Ligation sequencing gDNA V14 - Adeno-associated virus sequencing (SQK-NBD114.24)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Ligation sequencing gDNA V14 - Adeno-associated virus sequencing (SQK-NBD114.24) V AAV_9194_v114_revF_13Dec2024

Sequencing of adeno-associated virus (AAV) vectors.

  • Requires the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
  • Includes no PCR steps
  • Uses up to 24 barcodes
  • Allows analysis of native DNA
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

概要

Sequencing of adeno-associated virus (AAV) vectors.

  • Requires the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
  • Includes no PCR steps
  • Uses up to 24 barcodes
  • Allows analysis of native DNA
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: AAV_9194_v114_revF_13Dec2024

1. Overview of the protocol

Introduction to the adeno-associated virus sequencing protocol

This end-to-end protocol describes how to extract recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors using the PureLink™ Viral RNA/DNA Mini extraction kit before sequencing using the Native Barcoding Sequencing Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24). We have also included an optional annealing step post-extraction, however, we have found higher amounts of full-length inverted terminal repeat (ITR) sequences when the annealing step has been skipped before library preparation. Flushing steps have also been included as we recommend washing the flow cell to restore pores and to load a fresh library to continue sequencing.

The Know-How document is available for further details about the protocol optimisations and best practices.

Note: This protocol is currently validated to barcode up to six AAV samples for sequencing on a single flow cell.

Sequencing of the rAAV vectors enables the validation of vectors to ensure the transgene and promoter of interest are present, as well as identifying truncated rAAV genomes and any contamination. Validation is crucial in gene therapy to ensure the correct rAAV genomes are packaged into cells before therapeutic use.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents.
  • Download the software for acquiring and analysing your data.
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run.

Experiment workflow

Protocol step Process Time Stop option
DNAseI treatment Perform DNAseI treatment of the rAAV lysates to remove any non-encapsidated DNA from the rAAV preparations 35 minutes -
DNA extraction from rAAV Extract the rAAV vectors using the PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit 45 minutes –80°C for long-term storage
Annealing (Optional) Self-anneal any remaining (+) and (-) single strands of rAAV vector 80 minutes -
End-prep Prepare the DNA ends for adapter attachment 20 minutes 4°C overnight
Native barcode ligation Ligate the native barcodes to the DNA ends 60 minutes 4°C overnight
Adapter ligation and clean-up Ligate sequencing adapters to the DNA ends 50 minutes 4°C for short-term storage or for repeated use, such as for reloading your flow cell
–80°C for long-term storage
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell 5 minutes

AAV workflow updated v4

Sequencing

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software which will collect raw data from the device and basecall reads in real-time. The reads will also be demultiplexed in MinKNOW.
  • Start the EPI2ME software and use the wf-aav-qc workflow for analysis.
重要

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

材料
  • 2.6 x10^10 GC of rAAV per sample
  • Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
消耗品
  • MinionとGridIONのFlow Cell
  • PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit (Thermo Fisher, 12280050)
  • Qubit™ ssDNA Assay Kit (ThermoFisher, Q10212)
  • Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
  • NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
  • DNase I (NEB, M0303)
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
  • 50X annealing buffer (2.5 M NaCl, 500 mM Tris-HCl, pH 7.5)
  • Ethanol, 100% (e.g. Fisher, 16606002)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • MinIONかGridION のデバイス
  • MinIONとGridIONのFlow Cell ライトシールド
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
  • Microfuge
  • Magnetic rack
  • ボルテックスミキサー
  • サーマルサイクラー
  • Multichannel pipette and tips
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）
  • Eppendorf 5424 centrifuge (or equivalent)
  • タイマー
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットとチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 ピペットとチップ
  • アイスバケツ（氷入り）
オプション装置
  • Nanodrop spectrophotometer

This protocol requires 2.6 x10^10 GC of recombinant adeno-associate virus (rAAV) per sample.

A minimum of 2.6 x10^10 GC of rAAV per sample has been trialled across six barcodes.

We recommend estimating genome copy number per ml (GC/ml) and to standardise rAAV inputs prior to DNAseI treatment. Droplet digital PCR (ddPCR) or qPCR are commonly used to quantify AAV vector genome numbers in titres.

サードパーティー試薬

このプロトコールで使用されているすべてのサードパーティー試薬は、当社が検証し、使用を推奨しているものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以外の試薬を用いたテストは行っていません。

すべてのサードパーティ製試薬については、製造元の指示に従って使用の準備をすることをお勧めします。

フローセルのチェックをしてください

シークエンシング実験を開始する前に、フローセルのポアの数を確認することを強くお勧めします。このフローセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの場合は代理店への到着から１２週間以内に行ってください。またはFlongle Flow Cellの場合は代理店への到着から4週間以内に行う必要があります。Oxford Nanopore Technologiesは、フローセルチェックの実施から2日以内に結果が報告され、推奨される保管方法に従っていた場合に、以下の表に記載されているナノポアの有効数に満たさない場合には、フローセルを交換します。 フローセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指示に従ってください。

Flow cell 保証する最小有効ポア数（以下の数未満のフローセルが交換対象となります）
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000
重要

We do not recommend mixing barcoded libraries with non-barcoded libraries prior to sequencing.

Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) contents

Note: We are in the process of reformatting the barcodes provided in this kit into a plate format. This will reduce plastic waste and will facilitate automated applications.

Plate format

SQK-NBD114.24 plate format

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
DNA Control Sample DCS Yellow 2 35
Native Adapter NA Green 1 40
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Elution Buffer EB Black 2 500
AMPure XP Beads AXP Clear cap, light teal label 1 6,000
Long Fragment Buffer LFB Orange 1 1,800
Short Fragment Buffer SFB Clear 1 1,800
EDTA EDTA Blue 1 700
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200
Native Barcode plate NB01-24 - 2 plates, 3 sets of barcodes per plate 5 µl per well

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.


Vial format

SQK-NBD114.24 bottle format

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
Native Barcodes NB01-24 Clear 24 (one per barcode) 20
DNA Control Sample DCS Yellow 2 35
Native Adapter NA Green 1 40
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Elution Buffer EB Black 2 500
AMPure XP Beads AXP Clear cap, light teal label 1 6,000
Long Fragment Buffer LFB Orange 1 1,800
Short Fragment Buffer SFB Clear 1 1,800
EDTA EDTA Blue 1 700
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.

To maximise the use of the Native Barcoding Kits, the Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) and the Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) expansion packs are available.

These expansions provide extra library preparation and flow cell priming reagents to allow users to utilise any unused barcodes for those running in smaller subsets.

Both expansion packs used together will provide enough reagents for 12 reactions. For customers requiring extra EDTA to maximise the use of barcodes, we recommend using 0.25 M EDTA and adding 4 µl for library preps using the SQK-NBD114.24 kit and 2 µl for preps using the SQK-NBD114.96 kit.

Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) contents:

EXP-NBA114 tubes

Note: This Product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) contents:

EXP-AUX003 bottles

3. DNAseI treatment

材料
  • 2.6 x10^10 GC of rAAV per sample
消耗品
  • DNase I (NEB, M0303)
  • 0.5 M EDTA (Fisher Scientific, 11568896)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装置
  • サーマルサイクラー
  • Extraction hood
  • Microfuge
  • Ice bucket with ice
  • P1000 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • P100 pipette and tips
  • P20 pipette and tips

DNAseI treatment is carried out before extraction to remove any non-encapsidated DNA from the rAAV preparations.

Thaw the DNaseI reaction buffer and rAAV lysates (if they have been stored in the freezer) at room temperature and place on ice.

重要

The following steps with rAAV samples should be carried out in an extraction hood to avoid contamination.

Prepare each rAAV sample in nuclease-free water:

  1. Transfer ≥2.6 x10^10 GC of AAV sample into a 1.5 ml Eppendord DNA LoBind tube.
  2. Adjust the volume to 170 µl with nuclease-free water.
  3. Mix by pipetting up and down.
  4. Spin down briefly in a microfuge.

Combine the following reagents in the 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube for each sample.

Reagent Volume
rAAV sample (≥2.6 x10^10 GC per sample) 170 µl
DNAseI reaction buffer 20 µl
DNAseI 10 µl
Total 200 µl

反応液を完全に混合するために、ゆっくりとピペッティングし短時間スピンダウンして下さい。

Using a thermal cycler, incubate at 37°C for 10 minutes.

Add 2 µl of 0.5 M EDTA to each sample and mix thoroughly by pipetting and spin down briefly.

Using a thermal cycler, incubate at 72°C for 10 minutes.

最終ステップ

Take your treated rAAV lysate samples forward into the DNA extraction step.

4. DNA extraction from rAAV

材料
  • DNAseI treated rAAV lysate samples
消耗品
  • PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit (Thermo Fisher, 12280050)
  • Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
  • Qubit™ ssDNA Assay Kit (ThermoFisher, Q10212)
  • Ethanol, 100% (e.g. Fisher, 16606002)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • Microfuge
  • ボルテックスミキサー
  • サーマルサイクラー
  • Eppendorf 5424 centrifuge (or equivalent)
  • P1000 pipette and tips
  • P100 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • P20 pipette and tips
  • P10 ピペットとチップ
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）

This extraction step is performed using the PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit and includes steps from the user guide for completeness.

The PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit user guide is available here.

Add 60 ml of 96-100% ethanol to 15 ml of Wash Buffer (WII) and store at room temperature.

Add 310 µl nuclease-free water directly to the tube of 310 µg lyophilised Carrier RNA to obtain 1 µg/µl Carrier RNA stock solution and mix thoroughly.

Calculate the volume of Lysis Buffer/Carrier RNA mix required to process the desired number of samples simultaneously using the following formula:

N x 0.21 ml (volume of Lysis Buffer/reaction) = A ml A ml x 28 µl/ml = B µl

N = number of samples A = calculated volume of Lysis Buffer B = calculated volume of 1 µg/µl Carrier RNA stock solution to add to Lysis Buffer


Worked example for 6 samples:

6 x 0.21 ml = 1.26 ml 1.26 ml x 28 µl/ml = 35.28 µl

1.26 ml of Lysis Buffer 35.28 µl of Carrier RNA stock solution

Aliquot the Carrier RNA stock solution and take forward the required volume into the next step. Store any excess aliquots at -20°C and avoid repeated freezing and thawing.

重要

Do NOT vortex the Lysis Buffer as this will generate a foam.

In a sterile 2 ml Eppendorf DNA LoBind tube, add the calculated volume of Carrier RNA stock solution to the calculated volume of Lysis Buffer and mix gently by pipetting.

For 6 samples, add 35.28 µl of Carrier RNA stock solution to 1.26 ml of Lysis Buffer.

Store the buffer at 4°C until use.

重要

The Lysis Buffer must be used within an hour.

Add 25 µl Proteinase K into a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube for each sample.

Spin down the DNAseI treated rAAV samples.

Transfer 200 µl of an rAAV lysate sample to a tube containing Proteinase K and repeat for each sample into separate tubes.

Note: Ensure the rAAV samples are at room temperature and not combined.

Add 200 µl Lysis Buffer to each tube. Close the tube lids and mix by vortexing for 15 seconds.

Incubate at 56°C for 15 minutes.

Briefly centrifuge the tubes to remove any drops from the inside of the lids.

Add 250 µl 96-100% ethanol to each tube to obtain a final concentration of 37% and mix by vortexing for 15 seconds.

Incubate the tubes with ethanol for 5 minutes at room temperature and spin down.

Spin down the tubes to remove any drops from the lids.

Transfer each lysate with ethanol (~675 µl) into a new Viral Spin Column.

Centrifuge the columns at ~6,800 x g for 1 minute. Discard the collection tubes with the flow-through.

Place the Viral Spin Columns in clean Wash Tubes and add 500 µl Wash Buffer (WII) with ethanol to the Viral Spin Columns.

Centrifuge the columns at ~6,800 x g for 1 minute. Discard the flow-through and place the spin columns back into the Wash Tubes.

Add 500 µl Wash Buffer (WII) with ethanol into the spin columns.

Centrifuge the columns at ~6,800 x g for 1 minute. Discard the Wash Tubes containing the flow-through.

Place the spin columns into clean Wash Tubes.

Centrifuge the columns at maximum speed in the microcentrifuge for 1 minute to dry the membranes completely. Discard the Wash Tubes with the flow-through.

Place the Viral Spin Columns in clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes.

Add 50 µl of nuclease-free water into the centre of each of the spin columns and close the lids.

Incubate at room temperature for 1 minute.

Centrifuge the spin columns at maximum speed for 1 minute. The Eppendorf DNA LoBind tubes will contain the extracted rAAV DNA for each sample. Remove and discard the spin columns.

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using the ssDNA and dsDNA HS Qubit Assay kit and Qubit fluorometer.

Note: The carrier RNA in PureLink™ kit may affect the ssDNA Qubit measurements.

最終ステップ

Take the extracted rAAV DNA samples into the optional annealing step or the library preparation step. Samples can be stored at -80°C for later use.

5. (Optional) Annealing

材料
  • Extracted rAAV samples
消耗品
  • 50X annealing buffer (2.5 M NaCl, 500 mM Tris-HCl, pH 7.5)
  • Qubit™ ssDNA Assay Kit (ThermoFisher, Q10212)
  • Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
装置
  • サーマルサイクラー
  • P200 pipette and tips
  • P100 pipette and tips
  • P20 pipette and tips
オプション装置
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）

This optional self-hybridisation step can be used to self-anneal any remaining (+) and (-) single strands of rAAV vector together before library preparation.

