This protocol describes how to carry out native barcoding of amplicon DNA using the Native Barcoding Kit 96 V14 (SQK-NBD114.96). There are 96 unique barcodes available, allowing the user to pool up to 96 different samples in one sequencing experiment. It is highly recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

• Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
• Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
• Download the software for acquiring and analysing your data
• Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Prepare your library

You will need to:

• Prepare the DNA ends for adapter attachment
• Ligate Native barcodes supplied in the kit to the DNA ends
• Ligate sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
• Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell

Sequencing

You will need to:

• Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
• Demultiplex barcoded reads in MinKNOW or the Guppy basecalling, choosing the SQK-NBD114.96 kit option
• Start the EPI2ME software and select a workflow for further analysis (this step is optional)

インプットDNAのQC方法

インプットDNAの量と品質の要件を満たすことが重要です。DNAの使用量が少なすぎたり多すぎたり、あるいは品質の低いDNA（例としてDNAが非常に断片化されていたり、RNAや化学汚染物質が含まれている場合など）を使用すると、ライブラリーの調製に影響を及ぼす可能性があります。

DNAサンプルの品質管理の方法については、Input DNA/RNA QC protocolのプロトコルをご覧ください。

コンタミネーション

DNAの抽出する方法によっては、精製DNAに特定の化学汚染物質が残留する可能性があり、ライブラリ調製の効率やシークエンシングの品質に影響を及ぼす可能性があります。コンタミネーションについての詳細は、コミュニティーの Contaminants page をご覧ください。

このプロトコールで使用されているすべてのサードパーティー試薬は、当社が検証し、使用を推奨しているものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以外の試薬を用いたテストは行っていません。

すべてのサードパーティ製試薬については、製造元の指示に従って使用の準備をすることをお勧めします。

Note: We are in the process of updating our kits with reduced EDTA concentration.

Higher EDTA concentration format:

† Higher concentration of EDTA with a clear cap.

Reduced EDTA concentration format:

‡ Reduced concentration of EDTA with a blue cap.

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

The barcodes are orientated in columns in the barcode plate.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.

These expansions provide extra library preparation and flow cell priming reagents to allow users to utilise any unused barcodes for those running in smaller subsets.

Both expansion packs used together will provide enough reagents for 12 reactions. For customers requiring extra EDTA to maximise the use of barcodes, we recommend using 0.25 M EDTA and adding 4 µl for library preps using the SQK-NBD114.24 kit and 2 µl for preps using the SQK-NBD114.96 kit.

Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) contents:

Note: This Product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) contents:

Sequencing on a MinION Mk1B requires a high-spec computer or laptop to keep up with the rate of data acquisition. For more information, refer to the MinION Mk1B IT requirements document.

The MinION Mk1C contains fully-integrated compute and screen, removing the need for any accessories to generate and analyse nanopore data. For more information refer to the MinION Mk1C IT requirements document.

Sequencing on a MinION Mk1D requires a high-spec computer or laptop to keep up with the rate of data acquisition. For more information, refer to the MinION Mk1D IT requirements document.

MinKNOW

The MinKNOW software controls the nanopore sequencing device, collects sequencing data and basecalls in real time. You will be using MinKNOW for every sequencing experiment to sequence, basecall and demultiplex if your samples were barcoded.

For instructions on how to run the MinKNOW software, please refer to the MinKNOW protocol.

EPI2ME (optional)

The EPI2ME cloud-based platform performs further analysis of basecalled data, for example alignment to the Lambda genome, barcoding, or taxonomic classification. You will use the EPI2ME platform only if you would like further analysis of your data post-basecalling.

For instructions on how to create an EPI2ME account and install the EPI2ME Desktop Agent, please refer to this link.

シークエンシング実験を開始する前に、フローセルのポアの数を確認することを強くお勧めします。このフローセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの場合は代理店への到着から１２週間以内に行ってください。またはFlongle Flow Cellの場合は代理店への到着から4週間以内に行う必要があります。Oxford Nanopore Technologiesは、フローセルチェックの実施から2日以内に結果が報告され、推奨される保管方法に従っていた場合に、以下の表に記載されているナノポアの有効数に満たさない場合には、フローセルを交換します。 フローセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指示に従ってください。

For most sequencing experiments, use the Library Beads (LIB) for loading your library onto the flow cell. However, for viscous libraries it may be difficult to load with the beads and may be appropriate to load using the Library Solution (LIS).

For a full overview of nanopore data analysis, which includes options for basecalling and post-basecalling analysis, please refer to the Data Analysis document.

The sequencing device control, data acquisition and real-time basecalling are carried out by the MinKNOW software. Please ensure MinKNOW is installed on your computer or device. There are multiple options for how to carry out sequencing:

1. Data acquisition and basecalling in real-time using MinKNOW on a computer

Follow the instructions in the MinKNOW protocol beginning from the "Starting a sequencing run" section until the end of the "Completing a MinKNOW run" section.

2. Data acquisition and basecalling in real-time using the MinION Mk1B/Mk1D device

Follow the instructions in the MinION Mk1B user manual or the MinION Mk1D user manual.

3. Data acquisition and basecalling in real-time using the MinION Mk1C device

Follow the instructions in the MinION Mk1C user manual.

4. Data acquisition and basecalling in real-time using the GridION device

Follow the instructions in the GridION user manual.

5. Data acquisition and basecalling in real-time using the PromethION device

Follow the instructions in the PromethION user manual or the PromethION 2 Solo user manual.

6. Data acquisition using MinKNOW on a computer and basecalling at a later time using MinKNOW

Follow the instructions in the MinKNOW protocol beginning from the "Starting a sequencing run" section until the end of the "Completing a MinKNOW run" section. When setting your experiment parameters, set the Basecalling tab to OFF. After the sequencing experiment has completed, follow the instructions in the Post-run analysis section of the MinKNOW protocol.

ベースコールされたデータをさらに解析するには、いくつかの方法があります。

1. EPI2ME workflows

詳細なデータ解析のために、オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズは、EPI2MEで利用可能な様々なバイオインフォマティクスのチュートリアルとワークフローを提供しています。このプラットフォームでは、研究チームとアプリケーションチームがGitHubに保存しているワークフローを記載しています。このプラットフォーム内にはバイオインフォマティクスのコードと説明をしているコメント、およびサンプルデータを使ってコードを試すことが出来ます。

2. 研究分析ツール

Oxford Nanopore Technologiesの研究部門では、Oxford Nanopore GitHub repositoryで多数の分析ツールを公開しています。これらのツールは上級ユーザー向けであり、ソフトウェアのインストールと実行方法の説明が含まれています。これらのツールは最低限のサポートしかしていません。

3. コミュニティーで開発されたツール

研究課題に適したデータ解析方法が上記のリソースのいずれにも記載されていない場合は、 resource centre を参照し、アプリケーションに適したバイオインフォマティクスツールを検索してください。 Nanoporeコミュニティーの多くのメンバーが、 ナノポアシークエンシングデータを解析するための独自のツールやパイプラインを開発しており、そのほとんどはGitHubで利用可能です。これらのツールはOxford Nanopore Technologiesではサポート対象外であり、最新のケミストリーやソフトウェア構成との互換性を保証するものではありませんのでご了承ください。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

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