Direct RNA sequencing - sequence-specific (SQK-RNA004)

Oxford Nanopore Technologies
Document type icon

MinION: Protocol

Direct RNA sequencing - sequence-specific (SQK-RNA004) V DSS_9197_v4_revB_20Sep2023

This protocol:

  • is for selecting RNA targets of your choice for sequencing native RNA.
  • uses total RNA as starting input material.
  • requires no fragmentation.
  • takes ~2 hours for library preparation.

For Research Use Only

This is an Early Access product.

For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

FOR RESEARCH USE ONLY

概览

This protocol:

  • is for selecting RNA targets of your choice for sequencing native RNA.
  • uses total RNA as starting input material.
  • requires no fragmentation.
  • takes ~2 hours for library preparation.

For Research Use Only

This is an Early Access product.

For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.

Document version: DSS_9197_v4_revB_20Sep2023

1. Overview of the protocol

重要

本试剂盒为早期试用产品

如需有关早期试用计划的更多信息，请参阅 本文了解产品的不同发布阶段。

请确保您始终使用最新版本的实验指南。

直接RNA测序试剂盒的特点

我们强烈推荐有以下需求的用户使用该试剂盒：

  • 希望解析天然核糖核酸的碱基结构，如修饰碱基
  • 不希望引入逆转录或PCR偏倚
  • 转录本难以被逆转录

Introduction to the sequence-specific Direct RNA Sequencing protocol

This protocol describes how to carry out sequence-specific sequencing of native RNA using the Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004). Starting from total RNA, a second complementary cDNA strand is synthesised for stability by reverse transcription with a custom-ordered sequence targeted reverse transcription adapter. Sequencing adapters are then attached to the RNA-cDNA hybrid for sequencing on either MinION or PromethION RNA Flow Cells (FLO-MIN004RA / FLO-PRO004RA respectively). Please note, the complementary cDNA strand is not sequenced, but improves the RNA sequencing output.

This protocol is designed for sequencing specific RNA (e.g. 16 rRNA) but cannot target specific mRNA of interest. To proceed with this protocol, you will need to order custom oligos, including one that is complementary to the 3' end of the target RNA sequence. These oligos will replace the Reverse Transcription Adapter (RTA) normally used for direct RNA sequencing. For further information on how to design custom RTA, please see the Equipment and Consumables section. Below are the oligo sequences required, with the RNA 3' end-specific sequences in parenthesis:

Oligo A: 5’- /5PHOS/GGCTTCTTCTTGCTCTTAGGTAGTAGGTTC
Oligo B: 5’-GAGGCGAGCGGTCAATTTTCCTAAGAGCAAGAAGAAGCC(TTTTTTTTTT)

We recommend a control experiment using the RNA Control Strand (RCS) is completed first to become familiar with the technology.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your RNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell(s) to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and stopping points.

Library preparation Process Time Stop option
Reverse transcription Synthesise the complementary strand of the RNA with your custom-ordered adapter ~85 minutes At this stage the RT-RNA can be stored at -80°C for later use.

Please note, this is the only pause point in this protocol.
Adapter ligation and clean-up Attach the sequencing adapters to the RNA-cDNA hybrid ends 45 minutes Attach sequencing adapters to the ends of the RNA-cDNA hybrid.