This step can be skipped and the library preparation started immediately as we have found higher amounts of full-length inverted terminal repeat (ITR) sequences without the annealing step.

Prepare the 50X annealing buffer (2.5 M NaCl, 500 mM Tris-HCl, pH 7.5).

Add 1 µl of 50X annealing buffer (2.5 M NaCl, 500 mM Tris-HCl, pH 7.5) to each rAAV sample, to reach a total volume of 50 µl.

Transfer each sample to a clean 0.2 ml PCR tube or a PCR plate.

In a thermal cycler, incubate the tubes at 95°C for 5 minutes before ramping down to 25°C (1 minute per 1°C).

オプショナルステップ

Quantify 1 µl of recovered rAAV using the dsDNA and ssDNA HS Qubit assay with a Qubit fluorometer.

最終ステップ

Take the remaining samples forward into the library preparation step.

6. End-prep

材料
  • Extracted rAAV DNA in 50 µl per sample
  • AMPure XP Beads (AXP)
消耗品
  • NEBNext® Ultra II End Repair / dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • Multichannel pipette and tips
  • Thermal cycler
  • Microfuge
  • アイスバケツ（氷入り）
  • Magnetic rack
  • ボルテックスミキサー
  • Hula mixer (rotator mixer)
  • Qubit fluorometer (or equivalent)
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 pipette and tips
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 pipette and tips
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 pipette and tips
CHECKPOINT

フローセルのチェックを行ってください。

ライブラリー調製を開始する前にフローセルチェックを行い、良好なシークエンスランに十分なポアを持つフローセルを使用することをお勧めします。

詳細については、MinKNOWプロトコルのflow cell check instructions を参照してください。

Thaw the AMPure XP Beads (AXP) at room temperature and mix by vortexing. Keep the beads at room temperature until use.

Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Ensure the reagents are well mixed.
    Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.

If the optional annealing step was skipped, make up each AAV sample to 50 µl with nuclease-free water.

For each rAAV sample, combine the following reagents in a 0.2 ml PCR tube.

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent Volume
rAAV DNA 50 µl
NEBNext Ultra II End-prep Reaction Buffer 7 µl
NEBNext Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
Total 60 µl

Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting and spin down briefly.

サーマルサイクラーを使用して、初めに20℃で5分間インキュベートした後に、65℃で5分間インキュベートしてください。

Transfer each sample into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Resuspend the AMPure XP beads (AXP) by vortexing.

再懸濁したAMPure XP Beads (AXP) 60 µlをエンドプレップ反応に加え、チューブをフリッ クして混和します。

Incubate the samples on a Hula Mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Prepare sufficient fresh 80% ethanol in nuclease-free water for all of your samples. Allow enough for 400 µl per sample, with some excess.

Spin down the samples and pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless. Keep the tubes on the magnet and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.

前のステップを繰り返します。

Briefly spin down and place the tubes back on the magnet for the beads to pellet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for 30 seconds, but do not dry the pellets to the point of cracking.

Remove the tubes from the magnetic rack and resuspend the pellet in 10 µl nuclease-free water.

Incubate the samples on a Hula Mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 10 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of each eluted sample using a Qubit fluorometer.

最終ステップ

Take forward an equimolar mass of each sample to be barcoded forward into the native barcode ligation step. However, you may store the samples at 4°C overnight.

7. Native barcode ligation

材料
  • Native Barcodes (NB01-24)
  • AMPure XP Beads (AXP)
  • EDTA (EDTA)
消耗品
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32851)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 0.2 ml PCR tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • マグネットラック
  • ボルテックスミキサー
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • Microfuge
  • サーマルサイクラー
  • アイスバケツ（氷入り）
  • Multichannel pipette and tips
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 pipette and tips
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 pipette and tips
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 pipette and tips
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）

Prepare the NEB Blunt/TA Ligase Master Mix according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes.

Thaw the EDTA at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

Thaw the Native Barcodes (NB01-24) at room temperature. Briefly spin down, individually mix the barcodes required for your number of samples by pipetting, and place them on ice.

Select a unique barcode for each sample to be run together on the same flow cell.

Note: Only use one barcode per sample.

In clean 0.2 ml PCR-tubes, add the reagents in the following order per well:

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent Volume
End-prepped rAAV DNA 7.5 µl
Native Barcode (NB01-24) 2.5 µl
Blunt/TA Ligase Master Mix 10 µl
Total 20 µl

反応液を完全に混合するために、ゆっくりとピペッティングし短時間スピンダウンして下さい。

Incubate for 20 minutes at room temperature.

Add the following volume of EDTA to each well and mix thoroughly by pipetting and spin down briefly.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

EDTA cap colour Volume per well
For clear cap EDTA 2 µl
For blue cap EDTA 4 µl
ヒント

EDTA is added at this step to stop the reaction.

Pool all the barcoded samples in a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

Volume per sample For 6 samples
Total volume for preps using clear cap EDTA 22 µl 132 µl
Total volume for preps using blue cap EDTA 24 µl 144 µl

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

Add AMPure XP Beads (AXP) to the pooled reaction, and mix by pipetting for a 0.4X clean.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

/ Volume per sample For 6 samples
Volume of AXP for preps using clear cap EDTA 9 µl 53 µl
Volume of AXP for preps using blue cap EDTA 10 µl 58 µl

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Prepare 2 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

Spin down the sample and pellet on a magnet for 5 minutes. Keep the tube on the magnetic rack until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnetic rack and wash the beads with 700 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.

前のステップを繰り返します。

Spin down and place the tube back on the magnetic rack. Pipette off any residual ethanol. Allow the pellet to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 35 µl nuclease-free water by gently flicking.

Incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.

Pellet the beads on a magnetic rack until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 35 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Dispose of the pelleted beads

CHECKPOINT

Qubit蛍光光度計を使用して、溶出したサンプル1 µlを定量します。

最終ステップ

Take forward the barcoded DNA library to the adapter ligation and clean-up step. However, you may store the sample at 4°C overnight.

8. Adapter ligation and clean-up

材料
  • Short Fragment Buffer (SFB)
  • Elution Buffer (EB)
  • Native Adapter (NA)
  • AMPure XP Beads (AXP)
消耗品
  • NEBNext® Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • NEBNext® Quick Ligation Reaction Buffer (NEB, B6058)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32851)
装置
  • 小型遠心機
  • マグネットラック
  • ボルテックスミキサー
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • サーマルサイクラー
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットとチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • Ice bucket with ice
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）
重要

The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Prepare the NEBNext Quick Ligation Reaction Module according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes. Note: Do NOT vortex the Quick T4 DNA Ligase.

The NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5x) may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for several seconds to ensure the reagent is thoroughly mixed.

Spin down the Native Adapter (NA) and Quick T4 DNA Ligase, pipette mix and place on ice.

Thaw the Elution Buffer (EB) and Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature, before mixing by vortexing. Then spin down and place on ice.

In a 1.5 ml Eppendorf LoBind tube, mix in the following order:

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent Volume
Pooled barcoded sample 30 µl
Native Adapter (NA) 5 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5X) 10 µl
Quick T4 DNA Ligase 5 µl
Total 50 µl

反応液を完全に混合するために、ゆっくりとピペッティングし短時間スピンダウンして下さい。

Incubate the reaction for 20 minutes at room temperature.

重要

The next clean-up step uses Short Fragment Buffer (SFB) rather than 80% ethanol to wash the beads. The use of ethanol will be detrimental to the sequencing reaction.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

Add 20 µl of resuspended AMPure XP Beads (AXP) to the reaction and mix by pipetting.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Spin down the sample and pellet on the magnetic rack. Keep the tube on the magnet and pipette off the supernatant.

Wash the beads by adding either 125 μl Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.

前のステップを繰り返します。

Spin down and place the tube back on the magnet. Pipette off any residual supernatant.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 15 µl Elution Buffer (EB).

Spin down and incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.

溶出液が無色透明になるまで、少なくとも1分間マグネット上でビーズをペレット化します。

DNA ライブラリーを含む 15 µl の溶出液を取り出し、清潔な 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube に移し替えます。

ペレット化したビーズを廃棄します。

CHECKPOINT

Qubit蛍光光度計を使用して、溶出したサンプル1 µlを定量します。

重要

We recommend loading 12 µl of the final prepared library onto the R10.4.1 flow cell.

This protocol has been written to maximise the output from the flow cells with the limited starting input.

最終ステップ

The prepared library is used for loading onto the flow cell. Store the library on ice or at 4°C until ready to load.

ヒント

推奨のライブラリー保存方法

短期間の保存や繰り返し使用する場合は__（例　フローセルをウオッシュして再度ロードする場合）は、ライブラリーをEppendorf DNA LoBindチューブに入れ、__4℃で保存 することをお勧めします。 __3か月以上の長期保存の場合は、____ライブラリーをEppendorf DNA LoBindチューブに -80 ° Cで保存 することをお勧めします。

9. MinIONおよびGridIONフローセルのプライミングとローディング

材料
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB)
  • Sequencing Buffer (SB)
消耗品
  • MinionとGridIONのFlow Cell
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • Bovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/ml) (e.g Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
装置
  • MinIONかGridION のデバイス
  • MinIONとGridIONのFlow Cell ライトシールド
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
重要

注意：本キットはR10.4.1フローセル（FLO-MIN114）のみに対応しています。

ヒント

フローセルのプライミングとローディング

新規ユーザーは、 初回使用前に'Priming and loading your flow cell' のビデオをご覧いただくことをお勧めします。

Sequencing Buffer（SB）、Library Beads（LIB）またはLibrary Solution（LISを使用する場合のみ）、Flow Cell Tether（FCT）およびFlow Cell Flush（FCF）を室温で融解してから、ボルテックスで混合します。その後、スピンダウンして氷上で保存します。

重要

MinION R10.4.1フローセル（FLO-MIN114）での最適なシークエンス性能と出力向上のために、フローセルのプライミングミックスに最終濃度0.2 mg/mlでBovine Serum Albumin (BSA) を添加することを推奨します。

(注： その他のアルブミンの種類（組換えヒト血清アルブミンなど）の使用は推奨しません。

BSA入りのフローセルプライミングミックスを調製するには、Flow Cell Flush （FCF）とFlow Cell Tether（FCT）を以下の指示に従って組み合わせます。室温でピペッティングして混合します。

(注： キットの容器を変更している最中です。今までは実験の後に使い捨てるシングルユーズチューブを使用していましたが、バッファー単位のボトル容器に変更しています。お手持ちのキットの使用方法に従ってください。

シングルユースチューブの場合: 50 mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA）5 µlとFlow Cell Tether （FCT）30 µlをFlow Cell Flush （FCF）チューブに直接加えます。

ボトル容器の場合：: フローセルの数に適したチューブに以下の試薬を組み合わせます。

試薬 １フローセルあたりの容量
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
合計 1,205 µl

MinIONまたはGridIONデバイスの蓋を開け、フローセルをクリップの下にスライドさせます。 フローセルをしっかりと押さえ、サーマルプレートと電気接触が密着しているかを確認してください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b_JP

オプショナルステップ

ライブラリーをロードする前にフローセルチェックを行い、使用可能なポアの数を把握して下さい。

フローセルが以前にチェックされている場合は、このステップを省略できます。

詳細については、MinKNOWプロトコルのフローセルチェックの手順 flow cell check instructionsを参照してください。

フローセルのプライミングポートカバーを時計方向にスライドさせ、プライミングポートを開きます。

Flow Cell Loading Diagrams Step 2_JP

重要

フローセルからバッファーを引き上げる際には注意してください。20～30μl以上は除去せず、ポアのアレイ全体が常にバッファーで覆われていることを確認して下さい。アレイに気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。

プライミングポートを開けた後に、カバーの下に小さな気泡がないかを確認して下さい。気泡を取り除くために少量の液を引き上げます。

  1. P1000ピペットを200 µ Lに設定して下さい。
  2. ピペットの先端をプライミングポートに差し込みます。
  3. 目盛りが220-230 ulと表示されるまでダイヤルを回して、20-30 ulを吸い上げるか、少量のバッファーがピペットの先端に入るのが見えるまでダイヤルを回します。

(注： プライミングポートからセンサーアレイ全体にバッファーがあることを確認してください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5_JP

気泡が混入しないように、プライミングポートからフローセルにプライミングミックスを800µl注入し、 5分間待ちます。この５分間の間に、以下の手順でライブラリーをロードする準備をして下さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5_JP

Library Beads(LIB)の液をピペッティングすることで十分に混合して下さい。

重要

Library Beads（LIB）チューブにはビーズの懸濁液が入っています。このビーズはすぐに沈殿するので、使用直前に混合することが重要です。

ほとんどのシークエンシング実験には、Library Beads （LIB）を使用することをお勧めします。しかし、より粘性の高いライブラリーをご使用の場合はLibrary Solution （LIS）の使用をお勧めします。

新しい1.5mlのEppendorf DNA LoBindチューブにてライブラリーをロードする準備をします。（詳細は以下に記載されています。）

試薬 １フローセルあたりの容量
Sequencing Buffer (SB) 37.5 µl
Library Beads （LIB）またはLibrary Solution（LIS）（使用する場合）は、使用直前に混合して下さい。 25.5 µl
DNA library 12 µl
合計 75 µl

