Ligation sequencing V14 — Human cfDNA singleplex (SQK-LSK114)

Oxford Nanopore Technologies
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PromethION: Protocol

Ligation sequencing V14 — Human cfDNA singleplex (SQK-LSK114) V CFS_9207_v114_revC_15May2024

Method outlining sample extraction, library preparation, sequencing and data analysis. This protocol:

  • uses human cfDNA
  • is for singleplex sequencing
  • is compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

抂芁

Method outlining sample extraction, library preparation, sequencing and data analysis. This protocol:

  • uses human cfDNA
  • is for singleplex sequencing
  • is compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: CFS_9207_v114_revC_15May2024

1. Overview of the protocol

Introduction to the singleplex human cfDNA sequencing protocol

This protocol describes how to carry preparation and sequencing of a human cfDNA sample using the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114). Typically, we obtain ~50 Gb of aligned data (15x coverage) for human cfDNA samples processed with this protocol.

Prior to library preparation, the sample extraction is carried out using the QIAGEN QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit and following our Human blood cell-free DNA (cfDNA) extraction for singleplex sequencing method.

Note: We recommend that blood samples are processed while fresh, as we have observed potential gDNA contamination arising from blood that has been stored in certain types of collection tubes.

For more information on the development and performance of this method, please refer to our Updated method for cell-free DNA (cfDNA) methylation profiling know-how document. An additional know-how document is also available for the optimisation of library preparation for longer cell-free DNA (cfDNA).

Steps in the workflow

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Sample preparation

Using the outlined extraction method, extract the cfDNA from your human blood sample, and quantify the DNA:


Library preparation

The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and optional stopping points.

Library preparation Process Time Stop option
DNA repair and end-prep Repair the cfDNA and prepare the DNA ends for adapter attachment 125 minutes 4°C overnight
Adapter ligation and clean-up Attach the sequencing adapters to the DNA ends 20 minutes 4°C short-term storage or for repeated use, such as re-loading your flow cell
-80°C for single-use, long-term storage.
We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software which will collect raw data from the device and basecall reads.
  • (Optional) Raw sequencing data can be basecalled and aligned to a reference using dorado.
  • (Optional) Start the EPI2ME software and select a bioinformatics workflow to analyse your data. Alternatively, external tools can be used to further analyse and explore your data.
重芁

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

材料
  • (FOR EXTRACTION) 10 ml of human blood in EDTA K2 vacuum tube, or 3–5 ml of plasma
  • (FOR LIBRARY PREPARATION) 15–30 ng extracted human cfDNA per sample
  • Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
消耗品
  • PromethION Flow Cell
  • QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit (QIAGEN, 55284)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module (NEB, E7360)
  • NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • Ethanol, 100% (e.g. Fisher, 16606002)
  • Isopropanol
  • ヌクレアヌれフリヌ氎で甚事調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • 5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 15 ml Falcon tubes
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチュヌブ
装眮
  • PromethION device
  • PromethION Flow Cell Light Shield
  • Centrifuge with capacity for 5 ml and 15 ml tubes, and a swing out and fixed angle rotors
  • Hula mixer緩やかに回転するミキサヌ
  • Magnetic rack for 15 ml tubes
  • 1.5 ml゚ッペンドルフチュヌブに最適のマグネット匏ラック
  • Thermomixer, or other shaker for microcentrifuge tubes, with capacity to heat at 56°C
  • 小型遠心機
  • ボルテックスミキサヌ
  • サヌマルサむクラヌ
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットずチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
  • P2 ピペットずチップ
  • アむスバケツ氷入り
  • タむマヌ
  • Qubit蛍光光床蚈たたはQCチェックのための同等品
重芁

The above list of materials, consumables, and equipment is for the extraction method in the sample preparation section, as well as the library preparation section of the protocol. If you have pre-extracted sample(s), you will only require the materials for the library preparation section of this protocol.

For this protocol, the following inputs are required:

Input requirements per sample for the extraction method:

  • 10 ml of fresh human blood in EDTA K2 vacuum tube, or 3–5 ml of plasma

Note: We recommend that blood samples are processed while fresh, as we have observed potential gDNA contamination arising from blood that has been stored in certain types of collection tubes.


Input requirements per sample for the library preparation:

  • 15–30 ng extracted human cfDNA

むンプットDNA

むンプットDNAのQC方法

むンプットDNAの量ず品質の芁件を満たすこずが重芁です。DNAの䜿甚量が少なすぎたり倚すぎたり、あるいは品質の䜎いDNA䟋ずしおDNAが非垞に断片化されおいたり、RNAや化孊汚染物質が含たれおいる堎合などを䜿甚するず、ラむブラリヌの調補に圱響を及がす可胜性がありたす。

DNAサンプルの品質管理の方法に぀いおは、Input DNA/RNA QC protocolのプロトコルをご芧ください。

コンタミネヌション

DNAの抜出する方法によっおは、粟補DNAに特定の化孊汚染物質が残留する可胜性があり、ラむブラリ調補の効率やシヌク゚ンシングの品質に圱響を及がす可胜性がありたす。コンタミネヌションに぀いおの詳现は、コミュニティヌの Contaminants page をご芧ください。

サヌドパヌティヌ詊薬

このプロトコヌルで䜿甚されおいるすべおのサヌドパヌティヌ詊薬は、圓瀟が怜蚌し、䜿甚を掚奚しおいるものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以倖の詊薬を甚いたテストは行っおいたせん。

すべおのサヌドパヌティ補詊薬に぀いおは、補造元の指瀺に埓っお䜿甚の準備をするこずをお勧めしたす。

フロヌセルのチェックをしおください

シヌク゚ンシング実隓を開始する前に、フロヌセルのポアの数を確認するこずを匷くお勧めしたす。このフロヌセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの堎合は代理店ぞの到着から週間以内に行っおください。たたはFlongle Flow Cellの堎合は代理店ぞの到着から4週間以内に行う必芁がありたす。Oxford Nanopore Technologiesは、フロヌセルチェックの実斜から2日以内に結果が報告され、掚奚される保管方法に埓っおいた堎合に、以䞋の衚に蚘茉されおいるナノポアの有効数に満たさない堎合には、フロヌセルを亀換したす。 フロヌセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指瀺に埓っおください。

