Rapid sequencing DNA - PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24)
Protocol
Rapid sequencing DNA - PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24) VRPB_9191_v114_revC_17Sep2024
- This protocol uses genomic DNA
- Low input requirement
- Tagmentation, barcoding and PCR amplification
- For multiplexing 1–24 samples
- Compatible with R10.4.1 flow cells
For Research Use Only
This is an Early Access product For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introduction to the protocol
Library preparation
Sequencing and data analysis
- 6. Data acquisition and basecalling
- 7. Análisis posterior
- 8. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo
Troubleshooting
Overview
- This protocol uses genomic DNA
- Low input requirement
- Tagmentation, barcoding and PCR amplification
- For multiplexing 1–24 samples
- Compatible with R10.4.1 flow cells
For Research Use Only
This is an Early Access product For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.
1. Overview of the protocol
IMPORTANTE
Este es un producto de acceso anticipado
Para tener más información sobre los programas de acceso anticipado, consulte este artículo sobre las fases de lanzamiento del producto.
Procure usar la versión más reciente del protocolo.
Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 features
This kit is recommended for users who:
- Wish to multiplex samples to reduce price per sample
- Have a low starting amount of DNA
- Require a simple library preparation procedure
Introduction to the Rapid PCR Barcoding 24 V14 protocol
This protocol describes how to carry out rapid low input PCR barcoding of genomic DNA using the Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24). There are 24 unique barcodes, allowing the user to pool up to 24 different samples in one sequencing experiment.
Steps in the sequencing workflow:
Prepare for your experiment
You will need to:
- Extract your DNA, and check its length, quantity and purity.
The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
- Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
- Download the software for acquiring and analysing your data
- Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run
Library preparation
You will need to:
- Tagment your DNA using the Fragmentation Mix in the kit
- PCR using the barcoded primer supplied in the kit
- Attach sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
- Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell
Note that after the PCR, the average length of DNA fragments should be <5 kb.
Sequencing and analysis
You will need to:
- Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
- Start the EPI2ME software and select the barcoding workflow
IMPORTANTE
Compatibility of this protocol
This protocol should only be used in combination with:
- Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24)
- R10.4.1 flow cells (FLO-MIN114)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
- Rapid Adapter Auxiliary V14 (EXP-RAA114)
- Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003)
- Flow Cell Priming Kit V14 (EXP-FLP004)
2. Equipment and consumables
Material
- 1–5 ng high molecular weight genomic DNA
- Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24)
Consumibles
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- LongAmp Taq 2X Master Mix (e.g. NEB, cat # M0287)
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Ice bucket with ice
- Microcentrífuga
- Temporizador
- Thermal cycler
- Magnetic rack
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- P1000 pipette and tips
- P200 pipette and tips
- P100 pipette and tips
- P20 pipette and tips
- P2 pipette and tips
- Multichannel pipette and tips
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Equipo opcional
- Bioanalizador Agilent (o equivalente)
For this protocol, you will need 1-5 ng high molecular weight genomic DNA.
Note: Your input DNA must be at least 4 kb in length to ensure correct tagmentation and PCR amplification.
Cantidad de muestra inicial de ADN
Cómo realizar un control de calidad de la muestra inicial de ADN
Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.
Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC
Contaminantes químicos
Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Se recomienda preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
IMPORTANTE
The Rapid Adapter (RA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.
Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24) contents
| Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (µl) |
|---|---|---|---|---|
| Fragmentation Mix | FRM | Brown | 1 | 160 |
| Rapid Adapter | RA | Green | 1 | 15 |
| Adapter Buffer | ADB | Clear | 1 | 100 |
| AMPure XP Beads | AXP | Amber | 3 | 1,200 |
| Elution Buffer | EB | Black | 2 | 500 |
| EDTA | EDTA | Blue | 1 | 700 |
| Sequencing Buffer | SB | Red | 1 | 700 |
| Library Beads | LIB | Pink | 1 | 600 |
| Library Solution | LS | White cap, pink label | 1 | 600 |
| Flow Cell Flush | FCF | Clear | 1 | 8,000 |
| Flow Cell Tether | FCT | Purple | 1 | 200 |
| Rapid Barcode Primer 01-24 | RLB01-24 | Clear | 24 (one per barcode) | 15 |
Note: This product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.
To maximise the use of the Rapid Barcoding Kits, the Rapid Adapter Auxiliary V14 (EXP-RAA114) and the Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) expansion packs are available.
These expansions provide additional library preparation and flow cell priming reagents to allow users to utilise any unused barcodes for those running in smaller subsets.
