Rapid sequencing DNA V14 - barcoding (SQK-RBK114.24 or SQK-RBK114.96)

Oxford Nanopore Technologies
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Protocol

Rapid sequencing DNA V14 - barcoding (SQK-RBK114.24 or SQK-RBK114.96) VRBK_9176_v114_revM_27Nov2022

  • This protocol uses genomic DNA
  • For multiplexing 1-96 samples
  • Library preparation time ~60 minutes
  • High yield
  • Fragmentation
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

This is an Early Access product For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

FOR RESEARCH USE ONLY

Overview

  • This protocol uses genomic DNA
  • For multiplexing 1-96 samples
  • Library preparation time ~60 minutes
  • High yield
  • Fragmentation
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

This is an Early Access product For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

Document version: RBK_9176_v114_revM_27Nov2022

1. Overview of the protocol

IMPORTANTE

Este es un producto de acceso anticipado

Para tener más información sobre los programas de acceso anticipado, consulte este artículo sobre las fases de lanzamiento del producto.

Procure usar la versión más reciente del protocolo.

Introduction to the Rapid Barcoding Kit V14 kits

This protocol describes how to carry out rapid barcoding of genomic DNA using the Rapid Barcoding Kit 24 and 96 V14 (SQK-RBK114.24 or SQK-RBK114.96). These kits use our most recent Kit 14 chemistry and are optimised for fast library preparation requiring minimal laboratory equipment.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity using the Input DNA/RNA QC protocol. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents.
  • Download the software for acquiring and analysing your data.
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run.

Library preparation

The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and stopping points.

Library preparation step Process Time Stop option
DNA barcoding Tagmentation of the DNA using the Rapid Barcoding Kit V14 15 minutes 4°C overnight
Sample pooling and clean-up Pooling of barcoded libraries and AMPure XP Bead clean-up 25 minutes 4°C overnight
Adapter ligation Attach the sequencing adapters to the DNA ends 5 minutes We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes

SQK-RBK110.96 gDNA workflow v1

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads.
  • Demultiplex the reads by barcode using MinKNOW, the Guppy software, or the barcoding workflow in EPI2ME.
IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

  • Rapid Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RBK114.24)
  • Rapid Barcoding Kit 96 V14 (SQK-RBK114.96)
  • R10.4.1 flow cells (FLO-MIN114)
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
  • Flow Cell Priming Kit V14 (EXP-FLP004)
  • Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003)
  • Rapid Adapter Auxiliary V14 (EXP-RAA114)
  • MinION Mk1C - MinION Mk1C IT requirements document
  • MinION Mk1B - MinION IT Requirements document

2. Equipment and consumables

Material
  • 200 ng gDNA per sample
  • Rapid Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RBK114.24) OR Rapid Barcoding Kit 96 V14 (SQK-RBK114.96)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Eppendorf™, cat # 0030129504) with heat seals
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora para celdas de flujo MinION
  • Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
  • Temporizador
  • Termociclador o termobloque
  • Gradilla magnética
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Cubeta con hielo
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P2
  • Multichannel pipette and tips

Rapid Barcode use requirements

Note: Ensure you are using the correct kit for your desired number of samples:

  • Rapid Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RBK114.24) contains barcodes RB01-24, allowing you to multiplex up to 24 samples.
  • Rapid Barcoding Kit 96 V14 (SQK-RBK114.96) contains barcodes RB01-96, allowing you to multiplex up to 96 samples.

For optimal output, we currently do not recommend using fewer than 4 barcodes. If you wish to multiplex less than 4 samples, please ensure you split your sample(s) across multiple barcodes so at least 4 barcodes are run (e.g. for 2 samples, use RB01-RB02 for sample A and RB03-RB04 for sample B). Please note that the required sample input for each barcode is 200 ng gDNA.

Alternatively, you might want to explore our Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114) for sequencing individual or small sets of samples.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en los primeros tres meses desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000

Rapid Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RBK114.24) contents

RBK114.24 tubes

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
Rapid Adapter RA Green 1 15
Adapter Buffer ADB Clear 1 100
AMPure XP Beads AXP Amber 2 1,200
Elution Buffer EB Black 1 500
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Flow Cell Flush FCF Blue 6 1,170
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200
Rapid Barcodes RB01-24 Clear 24 15

This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Rapid Barcoding Kit 96 V14 (SQK-RBK114.96) contents

RBK114.96 tubes (1)

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
Rapid Adapter RA Green 2 15
Adapter Buffer ADB Clear 1 100
AMPure XP Beads AXP Amber 3 1,200
Elution Buffer EB Black 1 1,500
Sequencing Buffer SB Red 1 1,700
Library Beads LIB Pink 1 1,800
Library Solution LIS White cap, pink label 1 1,800
Flow Cell Flush FCF Clear 1 15,500
Flow Cell Tether FCT Purple 2 200
Rapid Barcodes RB01-96 - 3 plates 8 µl per well