Flow cell 保蚌する最小有効ポア数以䞋の数未満のフロヌセルが亀換察象ずなりたす
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000
重芁

ラむゲヌションアダプタヌLAのラむゲヌション効率を高めるため、NEBNext Quick Ligation Module に付属しおいるリガヌれバッファヌではなく、Ligation Sequencing Kit V14 に付属のラむゲヌションバッファヌLNBのご䜿甚を匷くお勧めしたす。

重芁

本キットおよびプロトコヌルに含たれるラむゲヌションアダプタヌLAは、他のシヌク゚ンシングアダプタヌずの互換性はありたせん。

Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) のコンテンツ

泚 珟圚のキットの容噚を倉曎しおいたす。今たでは実隓毎に䜿い捚おのシングルナヌズチュヌブを䜿甚しおいたしたが、バッファヌ単䜍のボトル容噚に倉曎しおいたす。

シングルナヌスチュヌブの堎合: SQK-LSK114 v2

ボトル容噚の堎合: SQK-LSK114 v3

泚 本補品には、Beckman Coulter、Inc.補のAMPure XP詊薬が含たれおおり、詊薬の安定性を損なうこずなくキットず共に-20 ° Cで保存するこずができたす。

泚 DNA Control SampleDCSは3.6kbのアンプリコンで、Lambda genomeの3'末端をマッピングしたプレップコントロヌルです。

3. Sample extraction method for singleplex sequencing of human cfDNA

材料
  • 10 ml of fresh human blood in EDTA K2 vacuum tube, or 3-5 ml of plasma
消耗品
  • QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit (QIAGEN, 55284)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • Ethanol, 100% (e.g. Fisher, 16606002)
  • Isopropanol
  • nuclease-free waterで調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat # AM9937)
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • 5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 15 ml Falcon tubes
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装眮
  • Centrifuge with capacity for 5 ml and 15 ml tubes, and a swing out and fixed angle rotors
  • Microfuge
  • Hula mixer緩やかに回転するミキサヌ
  • Magnetic rack for 15 ml tubes
  • Magnetic rack
  • ボルテックスミキサヌ
  • P1000 pipette and tips
  • P100 ピペットずチップ
  • Thermal cycler
  • Ice bucket with ice
  • Qubit fluorometer (or equivalent for QC check)
オプション装眮
  • Agilent Femto Pulse System (or equivalent for read length QC)

Optimised extraction: Human blood cell-free DNA (cfDNA) extraction for singleplex sequencing

This extraction method can also be found in the Extraction Protocols tab in the Documentation space on the Nanopore Community: Human blood cell-free DNA (cfDNA) extraction for singleplex sequencing.

These instructions describe a method to extract cell-free DNA (cfDNA) from human blood samples collected in EDTA K2 vacuum tubes (step 1), or human plasma (step 3). Once samples have undergone the necessary centrifugation steps, the extraction is performed using the QIAGEN QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit.

Note: The yield, DIN and sequencing read length of extracted DNA may vary depending on initial sample quality. Please ensure you are following the correct method and using high-quality sample inputs.

オプショナルステップ

Alternatively, if you have previously extracted and stored your cfDNA sample(s), this can be used directly in the Library preparation section of this protocol.

重芁

We recommend that blood samples are processed while fresh, as we have observed potential gDNA contamination arising from blood that has been stored in certain types of collection tubes.

Preparation of plasma from fresh blood

Centrifuge 10 ml of fresh blood (overnight chilled delivery) in the EDTA K2 vacuum tube at 1,900 x g for 10 minutes at 4°C in a swing out rotor centrifuge.

Pipette and transfer the supernatant (this is the plasma fraction) to a fresh 5 ml DNA LoBind Eppendorf tube.

The volume should be around 3.5–4 ml.

To remove residual cells from the plasma, centrifuge the plasma at 16,000 x g for 10 minutes (or 6,000 x g for 30 minutes depending on the spin capacity of the centrifuge) at 4°C, in a fixed angle rotor.

重芁

It is important to remove residual cells from the sample when the blood/plasma is still fresh (from an overnight chilled delivery). Failing to do so will result in increased amounts of gDNA contamination in the sequencing library.

Aspirate the supernatant and transfer it to a fresh 15 ml tube.

Purification of cfDNA from 3–5 ml serum or plasma Using the QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit

Before starting the extraction:

  • Prepare a shaker for microcentrifuge tubes at room temperature for use in step 14.
  • Preheat a second shaker at 56°C for use in step 26. (Alternatively, equilibrate the first shaker to 56°C after step 14).
  • Resuspend Magnetic Bead Suspension (from the QIAGEN QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit) by pulse-vortexing for 1 min.
    Note: Do not let the suspension settle for more than 2 min before use. Pipette from the centre of the suspension.

Prepare the buffers for extraction:

  • Add 8 ml isopropanol (100%) to 12 ml Buffer ACB concentrate to obtain 20 ml Buffer ACB. Mix well after adding isopropanol.
  • Add 30 ml ethanol (96–100%) to 13 ml Buffer ACW2 concentrate to obtain 43 ml Buffer ACW2. Mix well after adding ethanol.

Mix the following components according to the instructions below in a 15 ml tube:

Component Volume for 3 ml plasma (µl) Volume for 4 ml plasma (µl) Volume for 5 ml plasma (µl)
Plasma 3,000 4,000 5,000
Magnetic Bead Suspension 90 120 150
Proteinase K 165 220 275
Bead Binding Buffer 450 600 750
Total volume 3,705 4,940 6,175

Incubate the reaction for 10 min at room temperature while shaking (at a slow speed) end-over-end.

Spin the tube down briefly (30 seconds at 200 x g) to remove any solution in the cap.

Place the tube containing bead solution into a magnetic rack for 15 ml tubes. Let the tube stand for at least 1 min, until the solution is clear.

Remove and discard supernatant.

Remove the tube from the magnetic rack and add 200 µl of Bead Elution Buffer to the bead pellet. Vortex to resuspend beads, and pipette up and down to mix and rinse residual beads from the tube wall.