Both expansion packs used together will provide enough reagents for 6 library preparations.
Rapid Adapter Auxiliary V14 (EXP-RAA114) contents:
| Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (μl) |
|---|---|---|---|---|
| Rapid Adapter | RA | 1 | Green | 15 |
| Adapter Buffer | ADB | 1 | Clear | 100 |
Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) contents:
| Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (μl) |
|---|---|---|---|---|
| Elution Buffer | EB | Black | 2 | 500 |
| Sequencing Buffer | SB | Red | 2 | 700 |
| Library Solution | LIS | White cap, pink label | 2 | 600 |
| Library Beads | LIB | Pink | 2 | 600 |
| Flow Cell Flush | FCF | Light blue label | 2 | 8,000 |
| Flow Cell Tether | FCT | Purple | 2 | 200 |
Rapid barcode primers
| Component | Sequence |
|---|---|
| RLB01 | AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG |
| RLB02 | TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT |
| RLB03 | GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG |
| RLB04 | TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA |
| RLB05 | CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT |
| RLB06 | TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC |
| RLB07 | GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT |
| RLB08 | TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT |
| RLB09 | AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT |
| RLB10 | AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC |
| RLB11 | GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA |
| RLB12 | GTTGAGTTACAAAGCACCGATCAG |
| RLB13 | AGAACGACTTCCATACTCGTGTGA |
| RLB14 | AACGAGTCTCTTGGGACCCATAGA |
| RLB15 | AGGTCTACCTCGCTAACACCACTG |
| RLB16 | CGTCAACTGACAGTGGTTCGTACT |
| RLB17 | ACCCTCCAGGAAAGTACCTCTGAT |
| RLB18 | CCAAACCCAACAACCTAGATAGGC |
| RLB19 | GTTCCTCGTGCAGTGTCAAGAGAT |
| RLB20 | TTGCGTCCTGTTACGAGAACTCAT |
| RLB21 | GAGCCTCTCATTGTCCGTTCTCTA |
| RLB22 | ACCACTGCCATGTATCAAAGTACG |
| RLB23 | CTTACTACCCAGTGAACCTCCTCG |
| RLB24 | GCATAGTTCTGCATGATGGGTTAG |
3. Computer requirements and software
Requisitos informáticos para el MinION Mk1B
Para secuenciar con el MinION Mk1B es necesario tener un ordenador o portátil de alto rendimiento, que pueda soportar la velocidad de adquisición de datos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1B IT Requirements.
Requisitos informáticos para el MinION Mk1C
El MinION Mk1C contiene ordenador y pantalla integrados, lo que elimina la dependencia de cualquier accesorio para generar y analizar datos de nanoporos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1C IT Requirements.
Software for nanopore sequencing
MinKNOW
The MinKNOW software controls the nanopore sequencing device, collects sequencing data and basecalls in real time. You will be using MinKNOW for every sequencing experiment to sequence, basecall and demultiplex if your samples were barcoded.
For instructions on how to run the MinKNOW software, please refer to the MinKNOW protocol.
EPI2ME (optional)
The EPI2ME cloud-based platform performs further analysis of basecalled data, for example alignment to the Lambda genome, barcoding, or taxonomic classification. You will use the EPI2ME platform only if you would like further analysis of your data post-basecalling.
For instructions on how to create an EPI2ME account and install the EPI2ME Desktop Agent, please refer to the EPI2ME Platform protocol.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en los primeros tres meses desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| Flongle | 50 |
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
4. Library preparation
Material
- 1–5 ng high molecular weight genomic DNA
- Fragmentation Mix (FRM)
- Rapid Barcode Primers (RLB01-24, at 10 µM)
- EDTA (EDTA)
- AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
- Elution Buffer (EB)
- Rapid Adapter (RA)
- Adapter Buffer (ADB)
Consumibles
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- LongAmp Taq 2X Master Mix (e.g. NEB, cat # M0287)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Cubeta con hielo
- Thermal cycler
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Magnetic rack
- Microcentrífuga
- P1000 pipette and tips
- P200 pipette and tips
- P100 pipette and tips
- P20 pipette and tips
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
Thaw kit components at room temperature, spin down briefly using a microfuge and mix by pipetting as indicated by the table below:
| Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Briefly spin down | 3. Mix well by pipetting or vortexing |
|---|---|---|---|
| Rapid Barcode Primers (RLB01-24) | Not frozen | ✓ | Pipette |
| Fragmentation Mix (FRM) | Not frozen | ✓ | Pipette |
| Rapid Adapter (RA) | Not frozen | ✓ | Pipette |
| Adapter Buffer (ADB) | ✓ | ✓ | Vortex or Pipette |
| AMPure XP Beads (AXP) | ✓ | ✓ | Mix by pipetting or vortexing immediately before use |
| Elution Buffer (EB) | ✓ | ✓ | Vortex or Pipette |
| EDTA (EDTA) | ✓ | ✓ | Vortex or Pipette |
Note: Once thawed, keep all kit components on ice.