We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes

Sequence specific RNA004 workflow resize

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and basecall the reads
重要

与DNA测序不同，RNA序列以3'端到5'端的方向通过纳米孔。然而，碱基识别算法会自动翻转数据，使得序列以5'-3'的方向显示。

重要

实验方案适用性

本实验方案只适用于与以下产品搭配使用：

2. Equipment and consumables

材料
  • 1 µg of total RNA in 8.5 µl
  • Custom-ordered sequence targeted reverse transcription adapter
  • 直接RNA测序试剂盒（SQK-RNA004）
耗材
  • Induro® 逆转录酶（NEB, M0681）
  • 10mM 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）溶液（例如 NEB，N0447）
  • NEBNext®快速连接反应缓冲液（NEB，B6058）
  • 2M U/ml 的T4 DNA连接酶（NEB，M0202M）
  • 小鼠RNase 抑制剂（NEB，M0314）
  • Agencourt RNAClean XP磁珠（Beckman Coulter™，A63987）
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • 新制备的70%乙醇（用无核酸酶水配制）
  • 0.2 ml 薄壁PCR管
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • Qubit RNA HS Assay（RNA高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32852）
  • Qubit 1x dsDNA BR Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q33265)
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
仪器
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 适用于1.5ml Eppendorf 离心管的磁力架
  • 迷你离心机
  • 涡旋混匀仪
  • 盛有冰的冰桶
  • 计时器
  • 热循环仪
  • Qubit荧光计 （或用于质控检测的等效仪器）
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2移液枪和枪头
  • Eppendorf 5424 离心机（或等效器材）

For this protocol, you will need 1 µg of total RNA in 8.5 µl

起始RNA

选择符合质量和浓度要求的起始RNA至关重要的。使用过少或过多的RNA，或者质量较差的RNA（如，高度碎片化、或含有化学污染物的RNA）都会影响文库制备。

有关如何对DNA样品进行质控，请参考起始DNA/RNA质控。

有关使用RNA作为起始材料的更多信息，请参阅以下链接：

您亦可在纳米孔社区的DNA/RNA Handling 页面找到上述文件。

Custom-ordered sequence targeted reverse transcription adapter sequence

The Reverse Transcription Adapter (RTA) supplied in the Direct RNA Sequencing kit is designed to ligate to any RNA with a poly(A) tail. However, users can customise their own RTA to target a specific RNA via the 3' end (for example, to only ligate to 16S rRNA). It is important to note that custom RTA can only target the 3’ end of RNA and cannot be used to enriched specific RNA with a poly(A) tail, see the picture below for more details.

RNA004 sequence specific ligation cartoon

To perform this protocol, you will need to order oligo A and a specific version of oligo B. In oligo B you will need to replace the 10(T) sequence with 10 bases complementary to the 3' end of your target RNA sequence. Both oligo A and oligo B are DNA.

Anneal oligo A and oligo B 1:1 at 1.4 µM in buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl) by heating to 95º C for 2 minutes and letting them cool down slowly (0.1º C/sec). This directly replaces RTA in the protocol.

Custom RTA

Sequences:
Oligo A: 5’- /5PHOS/GGCTTCTTCTTGCTCTTAGGTAGTAGGTTC
Oligo B: 5’-GAGGCGAGCGGTCAATTTTCCTAAGAGCAAGAAGAAGCC(TTTTTTTTTT)

Replace the 10(T) sequence with 10 bases complementary to the 3' end of your target RNA sequence. All oligos should be HPLC purified.

第三方试剂

Oxford Nanopore Technologies推荐您使用本实验指南中提及的所有第三方试剂，并已对其加以验证。我们尚未对其它替代试剂进行测试。

我们建议您按制造商说明准备待用的第三方试剂.

测序芯片质检

我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到MinION /GridION /PremethION测序芯片12周之内进行，或者在您收到Flongle测序芯片四周内进行。Oxford Nanopore Technologies会对活性孔数量少于以下标准的芯片进行替换** ：

测序芯片 芯片上的活性孔数确保不少于
Flongle 测序芯片 50
MinION/GridION 测序芯片 800
PromethION 测序芯片 5000

** 请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于Oxford Nanopore Technologies推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两天内递交给我们。请您按照 测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。

直接RNA测序试剂盒内容物（SQK-RNA004）：

SQK-RNA004 tubes LH edit

内容物 缩写 管盖颜色 管数 每管溶液体积 (μl)
逆转录接头 RTA 蓝色 1 10
RNA 连接接头 RLA 绿色 1 45
RNA 参照品 RCS 黄色 1 25
清洗缓冲液 WSB 橙色 2 1,200
RNA 洗脱缓冲液 REB 黑色 1 300
文库溶液 LIS 白色管盖，粉色标签 1 600
测序缓冲液 SB 红色 1 700
RNA 冲洗系绳 RFT 粉色 1 200
测序芯片冲洗液 FCF 白色 1 8,000