Transfer the full volume of mixture (including the beads) into a Bead Elution Tube.

Incubate for 5 min on a shaker for microcentrifuge tubes at room temperature and 300 rpm.

Note: If the same shaker for microcentrifuge tubes is to be used in step 26, remove the tubes after the room temperature incubation and equilibrate the shaker to 56°C

Place the Bead Elution Tube containing the bead solution into a magnetic rack for 2 ml tubes. Let the tube stand for at least 1 min, until the solution is clear.

Transfer the supernatant into a new Bead Elution tube. Discard the bead pellet.

Avoid transferring any magnetic beads in this step. Carryover may result in reduced cfDNA yield.

Add 300 µl Buffer ACB to the Bead Elution tube containing the supernatant, and vortex to mix. Briefly centrifuge the tube to remove drops from inside the lid.

Pipet the supernatant–Buffer ACB mixture from the previous step into a QIAamp UCP MinElute column.

Centrifuge for 1 min at 6,000 x g.

Place the QIAamp UCP MinElute column into a clean 2 ml collection tube, and discard the flow-through.

Add 500 µl Buffer ACW2 to the QIAamp UCP MinElute column.

Centrifuge for 1 min at 6,000 x g.

Place the QIAamp UCP MinElute column into a clean 2 ml collection tube, and discard the flow-through.

Centrifuge the QIAamp UCP MinElute column at 20,000 x g for 3 min.

Place the QIAamp UCP MinElute column into a new 1.5 ml elution tube and discard the 2 ml collection tube.

Open the lid of the tube and incubate the assembly in a shaker for microcentrifuge tubes at 56°C for 3 min to dry the membrane completely.

Carefully pipet 50 µl of ultra-clean water into the centre of the membrane. Close the lid and incubate at room temperature for 1 min.

Centrifuge at 20,000 x g for 1 min to elute the DNA.

To maximise yield from the elution: Place the QIAamp UCP MinElute column in a clean 1.5 ml elution tube. Aspirate the eluate from the previous step and reload it onto the centre of the membrane. Close the lid and incubate 1 min at room temperature.

Centrifuge at 20,000 x g for 1 min to elute the DNA.

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

From 3.5–4 ml of plasma, you can expect a yield of between 15–30 ng cfDNA.

オプショナルステップ

We recommend that the fragment length profiles of extracted cfDNA samples are analysed using a Femto Pulse (Agilent), or equivalent:

Frag length femtopulse cfDNA singleplex extract

Fragment length profile of extracted cfDNA, run on a Femto Pule (Agilent). This example shows the characteristic nucleosome peaks with minimal gDNA contamination.

最終ステップ

Take forward 15–30 ng of extracted human cfDNA to the library preparation stage of the protcol.

4. DNA repair and end-prep

材料
  • 15–30 ng extracted human cfDNA per sample
  • AMPure XP Beads (AXP)
消耗品
  • NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module (NEB, E7360)
  • NEBNext® Ultra II End Repair / dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • ヌクレアヌれフリヌ氎で甚事調敎した 80% ゚タノヌル溶液
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチュヌブ
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装眮
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
  • 小型遠心機
  • サヌマルサむクラヌ
  • Hula mixer緩やかに回転するミキサヌ
  • マグネットラック
  • アむスバケツ氷入り
オプション装眮
  • Qubit蛍光光床蚈たたはQCチェックのための同等品

Prepare the NEBNext FFPE DNA Repair Mix, the NEBNext FFPE DNA Repair Buffer v2 and NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer’s instructions, and place on ice.

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Flick and/or invert the reagent tubes to ensure they are well mixed.
    Note: Do not vortex the FFPE DNA Repair Mix, NEB Thermoliable Proteinase K or Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The FFPE DNA Repair Buffer v2 may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for 30 seconds to solubilise any precipitate.
    Note: It is important the buffers are mixed well by vortexing.

  5. The FFPE DNA Repair Buffer v2 may have a yellow tinge and is fine to use if yellow.

Prepare the DNA in nuclease-free water:

  1. Ensure you have 15–30 ng of extracted cfDNA from the sample extraction, and transfer this into a 0.2 ml thin-walled PCR tube.

  2. Adjust the volume to 46 ÎŒl with nuclease-free water.

  3. Mix thoroughly by pipetting up and down, or by flicking the tube.

  4. Spin down briefly in a microfuge.

In the 0.2 ml thin-walled PCR tube containing your cfDNA, mix the following:

Reagent Volume
cfDNA from the previous step 46 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer v2 7 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix v2 2 µl
Total 55 µl

反応液を完党に混合するために、ゆっくりずピペッティングし短時間スピンダりンしお䞋さい。

Using a thermal cycler with a heated lid set to 50°C, incubate the reaction at 37°C for 15 minutes and hold at 4°C.

Remove the reaction from the thermal cycler and place the tube on ice.

Keeping the tube on ice, add 2 µl of NEBNext Thermolabile Proteinase K directly to the repaired reaction mixture.

Mix by pipetting 10 times, followed by spinning down quickly to collect all liquid from the sides of the tube.

Using a thermal cycler with a heated lid set to 75°C, incubate at 37°C for 15 minutes and 65°C for 5 minutes, then hold at 4°C.

Remove the reaction from the thermal cycler and place the tube on ice.

Keeping the tube on ice, add 3 µl of NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix directly to the reaction mixture for a total volume of 60 µl.

Mix by pipetting 10 times, followed by spinning down quickly to collect all liquid from the sides of the tube.

Using a thermal cycler with a heated lid set to 75°C, incubate at 20°C for 30 minutes and 65°C for 30 minutes, then hold at 4°C.

AMPure XP ビヌズAXPをボルテックスで懞濁したす。

DNA サンプルを枅朔な 1.5 ml ゚ッペンドルフ DNA LoBind チュヌブに移しおください。

Add 180 µl of resuspended the AMPure XP Beads (AXP) to the end-prep reaction and mix by flicking the tube.