フローセルのプライミングを完了させます。

  1. SpotON サンプルポートカバーをゆっくりと持ち上げ、SpotON サンプルポートにアクセスできるようにします。
  2. 200μlのプライミングミックスをフローセルのプライミングポート（SpotONサンプルポートではありません）に気泡が入らないように注入します。

Flow Cell Loading Diagrams Step 5_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5_JP

調製したライブラリーは、ロードする直前にピペッティング混合して下さい。

調製したライブラリー75μlをSpotONサンプルポートからフローセルに滴下します。次の一滴を追加する前に各一滴がポートに入っていることを確認して下さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 07 V5_JP

SpotONサンプルポートカバーをゆっくりと元に戻し、バング（カバーの先）がSpotONポートに入ることを確認し、プライミングポートを閉じます。

Step 8 update_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 9_JP

重要

最適なシークエンス出力を得るために、ライブラリーがロードされたすぐにライトシールドをフローセルに取り付けてください。

ライブラリーがフローセル上にある状態では（ウォッシングやリロードのステップを含める）、フローセルにライトシールドを付けたままにしておくことを推奨します。ライトシールドは、ライブラリーがフローセルから除去された時点で取り外すことができます。

ライトシールドを以下のようにフローセルに設置して下さい。

  1. ライトシールドの先端を慎重にクリップに当てます。 (注： ライトシールドをクリップの下に無理に押し込まないでください。

  2. ライトシールドをフローセルにゆっくりと下ろします。ライトシールドは、フローセルの上部全体を覆うようにSpotONカバーの周囲に取り付けます。

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised-Japanese step10

注意

MinIONフローセルライトシールドは、フローセルに固定されていないため、取り付け後の取り扱いには注意が必要です。

最終ステップ

デバイスの蓋を閉め、MinKNOWでシークエンスランをセットします。

10. Washing and reloading a flow cell

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
  • Sequencing Buffer (SB)
  • Library Beads (LIB)
  • Library Solution (LIS)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Flow Cell Flush (FCF)
消耗品
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装置
  • Vortex mixer
  • アイスバケツ（氷入り）
  • P1000 pipette and tips
  • P200 pipette and tips
  • P10 ピペットとチップ

Flow cell washing and reloading

Due to the low input material for the library preparation, low pore occupancy (<25% of active pore) can occur before enough data is generated for data analysis. Therefore, we recommend washing and reloading your flow cell with fresh library to maintain high data acquisition when approximately ~25% of active pores remain.

The Flow Cell Wash Kit removes most of the initial library as well as unblocking pores to prepare the flow cell for loading a new library for further sequencing. Pore availability can be viewed on the Pore Activity or the Pore Scan plot on MinKNOW.

ヒント

We recommend keeping the light shield on the flow cell during washing if a second library will be loaded straight away.

If the flow cell is to be washed and stored, the light shield can be removed.

重要

A P1000 pipette must be used for all flushing steps to create a seal with the flow cell ports.

Place the tube of Wash Mix (WMX) on ice. Do not vortex the tube.

Thaw one tube of Wash Diluent (DIL) at room temperature.

Mix the contents of Wash Diluent (DIL) thoroughly by vortexing, then spin down briefly and place on ice.

In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare the following Flow Cell Wash Mix:

Reagent Volume per flow cell
Wash Mix (WMX) 2 μl
Wash Diluent (DIL) 398 μl
Total 400 μl

Mix well by pipetting, and place on ice. Do not vortex the tube.

Pause the sequencing experiment in MinKNOW, and leave the flow cell in the device.

重要

It is vital that the flow cell priming port and SpotON sample port are closed before removing the waste buffer to prevent air from being drawn across the sensor array area, which would lead to a significant loss of sequencing channels.

Remove the waste buffer, as follows:

  1. Close the priming port and SpotON sample port cover, as indicated in the figure below.
  2. Insert a P1000 pipette into waste port 1 and remove the waste buffer.

Note: As both the priming port and SpotON sample port are closed, no fluid should leave the sensor array area.

Flow cell ports

Slide the flow cell priming port cover clockwise to open.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2 (3)

重要

フローセルからバッファーを引き上げる際には注意してください。20～30μl以上は除去せず、ポアのアレイ全体が常にバッファーで覆われていることを確認して下さい。アレイに気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。

After opening the priming port, check for a small air bubble under the cover. Draw back a small volume to remove any bubbles:

  1. Set a P1000 pipette to 200 µl.
  2. Insert the tip into the flow cell priming port.
  3. Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, or until you can see a small volume of buffer/liquid entering the pipette tip.
  4. Visually check that there is continuous buffer from the flow cell priming port across the sensor array.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Slowly load 200 µl of the prepared flow cell wash mix into the priming port, as follows:

  1. Using a P1000 pipette, take 200 µl of the flow cell wash mix
  2. Insert the pipette tip into the priming port, ensuring there are no bubbles in the tip
  3. Slowly twist the pipette wheel down to load the flow cell (if possible with your pipette) or push down the plunger very slowly, leaving a small volume of buffer in the pipette tip.
  4. Set a timer for a 5 minute incubation.

Loading wash mix 200ul slow min grid

Once the 5 minute incubation is complete, carefully load the remaining 200 µl of the prepared flow cell wash mix into the priming port, as follows:

  1. Using a P1000 pipette, take the remaining 200 µl of the flow cell wash mix
  2. Insert the pipette tip into the priming port, ensuring there are no bubbles in the tip
  3. Slowly twist the pipette wheel down to load the flow cell (if possible with your pipette) or push down the plunger very slowly, leaving a small volume of buffer in the pipette tip.

Loading wash mix 200ul slow min grid

Close the priming port and wait for 1 hour.

Flow Cell Loading Diagrams Step 9

重要

It is vital that the flow cell priming port and SpotON sample port are closed before removing the waste buffer to prevent air from being drawn across the sensor array area, which would lead to a significant loss of sequencing channels.

Remove the waste buffer, as follows:

  1. Ensure the priming port and SpotON sample port covers are closed, as indicated in the figure below.
  2. Insert a P1000 pipette into waste port 1 and remove the waste buffer.

Note: As both the priming port and SpotON sample port are closed, no fluid should leave the sensor array area.

Flow cell ports

重要

The buffers used in this process are incompatible with conducting a Flow Cell Check step prior to loading the subsequent library. However, number of available pores will be reported after the next pore scan.