请注意： RNA CS（RCS）是校准链，其中包含自酿酒酵母saccharomyces cerevisiae 中提取的烯醇化酶II YHR174W。您可于 此处获取相关的酵母FASTA参考文件。

3. Library preparation

材料
  • 1 µg of total RNA in 8.5 µl
  • Custom-ordered sequence targeted reverse transcription adapter
  • 清洗缓冲液（WSB）
  • RNA连接接头（RLA）
  • RNA洗脱缓冲液（REB）
耗材
  • Agencourt RNAClean XP磁珠（Beckman Coulter™，A63987）
  • Induro 逆转录酶 和 5x Induro 逆转录反应缓冲液（NEB，M0681）
  • 10mM 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）溶液（例如 NEB，N0447）
  • NEBNext®快速连接反应缓冲液（NEB，B6058）
  • 2M U/ml 的T4 DNA连接酶（NEB，M0202M）
  • 小鼠RNase 抑制剂（NEB，M0314）
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • 新制备的70%乙醇（用无核酸酶水配制）
  • 0.2 ml 薄壁PCR管
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • Qubit 1x dsDNA HS Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q33230）
  • Qubit RNA HS Assay（RNA高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32852）
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
仪器
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 热循环仪
  • 磁力架
  • Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
  • 盛有冰的冰桶
  • P1000移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2移液枪和枪头

根据生产厂家的说明准备NEBNext®快速连接反应缓冲液和T4 DNA连接酶，并置于冰上：

  1. 于室温解冻试剂。

  2. 将各试剂瞬时离心5秒。

  3. 上下吹打各整管试剂10次，以确保充分混匀。请注意：切勿涡旋振荡 T4 DNA 连接酶。

NEBNext快速连接反应缓冲液内可能出现少量沉淀。待试剂回复至室温后，使用移液枪上下吹打数次，打散沉淀；然后涡旋振荡数秒，以确保试剂充分混合。

重要

此实验指南中，我们不推荐使用快速T4连接酶。我们发现T4 DNA连接酶（2M U/ml - NEB M0202M）效果更佳。使用时需要配合快速连接反应缓冲液（NEB B6058）。

Spin down the custom-ordered sequence targeted reverse transcription adapter and RNA Ligation Adapter (RLA), pipette mix and place on ice.

室温下解冻清洗缓冲液（WSB）和RNA洗脱缓冲液（REB），然后涡旋振荡混匀，随后瞬时离心，并将试剂置于冰上。

Prepare the RNA in nuclease-free water:

  • Transfer 1 µg of total RNA into a 0.2 ml thin-walled PCR tube.
  • Adjust the volume to 8.5 μl with nuclease-free water.
  • Mix thoroughly by flicking the tube to avoid unwanted shearing.
  • Spin down briefly in a microfuge.

In the same 0.2 ml thin-walled PCR tube, combine the reagents in the following order:

Reagent Volume
RNA 8.5 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer 3 µl
Murine RNase Inhibitor 1 µl
Custom-ordered reverse transcription adapter 1 µl
T4 DNA Ligase 1.5 µl
Total 15 µl

吹打混匀，并瞬时离心。

室温下孵育10 分钟。

在一支洁净的1.5ml DNA LoBind Eppendorf离心管中，混合下表中试剂，制备逆转录预混液：

试剂 体积
无核酸酶水 13 µl
10 mM dNTPs 2 µl
5x Induro 逆转录反应缓冲液 8 µl
总体积 23 µl

将预混液加入已连接逆转录接头的RNA 中（0.2ml PCR 管内），吹打混匀。

将2 μl Induro 逆转录酶加入反应体系中，吹打混匀。

将PCR管放入热循环仪中，于60℃下孵育30分钟，再于70℃下孵育10分钟，待样品降温至4℃后，进行下一步操作。

将样品转至干净的1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管中。

涡旋振荡以重悬Agencourt RNAClean XP 磁珠。

将72ul 重悬的AMPure RNAClean XP 磁珠加入逆转录反应体系中，用移液枪吹打混匀。

将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育5分钟。

准备200μl 新制备的70％乙醇（用无核酸酶水配制）。

将样品瞬时离心，并静置于磁力架上待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去上清液。

保持离心管在磁力架上不动，然后依照如下说明，以150μl新鲜制备的70%乙醇洗涤磁珠：

  1. 向离心管内加入150μl新鲜制备的70%乙醇，并确保磁珠在离心管的一侧聚集。
  2. 保持磁力架在实验台上不动，将含有磁珠的离心管旋转180°。
  3. 待磁珠向磁铁处移动并聚集后，再将离心管旋转180°（即离心管回到原位），并静置 至磁珠与液相分离。