Hula mixer緩やかに回転するミキサヌで5分間むンキュベヌトしたす垞枩。

Prepare 1 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

チュヌブをスピンダりンした埌、マグネットラック䞊で、䞊枅が無色透明になるたで眮きたす。チュヌブを磁石の䞊に眮いたたた、䞊枅をピペットで取り陀いおいきたす。ピペットを䜿甚しお゚タノヌルを陀去し 、 廃棄しおください。

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 300 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

前のステップを繰り返したす。

スピンダりンし、チュヌブをマグネットの䞊に戻したす。残った゚タノヌルをピペットで取り陀きたす。ペレットを30 秒間皋也かしたす。 ただし、 ペレットにひびが入るたでは也燥させないでください。

チュヌブをマグネットラックから取り出し、ペレットを61ÎŒlのヌクレアヌれフリヌ 氎に懞濁したす。宀枩で2分間むンキュベヌトしたす。

溶出液が無色透明になるたで、少なくずも1分間マグネット䞊でビヌズをペレット化したす。

61ÎŒlの溶出液を陀去し、枅朔な1.5ml゚ッペンドルフDNA LoBindチュヌブに保持したす。

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

Note: You should expect to recover approximately 75% of your input mass. For example, from 30 ng of cfDNA, a yield of approximately 20–25 ng is expected.

最終ステップ

Take forward the repaired and end-prepped cfDNA into the adapter ligation step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

5. Adapter ligation and clean-up

材料
  • Ligation Adapter (LA)
  • Ligation Buffer (LNB)
  • Short Fragment Buffer (SFB)
  • AMPure XP Beads (AXP)
  • Elution Buffer (EB)
消耗品
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装眮
  • マグネットラック
  • 小型遠心機
  • ボルテックスミキサヌ
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットずチップ
  • P20 ピペットずチップ
  • P10 ピペットずチップ
  • Qubit蛍光光床蚈たたはQCチェックのための同等品
重芁

掚奚の他瀟補リガヌれligaseには専甚のバッファヌが付属しおいたすが、Ligation Sequencing Kitに付属のLigation Buffer (LNB)を䜿甚した方が、Ligation Adapter (LA)のラむゲヌション効率が高くなりたす。

Spin down the Ligation Adapter (LA) and Quick T4 Ligase, and place on ice.

ラむゲヌションバッファヌ(LNB)を宀枩で融解し、スピンダりンしおピペッティングで混合したす。粘性が高い為、この緩衝液をボルテックスするのは効果的ではないです。解凍しお混ぜたら、すぐに氷の䞊に眮いおください。

溶出バッファヌEBを宀枩で融解し、ボルテックスで混合したす。その埌、スピンダりンしお氷の䞊に眮きたす。

Thaw the Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

In a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, mix in the following order:

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent Volume
DNA sample from the previous step 60 µl
Ligation Adapter (LA) 5 µl
Ligation Buffer (LNB) 25 µl
NEB Quick T4 DNA Ligase 10 µl
Total 100 µl

反応液を完党に混合するために、ゆっくりずピペッティングし短時間スピンダりンしお䞋さい。

反応液を宀枩で10分間むンキュベヌトしたす。

AMPure XP ビヌズAXPをボルテックスで懞濁したす。

Add 120 µl of resuspended AMPure XP Beads (AXP) to the reaction and mix by flicking the tube.

Hula mixer緩やかに回転するミキサヌで5分間むンキュベヌトしたす垞枩。

サンプルをスピンダりンし、マグネット䞊でペレット化したす。チュヌブをマグネットの䞊に眮き、無色透明になったら䞊枅をピペットで取り陀きたす。

Wash the beads by adding 250 ÎŒl of Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.

Note: Take care when removing the supernatant, the viscosity of the buffer can contribute to loss of beads from the pellet.

前のステップを繰り返したす。

スピンダりンし、チュヌブをマグネットの䞊に戻したす。残った䞊枅をピペットで取り陀きたす。ペレットを30 秒間皋也かしたす。 ただし、 ペレットにひびが入るたでは也燥させないでください。

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 33 µl Elution Buffer (EB). Spin down and incubate for 10 minutes at room temperature.

溶出液が無色透明になるたで、少なくずも1分間マグネット䞊でビヌズをペレット化したす。

Remove and retain 33 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Dispose of the pelleted beads

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

Note: You should expect to recover approximately 35-50% of input mass. For example, from 30 ng cfDNA a yield of 10-15 ng of adapter ligated library is expected.

最終ステップ

調補されたラむブラリヌは、フロヌセルぞのロヌドに䜿甚されたす。ラむブラリヌは、ロヌドの準備ができるたで氷䞊、たたは4℃で保存しお䞋さい。

ヒント

掚奚のラむブラリヌ保存方法

短期間の保存や繰り返し䜿甚する堎合は__䟋　フロヌセルをりオッシュしお再床ロヌドする堎合は、ラむブラリヌをEppendorf DNA LoBindチュヌブに入れ、__4℃で保存 するこずをお勧めしたす。 __3か月以䞊の長期保存の堎合は、____ラむブラリヌをEppendorf DNA LoBindチュヌブに -80 ° Cで保存 するこずをお勧めしたす。

6. Priming and loading the PromethION Flow Cell

材料
  • Sequencing Buffer (SB)
  • Library Beads (LIB)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Flow Cell Flush (FCF)
消耗品
  • PromethION Flow Cell
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装眮
  • PromethION 2 Solo device
  • PromethION sequencing device
  • PromethION Flow Cell Light Shield
  • P1000 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • P20 pipette and tips
重芁

This method is only compatible with R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M).

Thaw the Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB), Flow Cell Tether (FCT) and Flow Cell Flush (FCF) at room temperature before mixing by vortexing. Then spin down and store on ice.