Sequencing Buffer（SB）、Library Beads（LIB）またはLibrary Solution（LISを使用する場合のみ）、Flow Cell Tether（FCT）およびFlow Cell Flush（FCF）を室温で融解してから、ボルテックスで混合します。その後、スピンダウンして氷上で保存します。

重要

MinION R10.4.1フローセル（FLO-MIN114）での最適なシークエンス性能と出力向上のために、フローセルのプライミングミックスに最終濃度0.2 mg/mlでBovine Serum Albumin (BSA) を添加することを推奨します。

(注： その他のアルブミンの種類（組換えヒト血清アルブミンなど）の使用は推奨しません。

BSA入りのフローセルプライミングミックスを調製するには、Flow Cell Flush （FCF）とFlow Cell Tether（FCT）を以下の指示に従って組み合わせます。室温でピペッティングして混合します。

(注： キットの容器を変更している最中です。今までは実験の後に使い捨てるシングルユーズチューブを使用していましたが、バッファー単位のボトル容器に変更しています。お手持ちのキットの使用方法に従ってください。

シングルユースチューブの場合: 50 mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA）5 µlとFlow Cell Tether （FCT）30 µlをFlow Cell Flush （FCF）チューブに直接加えます。

ボトル容器の場合：: フローセルの数に適したチューブに以下の試薬を組み合わせます。

試薬 １フローセルあたりの容量
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
合計 1,205 µl

フローセルのプライミングポートカバーを時計方向にスライドさせ、プライミングポートを開きます。

Flow Cell Loading Diagrams Step 2_JP

重要

フローセルからバッファーを引き上げる際には注意してください。20～30μl以上は除去せず、ポアのアレイ全体が常にバッファーで覆われていることを確認して下さい。アレイに気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。

After opening the priming port, check for a small air bubble under the cover. Draw back a small volume to remove any bubbles:

  1. Set a P1000 pipette to 200 µl.
  2. Insert the tip into the flow cell priming port.
  3. Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, or until you can see a small volume of buffer/liquid entering the pipette tip.
  4. Visually check that there is continuous buffer from the flow cell priming port across the sensor array.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Slowly load 800 µl of the priming mix into the priming port, as follows:

  1. Using a P1000 pipette, take 800 µl of the priming mix
  2. Insert the pipette tip into the priming port, ensuring there are no bubbles in the tip
  3. Slowly twist the pipette wheel down to load the flow cell (if possible with your pipette) or push down the plunger very slowly, as illustrated in the video above, leaving a small volume of buffer in the pipette tip.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5

重要

It is vital to wait five minutes between the priming mix flushes to ensure effective removal of the nuclease.

Close the priming port and wait five minutes.

During this time, prepare the library for loading by following the steps below.

Library Beads(LIB)の液をピペッティングすることで十分に混合して下さい。

重要

Library Beads（LIB）チューブにはビーズの懸濁液が入っています。これらのビーズはすぐに沈殿するので、使用直前に混合することが重要です。

ほとんどのシーケンス実験にはLibrary Beads （LIB）の使用を推奨します。しかし、より粘性の高いライブラリーにはLibrary Solution（LIS）を使ってください。

新しい1.5mlのEppendorf DNA LoBindチューブにてライブラリーをロードする準備をします。（詳細は以下に記載されています。）

試薬 １フローセルあたりの容量
Sequencing Buffer (SB) 37.5 µl
Library Beads （LIB）またはLibrary Solution（LIS）（使用する場合）は、使用直前に混合して下さい。 25.5 µl
DNA library 12 µl
合計 75 µl
重要

It is vital that the flow cell priming port and SpotON sample port are closed before removing the waste buffer to prevent air from being drawn across the sensor array area, which would lead to a significant loss of sequencing channels.

Remove the waste buffer, as follows:

  1. Ensure the priming port and SpotON sample port covers are closed, as indicated in the figure below.
  2. Insert a P1000 pipette into waste port 1 and remove the waste buffer.

Note: As both the priming port and SpotON sample port are closed, no fluid should leave the sensor array area.

Flow cell ports

Slide the flow cell priming port cover clockwise to open.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2 (3)

重要

フローセルからバッファーを引き上げる際には注意してください。20～30μl以上は除去せず、ポアのアレイ全体が常にバッファーで覆われていることを確認して下さい。アレイに気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。

プライミングポートを開けた後に、カバーの下に小さな気泡がないかを確認して下さい。気泡を取り除くために少量の液を引き上げます。

  1. P1000ピペットを200 µ Lに設定して下さい。
  2. ピペットの先端をプライミングポートに差し込みます。
  3. 目盛りが220-230 ulと表示されるまでダイヤルを回して、20-30 ulを吸い上げるか、少量のバッファーがピペットの先端に入るのが見えるまでダイヤルを回します。

(注： プライミングポートからセンサーアレイ全体にバッファーがあることを確認してください。

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5_JP

Slowly load 200 µl of the priming mix into the flow cell priming port, as follows:

  1. Ensure the priming port is open and gently lift open the SpotON sample port.
  2. Using a P1000 pipette, take 200 µl of the priming mix
  3. Insert the pipette tip into the priming port, ensuring there are no bubbles in the tip
  4. Slowly twist the pipette wheel down to load the flow cell (if possible with your pipette) or push down the plunger very slowly, as illustrated in the video above, leaving a small volume of buffer in the pipette tip.
重要

It is vital that the flow cell priming port and SpotON sample port are closed before removing the waste buffer to prevent air from being drawn across the sensor array area, which would lead to a significant loss of sequencing channels.

Remove the waste buffer, as follows:

  1. Close the priming port and SpotON sample port cover, as indicated in the figure below.
  2. Insert a P1000 pipette into waste port 1 and remove the waste buffer.

Note: As both the priming port and SpotON sample port are closed, no fluid should leave the sensor array area.

Flow cell ports

Slide open the priming port cover and gently lift open the SpotON sample port cover.

調製したライブラリーは、ロードする直前にピペッティング混合して下さい。

調製したライブラリー75μlをSpotONサンプルポートからフローセルに滴下します。次の一滴を追加する前に各一滴がポートに入っていることを確認して下さい。

Flow Cell Loading Diagrams Step 07 V5_JP

SpotONサンプルポートカバーをゆっくりと元に戻し、バング（カバーの先）がSpotONポートに入ることを確認し、プライミングポートを閉じます。

Step 8 update_JP

Flow Cell Loading Diagrams Step 9_JP

重要

最適なシークエンス出力を得るために、ライブラリーがロードされたすぐにライトシールドをフローセルに取り付けてください。

ライブラリーがフローセル上にある状態では（ウォッシングやリロードのステップを含める）、フローセルにライトシールドを付けたままにしておくことを推奨します。ライトシールドは、ライブラリーがフローセルから除去された時点で取り外すことができます。

ライトシールドを以下のようにフローセルに設置して下さい。

  1. ライトシールドの先端を慎重にクリップに当てます。 (注： ライトシールドをクリップの下に無理に押し込まないでください。

  2. ライトシールドをフローセルにゆっくりと下ろします。ライトシールドは、フローセルの上部全体を覆うようにSpotONカバーの周囲に取り付けます。

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised-Japanese step10

注意

MinIONフローセルライトシールドは、フローセルに固定されていないため、取り付け後の取り扱いには注意が必要です。

最終ステップ

Resume the sequencing run in MinKNOW to continue data acquisition.