用移液枪将70%乙醇小心吸走并弃掉。

瞬时离心，然后将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去残余的乙醇。

将离心管从磁力架上移开，将磁珠重悬于23μl 无核酸酶水中。在室温下孵育5分钟。

将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将此23µl洗脱液转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind管中。

可选操作

在此阶段，您可将RT-RNA存储在-80°C下以备后用。

请注意，这是本实验指南中唯一可以暂停的节点。

在同一支1.5ml Eppendorf DNA LoBind离心管中，将所有试剂按以下顺序混合：

试剂 体积
经过逆转录的RNA 23 µl
NEBNext 快速连接反应缓冲液 8 µl
RNA 连接接头（RLA） 6 µl
T4 DNA 连接酶 3 µl
总体积 40 µl

吹打混匀。

室温下孵育10 分钟。

涡旋振荡以重悬Agencourt RNAClean XP 磁珠。

将16 µl 重悬的Agencourt RNAClean XP 磁珠加入接头连接反应体系中，用移液枪吹打混匀。

将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育5分钟。

将样品瞬时离心，并静置于磁力架上5分钟，直到磁珠和液相分离。用移液枪吸去清液。

向磁珠中加入150 μl 清洗缓冲液（WSB）。盖上管盖，轻弹离心管以重悬磁珠。将离心管静置于磁力架上5分钟，直到磁珠与液相分离，吸走上清液。

重复上述步骤。

重要

加入清洗缓冲液后，与立即吸走清液相比，轻弹离心管重悬磁珠能更有效地去除游离的测序接头。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上，直到磁珠与液相分离。然后吸走残留的清洗缓冲液（WSB）。

将离心管从磁力架上移开。将磁珠重悬于13μl RNA 洗脱缓冲液（REB）中，轻弹离心管以混匀。室温下孵育10 分钟。

将离心管静置于磁力架上5分钟，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将13μl 洗脱液转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind 管中。

取1 μl 经过逆转录和接头连接的RNA，用Qubit DNA HS 荧光检测定量。

洗脱液中的目标回收量应高于30 ng。

不同起始材料和文库之间的回收量可能存在差异。我们建议您保留全部体积的RNA文库，以获得最佳的测序结果。

步骤结束

经过逆转录及接头连接的RNA即可用于测序芯片上样。

重要

请立即为RNA文库测序，切勿储藏待后续使用。

4. MinION和GridION测序芯片的预处理及上样

材料
  • 文库溶液（LIS）
  • 测序缓冲液（SB）
  • RNA 冲洗系绳（RFT）
  • 测序芯片冲洗液（FCF）
耗材
  • MinION 和 GridION测序芯片
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
  • MinION 或 GridION 测序仪
  • MinION 及GridION 测序芯片遮光片
  • P1000 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
重要

请注意：此试剂盒仅兼容RNA测序芯片（FLO-MIN004RA）。

提示

测序芯片的预处理及上样

我们建议所有新用户在首次运行测序芯片前，观看视频测序芯片的预处理及上样。

于室温下解冻测序缓冲液（SB）、文库溶液（LIS）、RNA冲洗系绳（RFT）和一管测序芯片冲洗液（FCF）。完全解冻后，涡旋振荡混匀，然后瞬时离心。

准备一支洁净的1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管，按下表制备测序芯片的预处理液。室温下涡旋振荡混匀，然后瞬时离心。