フロヌセルプラむミングミックスを調補するには、フロヌセルテザヌFCTずフロヌセルフラッシュFCFを以䞋の指瀺通りに混合しおください。その埌に、宀枩でボルテックスしお混合しおください。

泚 珟圚、䜿い捚おチュヌブを䜿甚したキットをボトル型にフォヌマット倉曎䞭です。ご䜿甚のキットのフォヌマットに埓っおください。

シングルナヌスチュヌブの堎合: 30ÎŒlのFlow Cell TetherFCTをFlow Cell FlushFCFチュヌブに盎接加えおください。

ボトルフォヌマットの堎合: フロヌセルの数に適したチュヌブに、以䞋の詊薬を入れおくださいs:

è©Šè–¬ フロヌセルあたりの容量
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
合蚈 1,200 µl
重芁

冷蔵庫からフロヌセルを取り出した埌にフロヌセルが宀枩に戻るたで20分埅っおからPromethIONに差し蟌んでください。湿床の高い環境ではフロヌセルに結露が生じるこずがありたす。フロヌセルの䞊面ず䞋面にある金色のコネクタヌピンに結露がないかを点怜し、結露が確認された堎合はリントフリヌのりェットティッシュで拭き取っおください。フロヌセル䞋面にヒヌトパッド黒いパッドがあるこずを確認しおください。

PromethION 2 Soloの堎合、フロヌセルは以䞋のようにセットしたす

  1. フロヌセルを金属プレヌトの䞊に平らに眮きたす。

  2. フロヌセルを、金色のピンたたは緑色の基板が芋えなくなるたでドッキングポヌトにスラむドさせたす。

J2068 FC-into-P2-animation V5

PromethION 24/48 の堎合は、フロヌセルをドッキングポヌトにセットしたす

  1. フロヌセルずコネクタヌを氎平および垂盎に䞊べおから、所定の䜍眮にスムヌズに挿入しおください。
  2. フロヌセルをしっかりず抌し䞋げ、ラッチがかみ合い、カチッず音がしお所定の䜍眮に収たるこずを確認したす。

Step 1a V3

Step 1B

重芁

フロヌセルを誀った角床で挿入するず、PromethIONのピンが損傷し、シヌケンス結果に圱響を及がす可胜性がありたす。PromethIONのピンが損傷しおいる堎合は、support@nanoporetech.com たでご連絡ください。

Screenshot 2021-04-08 at 12.08.37

むンレットポヌトカバヌを時蚈回りにスラむドさせお開きたす。

Prom loading 2

重芁

フロヌセルからバッファヌを匕き䞊げる際には泚意しおください。2030ÎŒl以䞊は陀去せず、ポアのアレむ党䜓が垞にバッファヌで芆われおいるこずを確認しお䞋さい。アレむに気泡が入るず、ポアに䞍可逆的なダメヌゞを䞎える可胜性がありたす。

むンレットポヌトを開けた埌、少量ず぀匕き戻しお気泡を取り陀きたす

  1. P1000ピペットチップを200µlにセットしたす。
  2. チップをむンレットポヌトに挿入したす。
  3. ダむダルが220230µlを瀺すたで、たたはピペットチップに少量のバッファ ヌが入るのが確認できるたで、ホむヌルを回したす。

Step 3 v1

気泡が入らないように、500 µl のプラむミングミックスをむンレットポヌトからフロヌセルに泚入し、分間埅ちたす。この間に、プロトコヌルの次のステップでラむブラリヌをロヌドする準備をしおください。

Step 4 v1

Library Beads(LIB)の液をピペッティングするこずで十分に混合しお䞋さい。

重芁

Library BeadsLIBチュヌブにはビヌズの懞濁液が入っおいたす。これらのビヌズはすぐに沈殿するので、䜿甚盎前に混合するこずが重芁です。

ほずんどのシヌケンス実隓にはLibrary Beads LIBの䜿甚を掚奚したす。しかし、より粘性の高いラむブラリヌにはLibrary SolutionLISを䜿っおください。

In a new 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare the library for loading as follows:

Reagent Volume per flow cell
Sequencing Buffer (SB) 100 µl
Library Beads (LIB) thoroughly mixed before use 68 µl
DNA library 32 µl
Total 200 µl

Note: The prepared library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice or at 4°C until ready to load.

500ÎŒlのプラむミングミックスをむンレットポヌトにゆっくりず泚入し、フロヌセルのプラむミングを完了したす。

Step 5 v1

調補したラむブラリヌは、ロヌドする盎前にピペッティング混合しお䞋さい。

P1000ピペットを䜿甚しお、むンレットポヌトに200µlのラむブラリヌを泚入したす。

Step 6 v1

むンレットポヌトを密閉するためにバルブを閉じたす。

Step 7 V2

重芁

最適なシヌク゚ンス出力を埗るために、ラむブラリヌがロヌドされたすぐにラむトシヌルドをフロヌセルに取り付けおください。

ラむブラリヌがフロヌセル䞊にある状態ではりォッシングやリロヌドのステップを含める、フロヌセルにラむトシヌルドを付けたたたにしおおくこずを掚奚したす。ラむトシヌルドは、ラむブラリヌがフロヌセルから陀去された時点で取り倖すこずができたす。

ラむトシヌルドがフロヌセルから取り倖されおいる堎合は、以䞋のようにラむトシヌルドを取り付けたす

  1. ラむトシヌルドずむンレットポヌトをフロヌセルのむンレットポヌトカバヌに合わせたす。ラむトシヌルドの前瞁をフロヌセルIDの䞊に䜍眮するようにしたす。
  2. ラむトシヌルドをむンレットポヌトカバヌの呚囲にしっかりず抌し付けたす。むンレットポヌトクリップがむンレットポヌトカバヌの䞋にカチッずはたるようになっおいたす。

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8a FAW

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8b FAW

最終ステップ

MinKNOWでシヌケンスランを開始する準備ができたら、PromethIONの蓋を閉めおください。

フロヌセルをPromethIONにロヌドした埌、実隓を開始する前に最䜎10分間埅ちたす。この埅ち時間があるこずで、よりシヌケンス出力が向䞊したす。

7. Data acquisition and basecalling

重芁

Ensure you are using the most recent version of MinKNOW.

We recommend updating MinKNOW to the latest version prior to starting a sequencing run for the best sequencing results.

For more information on updating MinKNOW, please refer to our MinKNOW protocol.

How to start sequencing

Once you have loaded your flow cell, the sequencing run can be started on MinKNOW, our sequencing software that controls the device, data acquisition and real-time basecalling.

Please ensure MinKNOW is installed on your computer or device. Further instructions for setting up a sequencing run can be found in the MinKNOW protocol.

Please ensure when setting up a sequencing run you are using the recommendations outlined below. All other parameters can be left to their default settings.

