使用条形码RB01-RB02，对样品B使用条形码RB03-RB04）。
• 如有三个样品，则选取其中两个样品各与一种条形码连接，再将第三个样品拆分连接至两种条形码（如，将样品A和B分别与条形码RB01和RB02连接，对样品C使用条形码RB03和RB04）。

注意，每种条形码 所需的样本起始量为200ng gDNA。

如果您只有少量样本需要测序，可以考虑使用我们的快速建库测序试剂盒 V14（SQK-RAD114）。

对大多数测序实验，我们建议您使用文库颗粒（LIB）给测序芯片上样。然而，对于粘稠的文库，借助文库颗粒上样可能会比较困难，此时使用文库溶液（LIS）可能更为合适。

有关纳米孔数据分析的完整概述，包括碱基识别和次级分析，请参阅 数据分析 文档。

MinKNOW软件负责仪器控制，数据采集和实时碱基识别。如您已在计算机上安装MinKNOW，则可选择以下几种途径开展测序：

1. 使用计算机上的MinKNOW进行实时数据采集和碱基识别

请按照 MinKNOW 实验指南 的说明：从“开始测序”部分起，到“MinKNOW运行结束”部分止。

2. 使用GridION进行实时数据采集和碱基识别

请参照 GridION 用户手册 中的说明。

3. 使用MinION Mk1C测序仪进行实时数据采集和碱基识别

请参照 MinION Mk1C 使用指南中的说明。

4. 使用PromethION测序仪进行实时数据采集和碱基识别

请参照 PromethION 使用指南 或 PromethION 2 Solo 使用指南中的说明。

5. 使用计算机上的MinKNOW进行数据采集，过后再用NinKNOW进行线下碱基识别

请按照 MinKNOW 实验指南 中的说明：从“开始测序”部分起，到“MinKNOW运行结束”部分止。 当您设置实验参数时，请将 碱基识别 选项设为“关”。 测序实验结束后，请按照 MinKNOW 实验指南的本地分析 部分操作。

您可以选择以下几个途径来进一步分析经过碱基识别的数据：

1. EPI2ME 工作流程

Oxford Nanopore Technologies通过EPI2ME Labs平台提供了一系列针对高阶数据分析的生物信息学教程和工作流程。上述资源汇总于纳米孔社区的 EPI2ME Labs 板块。该平台通过描述性文字、生物信息学代码和示例数据，具象化地展示出我们的研究和应用团队发布在 GitHub 上的工作流程。

2. 科研分析工具

Oxford Nanopore Technologies的研发部门开发了许多分析工具，您可在Oxford Nanopore的 GitHub 资料库中找到。这些工具面向有一定经验的用户，并包含如何安装和运行软件的说明。工具以源代码形式提供，因此我们仅提供有限的技术支持。

3. 纳米孔社区用户开发的分析工具

如果以上工具仍无法为您提供解决研究问题的分析方法，请参考资源中心的生物信息学板块。该板块汇总了许多由纳米孔社区成员开发、且在Github上开源的、针对纳米孔数据的生信分析工具。请注意，Oxford Nanopore Technologies不为这些工具提供支持，也不能保证它们与测序所用的最新的化学试剂/软件配置兼容。

我们还在 Nanopore 社区的“Support”板块 提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮(support@nanoporetech.com)）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们。

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