11. Data acquisition and basecalling

How to start sequencing

Once you have loaded your flow cell, the sequencing run can be started on MinKNOW, our sequencing software that controls the device, data acquisition and real-time basecalling. For more detailed information on setting up and using MinKNOW, please see the MinKNOW protocol.

MinKNOW can be used and set up to sequence in multiple ways:

  • On a computer either direcly or remotely connected to a sequencing device.
  • Directly on a GridION, MinION Mk1C or PromethION 24/48 sequencing device.

For more information on using MinKNOW on a sequencing device, please see the device user manuals:

Open the MinKNOW software using the desktop shortcut and log into the MinKNOW software using your Community credentials.

Click on your connected device.

min running

Set up a sequencing run by clicking Start sequencing.

Edit 1

Type in the experiment name, select the flow cell postition and enter sample ID. Choose FLO-MIN114 flow cell type from the drop-down menu.

Click Continue to kit selection.

Edit 2

Click the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24).

Click Continue to Run Options to continue.

Screenshot 2023-04-03 103028

Keep the run options to their default settings of 72 hour run length and 200 bp minimum read length.

Minimum read length can be reduced down to 20 bp to increase output by sequencing more short reads, such as contaminanting reads including ITR tetramers. During development of this protocol, it was noted that despite the increase in short reads, a higher proportion of short reads were of lower Qscore (≤9).

Click Continue to basecalling to continue.

Edit 4

Set up basecalling and barcoding using the following parameters:

  1. Ensure basecalling is ON.

  2. Next to Models, click Edit options and choose the High accuracy basecaller (HAC) from the drop-down menu.

  3. Ensure barcoding is ON and use the default settings.

  4. A reference sequence may be uploaded to perform live alignment but this may slow down system processing.

  5. Click Continue to output and continue.

Picture2

Set up the output format and filtering as follows:

  1. Raw reads is on and select .POD5 as the output format.

  2. Ensure .FASTQ is selected for basecalled reads.

  3. Filtering is on and use the default settings.

  4. Click Continue to final review to continue.

Picture3

Click Start to start sequencing.

You will be automatically navigated to the Sequencing Overview page to monitor the sequencing run.

Picture4

Data analysis after sequencing

After sequencing has completed on MinKNOW, the flow cell can be reused or returned, as outlined in the Flow cell reuse and returns section.

After sequencing and basecalling, the data can be analysed, as outlined in the Downstream analysis section.

12. Flow cell reuse and returns

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

シークエンス実験終了後、フローセルを再利用する場合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコールに従い、洗浄したフローセルを2～8℃で保管してください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティーで入手できます。

または、返送手順に従って、オックスフォード・ナノポアに返送してください。

フローセルの返却方法は hereをご覧ください。

(注： 製品を返却する前に、すべてのフローセルを脱イオン水で洗浄する必要があります。

重要

シークエンシング実験に関して問題が発生した場合や質問がある場合には、このプロトコルのオンライン版にあるトラブルシューティングガイドを参照してください。

13. Downstream analysis

Post-basecalling analysis

We recommend performing downstream analysis using EPI2ME Labs which facilitates bioinformatic analyses by allowing users to run Nextflow workflows in a desktop application. EPI2ME Labs maintains a collection of bioinformatic workflows which are curated and actively maintained by experts in long-read sequence analysis.

Further information about the available EPI2ME Labs workflows are available here, along with the Quick Start Guide to start your first bioinformatic workflow.

For the mapping of AAV sequences for quality control and validation, we recommend using the wf-aav-qc workflow which requires Nextflow, Java, and Docker to be installed before running the workflow.

A run report will be produced and includes multiple plots to enable easy assessment of an AAV vector, including a contamination graph, truncations graph, transgene expression read coverage and genome type frequency graph.

Open the EPI2ME app using the desktop shortcut.

Navigate to the available workflows tab and click on the wf-aav-qc workflow to download and click install.

image (122)

Install v2

Navigate to the installed tab and click on wf-aav-qc.

installed

Click "Run this workflow" to open the launch wizard.

Screenshot 2023-09-08 at 09.26.07

Set up your run by uploading your data files including the FASTQ input and host reference in the "Input Options". Fill in the basecaller configuration used to basecall your data and the other parameters can be kept to their default settings.

Screenshot 2023-09-08 at 09.27.59 (1)

Click "Launch workflow" in the top right corner.

Ensure all parameters options have green ticks.

launch

Once the workflow finishes, a report will be produced.

14. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation for Kit 14

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

サンプルの品質が低い

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
DNAの純度が低い（DNAのOD 260/280のナノドロップ測定値が1.8未満およびOD 260/230が2.0～2.2未満） DNA抽出で必要な純度が得られていない 夾雑物の影響は、 Contaminants に示されています。コンタミネーションをもたらさないために別の抽出方法extraction method をお試しください。.

追加のSPRIクリーンアップステップの実施を検討して下さい。
低いRNA インテグリティー（RNA Integrity Number: <9.5 RIN、またはrRNAバンドがゲル上でスメアになっている） 抽出中にRNAが分解された 別のRNA抽出方法 RNA extraction methodを試してください。RINの詳細については、 RNA Integrity Number の資料を参照してください。詳細については、 DNA/RNA Handling のページをご覧ください。
RNAのフラグメントが予想より短い 抽出中にRNAが分解された 別のRNA抽出方法 RNA extraction methodを試してください。 RINの詳細については、 RNA Integrity Number の資料を参照してください。詳細については、DNA/RNA Handling のページをご覧ください。

RNAを扱う際には、RNaseフリーの環境で作業し、実験器具もRNaseフリーにしておくことをお勧めします。

AMPureビーズクリーンアップ後のDNA回収率が低い

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
低回収率 AMPureビーズとサンプルの比率が予想していたのよりも低いことによるDNAの損失 1. AMPureビーズはすぐに沈降するため、サンプルに添加する前によく再懸濁させてください。

2. AMPureビーズ対サンプル比が0.4:1未満の場合、どのようなサイズのDNA断片でもクリーンアップ中に失われます。
低回収率 DNA断片が予想よりも短い サンプルに対するAMPureビーズの比率が低いほど、短い断片に対する選択が厳しくなります。 アガロースゲル(または他のゲル電気泳動法)上でインプットDNAの長さを設定してから、使用するAMPureビーズの適切な量を計算してください。 SPRI cleanup
エンドプレップ後の収率が低い 洗浄ステップで使用したエタノール濃度が低い（70%未満）。 エタノールが70%未満の場合、DNAは洗浄中にビーズから溶出されます。必ず正しい濃度（％）のエタノールを使用してください。