MinKNOW can be used and set up to sequence in multiple ways:

  • On a computer either direcly or remotely connected to a sequencing device.
  • Directly on a PromethION 24/48 sequencing device.

For more information on using MinKNOW on a sequencing device, please see the device user manuals:

Open the MinKNOW software using the desktop shortcut and log into the MinKNOW software using your Community credentials.

Click on your connected device.

prom 48

Set up a sequencing run by clicking Start sequencing.

Edit 1

Type in the experiment name, select the flow cell postition and enter sample ID. Choose FLO-PRO114M flow cell type from the drop-down menu.

Click Continue to kit selection.

Flow cell selection

Select the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114).

An expansion kit does not need to be selected.

Click Continue to Run Options to continue.

kit selection

Set the run options to a 72 hour run length and 20 bp minimum read length.

Click Continue to basecalling to continue.

Set the run options to a 72 hour run length and 20 bp minimum read length

Set up basecalling using the following parameters:

  1. Ensure the basecalling is switched ON.
  2. Next to "Models", click Edit options and choose High accuracy basecaller (HAC) from the drop-down menu.
  3. Ensure barcoding is OFF.

Click Continue to output and continue.

Set up basecalling using the following parameters

Keep the output format and filtering options to their default settings.

Click Continue to final review to continue.

Keep the output format and filtering options to their default settings

Click Start to start sequencing.

You will be automatically navigated to the Sequencing Overview page to monitor the sequencing run.

Click Start to start sequencing

Data analysis after sequencing

After sequencing has completed on MinKNOW, the flow cell can be reused or returned, as outlined in the Flow cell reuse and returns section.

After sequencing and basecalling, the data can be analysed, as outlined in the Downstream analysis section.

8. Downstream analysis

Bioinformatics analysis

If basecalling is not performed during live sequencing, raw sequencing data (.POD5 format) can be processed post-sequencing.

This can be achieved using the tool Dorado, which enables basecalling and subsequent alignment to a reference genome.

Dorado can also detect modified bases by using the modified-bases option (e.g. --modified-bases 5mCG_5hmCG). This will integrate methylation tags directly into the aligned BAM file. We also recommend applying a minimum QScore cutoff (--min-Qscore <min_QScore>), which serves as a quality control measure to ensure only high-quality reads are used in downstream processes.


1. The command below demonstrates how to initiate basecalling with Dorado, followed by sorting, and indexing the output using Samtools. Please see the Dorado documentation here for further details. 

Dorado basecaller <model> <input_POD5> --reference <REF> --min-qscore <min_QScore> 
| samtools sort -o <OUTPUT_BAM> - && samtools index <OUTPUT_BAM>

For example to SUP basecall with 5mCG and 5hmCG detected in CpG context, and with a QScore filter of 10 we can use: 

Dorado basecaller sup --modified-bases 5mCG_5hmCG input.pod5 --reference ref.fasta --min-qscore 10 
| samtools sort -o output.bam > - && samtools index output.bam

2. It is also recommended to remove reads that have a poor alignment score i.e. 10. This can be achieved as follows: 

samtools view -q <min_map_q> -bh -o <OUTPUT_BAM> <INPUT_BAM> && samtools index -@ <threads> <OUTPUT_BAM>

3. The output from Dorado basecaller can be demultiplexed into per-barcode BAMs using Dorado demux. E.g. 

Dorado demux --output-dir <output-dir> --no-classify <input-bam>

4. You may optionally omit methylation information from read ends using modkit adjust-mods or modkit tools with --edge-filter option. This may help increase methylation call precision, as the very end of reads, approximately 27 bases, may suffer from loss in methylated bases due to the chemistry used to repair ends in library preparation (see our know-how document for further details). 

modkit adjust-mods --edge-filter 0 27 <IN_BAM> <OUTPUT_BAM>

The modified .bam file can be used with external tools that use a .bam file as input for further data analysis and exploration.

Post-basecalling analysis

There are several options for further analysing your basecalled data:

1. EPI2ME workflows

For in-depth data analysis, Oxford Nanopore Technologies offers a range of bioinformatics tutorials and workflows available in EPI2ME. The platform provides a vehicle where workflows deposited in GitHub by our Research and Applications teams can be showcased with descriptive texts, functional bioinformatics code and example data.

2. Research analysis tools

Oxford Nanopore Technologies' Research division has created a number of analysis tools, which are available in the Oxford Nanopore GitHub repository. The tools are aimed at advanced users, and contain instructions for how to install and run the software. They are provided as-is, with minimal support.

3. Community-developed analysis tools

If a data analysis method for your research question is not provided in any of the resources above, please refer to the resource centre and search for bioinformatics tools for your application. Numerous members of the Nanopore Community have developed their own tools and pipelines for analysing nanopore sequencing data, most of which are available on GitHub. Please be aware that these tools are not supported by Oxford Nanopore Technologies, and are not guaranteed to be compatible with the latest chemistry/software configuration.

9. フロヌセルの再利甚ず返华

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

シヌク゚ンス実隓終了埌、フロヌセルを再利甚する堎合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコヌルに埓い、掗浄したフロヌセルを28℃で保管しおください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティヌで入手できたす。

ヒント

運転を停止したらできるだけ早くフロヌセルをりォッシュするこずをお勧めしたす。しかし、これが䞍可胜な堎合はフロヌセルをデバむスに入れたたた、翌日にりォッシュをしお䞋さい。

たたは、返送手順に埓っお、オックスフォヌド・ナノポアに返送しおください。

フロヌセルの返华方法は hereをご芧ください。

(泚 補品を返华する前に、すべおのフロヌセルを脱むオン氎で掗浄する必芁がありたす。

重芁

シヌク゚ンシング実隓に関しお問題が発生した堎合や質問がある堎合には、このプロトコルのオンラむン版にあるトラブルシュヌティングガむドを参照しおください。

10. DNA/RNA抜出、およびラむブラリ調補時の問題点

以䞋は、最もよく起こる問題のリストであり、いく぀かの原因ず解決策が提案されおいたす。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご甚意しおいたす。

ご提案された解決策を詊しおも問題が解決しない堎合は、テクニカルサポヌトに電子メヌル (support@nanoporetech.com)たたは LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

サンプルの品質が䜎い

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
DNAの玔床が䜎いDNAのOD 260/280のナノドロップ枬定倀が1.8未満およびOD 260/230が2.02.2未満 DNA抜出で必芁な玔床が埗られおいない 借雑物の圱響は、 Contaminants に瀺されおいたす。コンタミネヌションをもたらさないために別の抜出方法extraction method をお詊しください。.