试剂 体积（每张芯片）
RNA 冲洗系绳 (RFT) 30 µl
测序芯片冲洗液 (FCF) 1,170 µl
总体积 1,200 µl

打开MinION或GridION测序仪的盖子，将测序芯片插入金属固定夹的下方。用力向下按压芯片，以确保正确的热、电接触。

中文-测序芯片预处理上样1a

中文-测序芯片预处理上样1b

可选操作

为文库上样前，完成测序芯片检测，查看可用孔数目。

如此前已对测序芯片进行过质检，则此步骤可省略。

更多信息，请查看MinKNOW实验手册的 测序芯片质检 部分。

顺时针转动预处理孔孔盖，使预处理孔显露出来。

中文-测序芯片预处理上样2

重要

从测序芯片中反旋排出缓冲液。请勿吸出超过20-30µl的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。

将预处理孔打开后，检查孔周围是否有小气泡。请按照以下方法，从孔中排出少量液体以清除气泡：

  1. 将P1000移液枪转至200µl刻度。
  2. 将枪头垂直插入预处理孔中。
  3. 反向转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在220-230 µl之间，或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。
    __请注意：__ 肉眼检查，确保从预处理孔到传感器阵列的缓冲液连续且无气泡。

中文-测序芯片预处理上样3

通过预处理孔向芯片中加入800µl预处理液，避免引入气泡。等待5分钟。在此期间，请按照以下步骤准备用于上样的DNA文库。

中文-测序芯片预处理上样4

在一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind离心管内，按下表制备待上样文库：

试剂 每张测序芯片的上样体积
测序缓冲液 (SB) 37.5 µl
文库溶液 (LIS) 25.5 µl
RNA 文库 12 µl
Total 75 µl

完成测序芯片的预处理：

  1. 轻轻地翻起SpotON上样孔盖，使SpotON上样孔显露出来。 中文-测序芯片预处理上样5
  2. 通过预处理孔（而 非 SpotON加样孔）向芯片中加入200µl预处理液，避免引入气泡。 中文-测序芯片预处理上样6

临上样前，用移液枪轻轻吹打混匀制备好的文库。

通过SpotON加样孔向芯片中逐滴加入75µl样品。确保液滴流入孔内后，再加下一滴。

中文-测序芯片预处理上样7

轻轻合上SpotON加样孔孔盖，确保塞头塞入加样孔内。逆时针转动预处理孔孔盖，盖上预处理孔。

中文-测序芯片预处理上样8

中文-测序芯片预处理上样9

重要

为获得最佳测序产出，在文库样本上样后，请立即在测序芯片上安装遮光片。

我们建议在清洗芯片并重新上样时，将遮光片保留在测序芯片上。一旦文库从测序芯片中吸出，即可取下遮光片。

按下述步骤安装测序芯片遮光片：

  1. 小心将遮光片的前沿（平端）与金属固定夹的边沿对齐。 请注意： 请勿将遮光片强行压到固定夹下方。

  2. 将遮光片轻轻盖在测序芯片上。遮光片的SpotON加样孔孔盖缺口应与芯片上的SpotON加样孔孔盖接合，遮盖住整个测序芯片的前部。

MinION加装遮光片

注意

MinION测序芯片的遮光片并非固定在测序芯片上，因此当为芯片加装遮光片后，请小心操作。

步骤结束

小心合上测序设备上盖并在MinKNOW上设置测序实验。

5. 数据采集和碱基识别

如何开始测序

在完成测序芯片的加样后，您即可在MinKNOW中启动测序实验。MinKNOW 软件负责仪器控制、数据采集以及实时碱基识别。有关设置和使用 MinKNOW 的详细信息，请参阅MinKNOW 实验指南。