This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

3. Library preparation

Material
  • 200 ng gDNA per sample
  • Rapid Barcodes (RB01-24) or Rapid Barcode Plate (RB01-96)
  • Rapid Adapter (RA)
  • Adapter Buffer (ADB)
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
  • Elution Buffer (EB) (tampón de elución) del kit de Oxford Nanopore
Consumibles
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Eppendorf™, cat # 0030129504) with heat seals
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
  • Cubeta con hielo
  • Timer
  • Termociclador
  • Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
  • Gradilla magnética
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
  • P1000 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Multichannel pipette and tips

Minimum Rapid Barcode use requirements

For optimal output, we currently do not recommend using fewer than 4 barcodes. If you wish to multiplex less than 4 samples, please ensure you split your sample(s) across barcodes so a minimum of 4 barcodes are run:

  • For 1 sample, run your sample across 4 barcodes (e.g. RB01-RB04 using 200ng of sample A per barcode)
  • For 2 samples, run each sample across two barcodes. (e.g. RB01-RB02 for sample A and RB03-RB04 for sample B)
  • For 3 samples, run two samples individually and one across 2 barcodes. (e.g. RB01 and RB02 for sample A and B respectively, and RB03-RB04 for sample C)

Please note that the required sample input for each barcode is 200 ng gDNA.

Alternatively, you might want to explore our Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114) for sequencing individual or small sets of samples.

CHECKPOINT

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos se verifique la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.

Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.

Program the thermal cycler: 30°C for 2 minutes, then 80°C for 2 minutes.

Thaw kit components at room temperature, spin down briefly using a microfuge and mix by pipetting as indicated by the table below:

Reagent 1. Thaw at room temperature 2. Briefly spin down 3. Mix well by pipetting
Rapid Barcodes (RB01-24) or Rapid Barcode Plate (RB01-96) Not frozen ✓ ✓
Rapid Adapter (RA) Not frozen ✓ ✓
AMPure XP Beads (AXP) ✓ ✓ Mix by pipetting or vortexing immediately before use
Elution Buffer (EB) ✓ ✓ ✓
Adapter Buffer (ADB) ✓ ✓ Mix by vortexing

Prepare the DNA in nuclease-free water.

  1. Transfer 200 ng of genomic DNA per sample into 0.2 ml thin-walled PCR tubes or an Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind.
  2. Adjust the volume of each sample to 10 μl with nuclease-free water.
  3. Pipette mix the tubes for 10-15 times to avoid unwanted shearing
  4. Spin down briefly in a microfuge

In the 0.2 ml thin-walled PCR tubes or an Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, mix the following:

Reagent Volume per sample
Template DNA (200 ng from previous step) 10 μl
Rapid Barcodes (RB01-24 or RB01-96, one for each sample) 1.5 μl
Total 11.5 μl

Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting and spin down briefly.

Incubate the tubes or plate at 30°C for 2 minutes and then at 80°C for 2 minutes. Briefly put the tubes or plate on ice to cool.

Spin down the tubes or plate to collect the liquid at the bottom.

Pool all barcoded samples in a clean 2 ml Eppendorf DNA LoBind tube, noting the total volume.

Volume per sample For 4 samples For 12 samples For 24 samples For 48 samples For 96 samples
Total volume 11.5 µl 46 µl 138 µl 276 µl 552 µl 1,104 µl

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

IMPORTANTE

Ensure you have sufficient capacity in your reaction tube for all the reagents.

Limit the volume taken forward of pooled barcoded sample to 1,000 µl (i.e. half the capacity of the 2 ml Eppendorf DNA LoBind tube) to ensure feasibility of the next step.

Add an equal volume of resuspended AMPure XP Beads (AXP) to the entire pooled barcoded sample, and mix by flicking the tube.

. Volume per sample For 4 samples For 12 samples For 24 samples For 48 samples For 96 samples
Volume of AMPure XP Beads (AXP) added 11.5 µl 46 µl 138 µl 276 µl 552 µl 1,000 µl

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Prepare at least 2 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

Spin down the sample and pellet on a magnet. Keep the tube on the magnet, and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 1 ml of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Briefly spin down and place the tube back on the magnet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for 30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 15 µl Elution Buffer (EB) per 24 barcodes used.

. For 24 barcodes For 48 barcodes For 72 barcodes For 96 barcodes
Volume of Elution Buffer (EB) 15 µl 30 µl 45 µl 60 µl

Incubate for 10 minutes at room temperature.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Remove and retain the full volume of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

  • Remove and retain the eluate which contains the DNA library in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
  • Dispose of the pelleted beads
CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

Transfer 11 µl of the sample into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, dilute the Rapid Adapter (RA) as follows and pipette mix:

Reagent Volume
Rapid Adapter (RA) 1.5 μl
Adapter Buffer (ADB) 3.5 μl
Total 5 μl

Add 1 µl of the diluted Rapid Adapter (RA) to the barcoded DNA.