远加のSPRIクリヌンアップステップの実斜を怜蚎しお䞋さい。
䜎いRNA むンテグリティヌRNA Integrity Number: <9.5 RIN、たたはrRNAバンドがゲル䞊でスメアになっおいる 抜出䞭にRNAが分解された 別のRNA抜出方法 RNA extraction methodを詊しおください。RINの詳现に぀いおは、 RNA Integrity Number の資料を参照しおください。詳现に぀いおは、 DNA/RNA Handling のペヌゞをご芧ください。
RNAのフラグメントが予想より短い 抜出䞭にRNAが分解された 別のRNA抜出方法 RNA extraction methodを詊しおください。 RINの詳现に぀いおは、 RNA Integrity Number の資料を参照しおください。詳现に぀いおは、DNA/RNA Handling のペヌゞをご芧ください。

RNAを扱う際には、RNaseフリヌの環境で䜜業し、実隓噚具もRNaseフリヌにしおおくこずをお勧めしたす。

AMPureビヌズクリヌンアップ埌のDNA回収率が䜎い

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
䜎回収率 AMPureビヌズずサンプルの比率が予想しおいたのよりも䜎いこずによるDNAの損倱 1. AMPureビヌズはすぐに沈降するため、サンプルに添加する前によく再懞濁させおください。

2. AMPureビヌズ察サンプル比が0.4:1未満の堎合、どのようなサむズのDNA断片でもクリヌンアップ䞭に倱われたす。
䜎回収率 DNA断片が予想よりも短い サンプルに察するAMPureビヌズの比率が䜎いほど、短い断片に察する遞択が厳しくなりたす。 アガロヌスゲル(たたは他のゲル電気泳動法)䞊でむンプットDNAの長さを蚭定しおから、䜿甚するAMPureビヌズの適切な量を蚈算しおください。 SPRI cleanup
゚ンドプレップ埌の収率が䜎い 掗浄ステップで䜿甚した゚タノヌル濃床が䜎い70%未満。 ゚タノヌルが70%未満の堎合、DNAは掗浄䞭にビヌズから溶出されたす。必ず正しい濃床の゚タノヌルを䜿甚しおください。

11. シヌク゚ンス実行䞭の問題

以䞋は、最もよく起こる問題のリストであり、いく぀かの原因ず解決策が提案されおいたす。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご甚意しおいたす。

ご提案された解決策を詊しおも問題が解決しない堎合は、テクニカルサポヌトに電子メヌル (support@nanoporetech.com)たたは LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

シヌク゚ンス開始時のポアがフロヌセルチェック埌よりも少ない堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 ナノポアアレむに気泡が入っおしたった。 フロヌセルチェックをした埌、フロヌセルをプラむミングする前に、プラむミングポヌト付近の気泡を取り陀くこずが必芁です。 気泡を取り陀かないず、気泡がナノポアアレむに移動し、空気に觊れたたナノポアが䞍可逆的なダメヌゞを負った可胜性がある。これを防ぐための最適な方法が、 this videoで玹介されおいたす。
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 フロヌセルがデバむスに正しく挿入されおいない。 シヌク゚ンスランを停止し、フロヌセルをシヌク゚ンス装眮から取り出したす。次に再床フロヌセルを挿入し、装眮にしっかりず固定され、目暙枩床に達しおいるこずを確認したす。GridIONやPromethIONの堎合は別のフロヌセルの䜍眮をお詊しください。
MinKNOWのフロヌセルチェックで確認されたポアの数より、シヌク゚ンシング開始時のポア数が少なく衚瀺された。 ラむブラリヌ内の汚染物質がポアを倱掻させたり塞いだりしおいる。 フロヌセルチェックの際のポア数は、フロヌセル保存バッファヌ䞭のQC甚のDNA分子を甚いお蚈枬されたす。シヌク゚ンシングの開始時は、ラむブラリ自䜓を䜿甚しおアクティブなポア数を掚定したす。このため、フロヌセルチェックずRun開始時のポア数は、玄10皋床の倉動が起こりたす。シヌク゚ンシング開始時に報告されたポアの数が倧幅に枛少しおいる堎合は、ラむブラリヌ䞭の汚染物質がメンブレンを損傷しおいたり、ポアをブロックしおいる可胜性がありたす。むンプット材料の玔床を向䞊させるために、別のDNA/RNA抜出たたは粟補方法が必芁ずなる堎合がありたす。コンタミネヌションの圱響は、Contaminants Know-how pieceを参照にしお䞋さい。借雑物を陀去するために別の抜出方法extraction method をお詊しください。

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可胜性のある原因 解決策ずコメント
MinKNOW に 「Script failed」ず衚瀺されおいる"
コンピュヌタヌを再起動し、MinKNOWを再起動したす。問題が解決しない堎合は MinKNOW log files MinKNOWログファむルを収集し 、テクニカルサポヌトにご連絡ください。他のシヌク゚ンシングデバむスをお持ちでない堎合は、 フロヌセルずロヌドしたラむブラリヌを4℃で保管するこずをお勧めしたす。詳现な保管方法に぀いおは、テクニカルサポヌトにお問い合わせください。