您可以通过多种方式使用并设置MinKNOW：

  • 在直接或远程连接到测序设备的计算机上。
  • 直接在 GridION、MinION Mk1C 或 PromethION 24/48 测序设备上。

有关在测序设备上使用 MinKNOW 的更多信息，请参阅相应设备的用户手册：

在MinKNOW中启动测序：

1. 在 "开始 "（Start）页面上，选择 __开始测序__（Start Sequencing)。 start

2. 输入实验详情：例如实验名称，测序芯片位置及样本ID。 Grid start seq

3. 在"试剂盒"页面上，选择建库试剂盒。 kit selection

4. 配置测序实验参数，或保持“运行选项”和“分析”页面中的默认设置。

请注意： 如果在设置运行参数时关闭了碱基识别，您可在实验结束后，在MinKNOW中运行线下碱基识别。详情请参阅MinKNOW实验指南。

5. 在“输出”页面中，设置输出参数或保持默认设置。 step5c

6. 单击 "参数确认" 页面上的 开始 启动测序。 Step6

测序后数据分析

当于MinKNOW上完成测序后，您可按照“测序芯片的重复利用及回收”一节中的说明重复使用或返还测序芯片。

完成测序和碱基识别后，即可进行数据分析。有关碱基识别和后续分析选项的详细信息，请参阅数据分析文档。

在下游分析部分，我们将概述更多用于数据分析的选项。

6. 测序芯片的重复利用及回收

材料
  • 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）或测序芯片清洗试剂盒 XL（EXP-WSH004-XL）
重要

我们的测序芯片清洗试剂盒（EXP-WSH004 或 EXP-WSH004-XL）与 RNA 测序芯片和直接 RNA 测序试剂盒（SQK-RNA004）兼容。

但请注意：

  • 此清洗试剂盒不能在直接RNA测序中起到核酸酶冲洗作用，因此无法疏通堵塞的纳米孔。

  • 该试剂盒可用于冲洗测序芯片，以备新样本的上样：它能够清洗掉纳米孔阵列中的大部分文库，并去除残留样品中的全部接头，以避免序列被捕获并测序，从而使后续的文库上样成为可能。

完成测序实验后，如您希望再次使用测序芯片，请按照测序芯片清洗试剂盒的说明进行操作，并将清洗后的芯片置于2-8℃保存。

您可在纳米孔社区获取 测序芯片清洗试剂盒实验指南。

提示

我们建议您在停止测序实验后尽快清洗测序芯片。如若无法实现，请将芯片留在测序设备上，于下一日清洗。

请按照“回收程序”清洗好芯片，以便送回Oxford Nanopore。

您可在 此处找到回收测序芯片的说明。

请注意： 在将测序芯片寄回之前，请使用去离子水对每张芯片进行冲洗。

重要

如果您遇到问题或对测序实验有疑问，请参阅本实验指南在线版本中的“疑难解答指南”一节。

7. 下游分析

下游分析

您可以选择以下几个途径来进一步分析经过碱基识别的数据：

1. EPI2ME 工作流程

Oxford Nanopore Technologies通过EPI2ME Labs平台提供了一系列针对高阶数据分析的生物信息学教程和工作流程。上述资源汇总于纳米孔社区的 EPI2ME Labs 板块。该平台通过描述性文字、生物信息学代码和示例数据，具象化地展示出我们的研究和应用团队发布在 GitHub 上的工作流程。

2. 科研分析工具

Oxford Nanopore Technologies的研发部门开发了许多分析工具，您可在Oxford Nanopore的 GitHub 资料库中找到。这些工具面向有一定经验的用户，并包含如何安装和运行软件的说明。工具以源代码形式提供，因此我们仅提供有限的技术支持。

3. 纳米孔社区用户开发的分析工具

如果以上工具仍无法为您提供解决研究问题的分析方法，请参考资源中心的生物信息学板块。该板块汇总了许多由纳米孔社区成员开发、且在Github上开源的、针对纳米孔数据的生信分析工具。请注意，Oxford Nanopore Technologies不为这些工具提供支持，也不能保证它们与测序所用的最新的化学试剂/软件配置兼容。

8. RNA提取和文库制备过程中可能出现的问题

以下表格列出了常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的“Support”板块 提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮(support@nanoporetech.com)）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们。

低质量样本

现象 可能原因 措施及备注
RNA完整度低（RNA完整值（RIN）<9.5，或rRNA在电泳凝胶上的条带呈弥散状） RNA在提取过程中降解 请尝试其它 RNA 提取方法。您可在 RNA完整值专题技术文档 中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅 DNA/RNA 操作 页面。
RNA的片段长度短于预期 RNA在提取过程中降解 请尝试其它 RNA 提取方法。 您可在 RNA完整值专题技术文档中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅DNA/RNA 操作 页面。

我们建议用户在无RNA酶污染的环境中操作，并确保实验设备没有受RNA酶污染.