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Incubate the reaction for 5 minutes at room temperature.

Tip: While this incubation step is taking place you can proceed to the Flow Cell priming and loading section of the protocol.

FIN DEL PROCESO

The prepared library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice until ready to load.

4. Priming and loading the MinION and GridION Flow Cell

Material
  • Flow Cell Flush (FCF) (enjuague de celda de flujo)
  • Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
  • Sequencing Buffer (SB) (tampón de secuenciación)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora para celdas de flujo MinION
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE

Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).

CONSEJO

Cebado y carga de la celda de flujo

Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Uso de Library Solution (LIS)

En la mayoría de experimentos de secuenciación, recomendamos usar Library Beads (LIB) para cargar la biblioteca en la celda de flujo. Nótese, si previamente se ha usado agua para cargar la biblioteca, se deberá usar Library Solution (LIS) en su lugar. Nota: Algunos clientes han notado que las bibliotecas viscosas pueden cargarse con mayor facilidad cuando no se usan Library Beads (LIB).

Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

IMPORTANTE

Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.

Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).

To prepare the flow cell priming mix with BSA, combine the following reagents in a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Mix by inverting the tube and pipette mix at room temperature:

Reagents Volume per flow cell
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Final total volume in tube 1,205 µl

Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

Para abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizar la tapa en el sentido de las agujas del reloj.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:

  1. Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
  2. Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
  3. Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Cargar 800 μl de mezcla de cebado en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5 SPANISH

Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).

IMPORTANTE

Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.

En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.

En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Sequencing Buffer (SB) 37,5 µl
Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere 25,5 µl
Biblioteca de ADN 12 µl
Total 75 µl

Completar el cebado de la celda de flujo:

  1. Levantar suavemente la tapa del puerto de muestra SpotON.
  2. Cargar 200 µl de mezcla de cebado en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

Flow Cell Loading Diagrams Step 5

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5 SPANISH 2

Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.

Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.

Flow Cell Loading Diagram Step 07 V5 SPANISH

Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.

Step 8 update - SPANISH

Flow Cell Loading Diagrams Step 9 SPANISH

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, instale la pantalla protectora justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos poner la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:

  1. Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.

  2. Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised. SPANISH

ATENCIÓN

La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.

FIN DEL PROCESO

Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.

5. Data acquisition and basecalling

Aspectos generales del análisis de datos de nanoporos

Para obtener una descripción completa del análisis de datos de nanoporos, que incluya distintas posibilidades para el análisis de identificación y postidentificicación de bases, consultar el documento Data Analysis.

Cómo empezar a secuenciar

El programa MinKNOW realiza el control del dispositivo de secuenciación, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Una vez que el usuario ha instalado MinKNOW en su ordenador, hay diferentes maneras de llevar a cabo la secuenciación:

1. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el programa MinKNOW.

Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run".

2. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo GridION.

Seguir las instrucciones del manual de usuario de GridION.

3. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo MinION Mk1C.

Seguir las instrucciones del manual de usuario de MinION Mk1C.

4. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo PromethION.

Seguir las instrucciones de los manuales de usuario de PromethION o PromethION 2 Solo.

5. Adquisición de datos e identificación de bases posterior mediante MinKNOW.

Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run". Al configurar los parámetros del experimento, ajustar la pestaña Basecalling (Identificación de bases) en posición de APAGADO. Al terminar el experimento de secuenciación, seguir las instrucciones del apartado "Post-run analysis" del protocolo de MinKNOW.

6. Análisis posterior

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de identificación de bases:

1. Procesos de trabajo en EPI2ME

Para realizar un análisis de datos exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y procesos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, situados en la sección EPI2ME Labs de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los procesos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis

El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si en ninguno de los recursos anteriores se proporciona un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.

7. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

8. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <70 % Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

9. Problemas durante el experimento al utilizar un kit de secuenciación de base rápida

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Ocupación de poro por debajo del 40 %

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación de poro <40 % No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo Procurar cargar la concentración correcta de una biblioteca de buena calidad en una celda de flujo MinION Mk1B o GridION. Para comprobar la concentración requerida, consultar la sección Preparación de la biblioteca del protocolo. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular moles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, (opción "dsDNA: μg to pmol").
Ocupación de poro próxima a 0 Se utilizó el kit Rapid Sequencing Kit V14 o Rapid Barcoding Kit V14 y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN Seguir el protocolo paso a paso y utilizar los volúmenes y las temperaturas de incubación correctos. También se puede preparar una biblioteca de control con lambda para valorar la integridad de los reactivos.
Pore occupancy close to 0 No hay anclaje (tether) en la celda de flujo Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (vial FCT). No olvide añadir el anclaje (vial FCT) al tubo de enjuague de la celda de flujo (vial FCF) antes del cebado.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones:

1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Fluctuación de la temperatura

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector están bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo de secuenciación para asegurarse de que se encuentra a temperatura ambiente y con buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ.

Last updated: 4/3/2024

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