ポア占有率が40%未満

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
ポアの占有率が40%以䞋 フロヌセルに十分なラむブラリヌがロヌドされおいなかった。 シヌク゚ンシングラむブラリヌを正確に濃床枬定し、適切な容量がフロヌセルにロヌドされおいるこずを確認しおください(詳しくはそれぞれのプロトコヌルをご芧ください)。 ロヌドする前にラむブラリヌを定量し、 Promega Biomath Calculatorなどのツヌルを䜿甚しおfmolを蚈算しおください。[dsDNA: µ g to fmol]を遞択しおください。
ポア占有率が0に近い Ligation Sequencing Kitを䜿甚したが、シヌク゚ンシングアダプタヌはDNAにラむゲヌションしなかった。 シヌク゚ンシングアダプタヌのラむゲヌションステップでは、必ずNEBNext Quick Ligation ModuleE6056ずOxford Nanopore Technologies Ligation BufferLNB、シヌク゚ンスキットに付属されおいたす。を䜿甚し、各詊薬の量を適切に䜿甚しおください。サヌドパヌティ詊薬の完党性をテストするために、Lambdaのコントロヌルラむブラリヌを調補するこずもできたす。
ポア占有率が0に近い シヌク゚ンシングアダプタヌラむゲヌション埌の掗浄工皋で、LFBたたはSFBの代わりに゚タノヌルを䜿甚しおしたった。 ゚タノヌルはシヌク゚ンシングアダプタヌ䞊のモヌタヌタンパク質を倉性させる可胜性がありたす。シヌク゚ンシングアダプタヌのラむゲヌション埌にLFBたたはSFBバッファヌを䜿甚したこずを確認しお䞋さい。
ポア占有率が0に近い フロヌセルにテザヌがない テザヌはフロヌセルのプラむミング時に远加されたすキット9、10、11はFLTチュヌブ、キット14はFTUを䜿甚。りルトラロングのDNAキットにはFTUを䜿甚。 プラむミングの前に、FLT/FCT/FTUがバッファヌキット9、10、11はFB、キット14はFCFに添加されおいるこずを確認しおください。

予想より短いリヌド長

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
予想より短いリヌド長 DNAサンプルの䞍芁な断片化 読み取り長はサンプルDNA断片の長さを反映したす。サンプルDNAは、抜出およびラむブラリヌ調補䞭の操䜜で断片化した可胜性がありたす。

1. 抜出の最適な方法に぀いおは、Extraction Methods の抜出方法を参照しおください。

2. ラむブラリヌ調補に進む前に、アガロヌスゲル電気泳動で、サンプルDNAのフラグメント長の分垃を確認しおください。 DNA gel2 䞊の画像では、サンプル1は高分子量ですが、サンプル2は断片化されおいたす。

3. ラむブラリヌ調補䞭は、詊薬を混合するためのピペッティングやボルテックス操䜜は、プロトコルで指瀺がないかぎり行わないでください。

利甚できないポアの割合が倚い堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
利甚できないポアの割合が倧きいチャンネルパネルずポアのアクティブポヌトで青く衚瀺されおいたす

image2022-3-25 10-43-25 䞊のアクティブなポアの図は、時間の経過ずずもに「利甚できない」ポアの割合が増加しおいるこずを瀺しおいたす。		 サンプル内に䞍玔物が含たれおいる 䞀郚のポアに吞着する䞍玔物は、MinKNOWに組み蟌たれたポアのブロック解陀機胜によっお、ポアから陀去するこずができたす。 このステップが完了するず、ポアの状態が「sequencing pore」に戻りたす。利甚できないポアの郚分が倚いか、増加した堎合:

1.Flow Cell Wash Kit nuclease flush using the Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) を甚いお、ヌクレアヌれ掗浄を 行うこずができたす。又は
2. PCRを数サむクル実行しおサンプルDNAの量を増やし、サンプルDNAに含たれる問題の䞍玔物が盞察的に枛る垌釈されるようにしたす。

Inactiveのポアの割合が高い

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
利甚できない(inactive/unavailable)ポアの割合が高いチャネルパネルずポアアクティブポヌトでは氎色で衚瀺されおいたすポアたたは膜に損傷が起きおしたった。 気泡がフロヌセルに混入した。 フロヌセルのプラむミングやラむブラリヌのロヌドで気泡が入るず、ポアに䞍可逆的なダメヌゞを䞎える可胜性がありたす。 掚奚の操䜜方法に぀いおは、Priming and loading your flow cell のビデオをご芧ください。
利甚できないポアの割合が倚い堎合 サンプルDNAに含たれる䞍玔物 既知の化合物問題で、サンプルDNAに倚糖類が含たれた事で、怍物のゲノムDNAず結合しポアをブロックした。

1. 怍物葉DNA抜出法 Plant leaf DNA extraction methodをご参照ください。
2. QIAGEN PowerClean Pro キットを䜿甚しおクリヌンアップしお䞋さい。
3. QIAGEN REPLI-g kit.キットを䜿甚しお、元のgDNAサンプルで党ゲノム増幅を実行したす。
利甚できないポアの割合が倚い堎合 サンプル内に䞍玔物が含たれおいる 䞍玔物の圱響は、 Contaminants の ノりハりを参照しお䞋さい。 サンプルDNAに䞍玔物を残留させないために別の抜出方法をお詊しください。

枩床倉動

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
枩床倉動 フロヌセルずデバむスの接続が途切れおいる。 フロヌセルの背面にある金属プレヌトを芆っおいるヒヌトパッドがあるこずを確認しおください。 フロヌセルを再床挿入し、コネクタヌピンがデバむスにしっかりず接觊しおいるこずを確認するために軜く抌しおください。問題が解決しない堎合は、テクニカルサヌビスにご連絡しおください。

目暙枩床に到達しない堎合

問題点 予想される原因 解決策ずコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目暙枩床に達しなかった)ず衚瀺する。" 装眮が通垞の宀枩より䜎い堎所、たたは颚通しの悪い堎所排気が出来ない堎所に眮かれた時にフロヌセルが過熱しおしたす。 MinKNOWでは、フロヌセルが目暙枩床に到達するたでの既定の時間枠がありたす。時間枠を超えるず、゚ラヌメッセヌゞが衚瀺され、シヌク゚ンシング実隓が続行されたす。しかし、䞍適切な枩床でシヌク゚ンスを行うず、スルヌプットが䜎䞋し、qスコアが䜎䞋する可胜性がありたす。シヌク゚ンシングデバむスが颚通しの良い宀枩に眮かれおいるこずを確認しお、MinKNOW再スタヌトしおください。MinION Mk 1Bの枩床制埡の詳现に぀いおは、FAQ を参照しおください。

Last updated: 8/20/2024

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