9. RNA测序过程中可能出现的问题

以下表格列出了常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的“Support”板块 提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮(support@nanoporetech.com)）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们。

Mux扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 纳米孔阵列中引入了气泡 在对通过质控的芯片进行预处理之前，请务必排出预处理孔附近的气泡。否则，气泡会进入纳米孔阵列对其造成不可逆转地损害。 视频中演示了避免引入气泡的最佳操作方法。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 测序芯片没有正确插入测序仪 停止测序，将芯片从测序仪中取出，再重新插入测序仪内。请确保测序芯片被牢固地嵌入测序仪中，且达到目标温度。如用户使用的是GridION/PromethION测序仪，也可尝试将芯片插入仪器的其它位置进行测序。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 文库中残留的污染物对纳米孔造成损害或堵塞 在测序芯片质检阶段，我们用芯片储存缓冲液中的质控DNA分子来评估活性纳米孔的数量。而在测序开始时，我们使用DNA文库本身来评估活性纳米孔的数量。因此，活性纳米孔的数量在这两次评估中会有约10%的浮动。

如测序开始时报告的孔数明显降低，则可能是由于文库中的污染物对膜结构造成了损坏或将纳米孔堵塞。用户可能需要使用其它的RNA提取或纯化方法，以提高起始核酸的纯度。您可在 污染物专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法 。

MinKNOW脚本失败

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示 "Script failed”（脚本失败）
重启计算机及MinKNOW。如问题仍未得到解决，请收集 MinKNOW 日志文件 并联系我们的技术支持。 如您没有其他可用的测序设备，我们建议您先将装有文库的测序芯片置于4°C 储存，并联系我们的技术支持团队获取进一步储存上的建议。

纳米孔利用率低于40%

现象 可能原因 措施及备注
纳米孔利用率<40% 测序芯片中的文库量不足 请确保您按照相应实验指南，向测序芯片中加入正确浓度和体积的测序文库。请在上样前对文库进行定量，并使用 NEBio 计算器 等工具中的“ RNA ss: mass to moles”功能来计算摩尔量。
纳米孔利用率接近0 测序芯片中无系绳 系绳（RFT）是随着预处理液加至芯片的。请确保您在制备预处理液时，按需将RNA冲洗系绳（RFT）加入测序芯片冲洗液（FCF）中。

大量纳米孔处于失活状态

现象 可能原因 措施及备注
大量纳米孔处于失活状态（在通道面板和纳米孔活动状态图上以浅蓝色表示。膜结构或纳米孔遭受不可逆转地损伤） 测序芯片中引入了气泡 在芯片预处理和文库上样过程中引入的气泡会对纳米孔带来不可逆转地损害。请观看 测序芯片的预处理及上样 视频了解最佳操作方法。
大量纳米孔处于失活/不可用状态 样本中含有污染物 您可在 污染物专题技术文档 中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法。

温度波动

现象 可能原因 措施及备注
温度波动 测序芯片和仪器接触不良 检查芯片背面的金属板是否有热垫覆盖。重新插入测序芯片，用力向下按压，以确保芯片的连接器引脚与测序仪牢固接触。如问题仍未得到解决，请联系我们的技术支持。

未能达到目标温度

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示“未能达到目标温度” 测序仪所处环境低于标准室温，或通风不良（以致芯片过热） MinKNOW会限定测序芯片达到目标温度的时间。当超过限定时间后，系统会显示出错信息，但测序实验仍会继续。值得注意的是，在错误温度下测序可能会导致通量和数据质量（Q值）降低。请调整测序仪的摆放位置，确保其置于室温下、通风良好的环境中后，再在MinKNOW中继续实验。有关MinION MK1B温度控制的更多信息，请参考此 FAQ （常见问题）文档。

Last updated: 7/31/2024

Document options

MinION