15. Issues during the sequencing run for Kit 14

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

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ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

シークエンス開始時のポアがフローセルチェック後よりも少ない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ナノポアアレイに気泡が入ってしまった。 フローセルチェックをした後、フローセルをプライミングする前に、プライミングポート付近の気泡を取り除くことが必要です。 気泡を取り除かないと、気泡がナノポアアレイに移動し、空気に触れたたナノポアが不可逆的なダメージを負った可能性がある。これを防ぐための最適な方法が、 this videoで紹介されています。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 フローセルがデバイスに正しく挿入されていない。 シークエンスランを停止し、フローセルをシークエンス装置から取り出します。次に再度フローセルを挿入し、装置にしっかりと固定され、目標温度に達していることを確認します。GridIONやPromethIONの場合は別のフローセルの位置をお試しください。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ライブラリー内の汚染物質がポアを失活させたり塞いだりしている。 フローセルチェックの際のポア数は、フローセル保存バッファー中のQC用のDNA分子を用いて計測されます。シークエンシングの開始時は、ライブラリ自体を使用してアクティブなポア数を推定します。このため、フローセルチェックとRun開始時のポア数は、約10％程度の変動が起こります。シークエンシング開始時に報告されたポアの数が大幅に減少している場合は、ライブラリー中の汚染物質がメンブレンを損傷していたり、ポアをブロックしている可能性があります。インプット材料の純度を向上させるために、別のDNA/RNA抽出または精製方法が必要となる場合があります。コンタミネーションの影響は、Contaminants Know-how pieceを参照にして下さい。夾雑物を除去するために別の抽出方法extraction method をお試しください。

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
MinKNOW に 「Script failed」と表示されている"
コンピューターを再起動し、MinKNOWを再起動します。問題が解決しない場合は MinKNOW log files MinKNOWログファイルを収集し 、テクニカルサポートにご連絡ください。他のシークエンシングデバイスをお持ちでない場合は、 フローセルとロードしたライブラリーを4℃で保管することをお勧めします。詳細な保管方法については、テクニカルサポートにお問い合わせください。

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell 10–20 fmol of good quality library can be loaded on to a MinION/GridION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Native Barcoding Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming.

予想より短いリード長

問題点 予想される原因 解決策とコメント
予想より短いリード長 DNAサンプルの不要な断片化 読み取り長はサンプルDNA断片の長さを反映します。サンプルDNAは、抽出およびライブラリー調製中の操作で断片化した可能性があります。

1. 抽出の最適な方法については、Extraction Methods の抽出方法を参照してください。

2. ライブラリー調製に進む前に、アガロースゲル電気泳動で、サンプルDNAのフラグメント長の分布を確認してください。 DNA gel2 上の画像では、サンプル1は高分子量ですが、サンプル2は断片化されています。

3. ライブラリー調製中は、試薬を混合するためのピペッティングやボルテックス操作は、プロトコルで指示がないかぎり行わないでください。

利用できないポアの割合が多い場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
利用できないポアの割合が大きい（チャンネルパネルとポアのアクティブポートで青く表示されています）

image2022-3-25 10-43-25 上のアクティブなポアの図は、時間の経過とともに「利用できない」ポアの割合が増加していることを示しています。		 サンプル内に不純物が含まれている 一部のポアに吸着する不純物は、MinKNOWに組み込まれたポアのブロック解除機能によって、ポアから除去することができます。 このステップが完了すると、ポアの状態が「sequencing pore」に戻ります。利用できないポアの部分が多いか、増加した場合:

1.Flow Cell Wash Kit nuclease flush using the Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) を用いて、ヌクレアーゼ洗浄を 行うことができます。又は
2. PCRを数サイクル実行してサンプルDNAの量を増やし、サンプルDNAに含まれる問題の不純物が相対的に減る（希釈される）ようにします。

Inactiveのポアの割合が高い

問題点 予想される原因 解決策とコメント
利用できない(inactive/unavailable)ポアの割合が高い（チャネルパネルとポアアクティブポートでは水色で表示されています）ポアまたは膜に損傷が起きてしまった。 気泡がフローセルに混入した。 フローセルのプライミングやライブラリーのロードで気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。 推奨の操作方法については、Priming and loading your flow cell のビデオをご覧ください。
利用できないポアの割合が多い場合 サンプルDNAに含まれる不純物 既知の化合物問題で、サンプルDNAに多糖類が含まれた事で、植物のゲノムDNAと結合しポアをブロックした。

1. 植物葉DNA抽出法 Plant leaf DNA extraction methodをご参照ください。
2. QIAGEN PowerClean Pro キットを使用してクリーンアップして下さい。
3. QIAGEN REPLI-g kit.キットを使用して、元のgDNAサンプルで全ゲノム増幅を実行します。
利用できないポアの割合が多い場合 サンプル内に不純物が含まれている 不純物の影響は、 Contaminants の ノウハウを参照して下さい。 サンプルDNAに不純物を残留させないために別の抽出方法をお試しください。

Reduction in sequencing speed and q-score later into the run

Observation Possible cause Comments and actions
Reduction in sequencing speed and q-score later into the run Fast fuel consumption is typically seen in Kit 9 chemistry (e.g. SQK-LSK109) when the flow cell is overloaded with library. Please see the appropriate protocol for your DNA library to find the recommendation. Add more fuel to the flow cell by following the instructions in the MinKNOW protocol. In future experiments, load lower amounts of library to the flow cell.

温度変動

問題点 予想される原因 解決策とコメント
温度変動 フローセルとデバイスの接続が途切れている。 フローセルの背面にある金属プレートを覆っているヒートパッドがあることを確認してください。 フローセルを再度挿入し、コネクターピンがデバイスにしっかりと接触していることを確認するために軽く押してください。問題が解決しない場合は、テクニカルサービスにご連絡してください。

目標温度に到達しない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目標温度に達しなかった)と表示する。" 装置が通常の室温より低い場所、または風通しの悪い場所（排気が出来ない場所）に置かれた時にフローセルが過熱してします。 MinKNOWでは、フローセルが目標温度に到達するまでの既定の時間枠があります。時間枠を超えると、エラーメッセージが表示され、シークエンシング実験が続行されます。しかし、不適切な温度でシークエンスを行うと、スループットが低下し、qスコアが低下する可能性があります。シークエンシングデバイスが風通しの良い室温に置かれていることを確認して、MinKNOW再スタートしてください。MinION Mk 1Bの温度制御の詳細については、FAQ を参照してください。

Last updated: 12/13/2024

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