IMPORTANTE
Your input DNA must be at least 4 kb in length to ensure correct tagmentation and PCR amplification.
Prepare the DNA in nuclease-free water.
- Transfer 1–5 ng of each genomic DNA sample into a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
- Adjust the volume to 3 μl with nuclease-free water
- Mix thoroughly by flicking avoiding unwanted shearing
- Spin down briefly in a microfuge
In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:
| Reagent | Volume |
|---|---|
| 1-5 ng template DNA | 3 μl |
| Fragmentation Mix (FRM) | 1 μl |
| Total | 4 μl |
Mix gently by flicking the tube, and spin down.
In a thermal cycler, incubate the tube at 30°C for 2 minutes and then at 80°C for 2 minutes. Briefly put the tube on ice to cool it down.
For each sample, set up a PCR reaction as follows in a 0.2 ml thin-walled PCR tube:
| Reagent | Volume |
|---|---|
| Tagmented DNA (from previous step) | 4 µl |
| Nuclease-free water | 20 µl |
| RLB (01-24, at 10 µM) | 1 µl |
| LongAmp Taq 2X master mix | 25 µl |
| Total | 50 µl |
If the amount of input material is altered, the number of PCR cycles may need to be adjusted to produce the same yield.
Mix gently by flicking the tube, and spin down.
Amplify using the following cycling conditions:
| Cycle step | Temperature | Time | No. of cycles |
|---|---|---|---|
| Initial denaturation | 95°C | 3 mins | 1 |
| Denaturation Annealing Extension | 95°C 56°C 65°C | 15 sec 15 sec 6 min | 14* |
| Final extension | 65°C | 6 min | 1 |
| Hold | 4°C | ∞ |
*We recommend 14 cycles as a starting point. However, the number of cycles can be adjusted up to 25 cycles according to experimental needs.
Add 4 µl of EDTA to each barcoded sample, mix thorougly by pipetting and spin down briefly.
CONSEJO
EDTA is added at this step to stop the reaction.
Incubate for 5 minutes at room temperature.
Quantify 1 µl of each barcoded sample using a Qubit fluorometer (or equivalent) for QC check.
CONSEJO
We recommend pooling samples in an equimolar ratio to a final combined concentration of 200–400 fmol (~400–800 ng) for optimum barcode balance during sequencing.
If users want to to perform multiple flow cell loads from their library preparation, we recommend pooling in the higher concentration range.
Pool all barcoded samples in equimolar ratios to a combined final concentration of 200–400 fmol (~400–800 ng) in a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
For a 200 fmol final pool:
| Number of barcoded samples pooled | 2 samples | 6 samples | 12 samples | 24 samples |
|---|---|---|---|---|
| Concentration of each barcoded sample added to the pool | 100 fmol (~200 ng) | 33.3 fmol (~66.7 ng) | 16.7 fmol (~33.3 ng) | 8.3 fmol (~16.7 ng) |
| Final pool concentration | 200 fmol (~400 ng) | 200 fmol (~400 ng) | 200 fmol (~400 ng) | 200 fmol (~400 ng) |
For a 300 fmol final pool:
| Number of barcoded samples pooled | 2 samples | 6 samples | 12 samples | 24 samples |
|---|---|---|---|---|
| Concentration of each barcoded sample added to the pool | 150 fmol (~300 ng) | 50 fmol (~100 ng) | 25 fmol (~50 ng) | 12.5 fmol (~25 ng) |
| Final pool concentration | 300 fmol (~600 ng) | 300 fmol (~600 ng) | 300 fmol (~600 ng) | 300 fmol (~600 ng) |
For a 400 fmol final pool:
| Number of barcoded samples pooled | 2 samples | 6 samples | 12 samples | 24 samples |
|---|---|---|---|---|
| Concentration of each barcoded sample added to the pool | 200 fmol (~400 ng) | 66.7 fmol (~133.3 ng) | 33.3 fmol (~66.7 ng) | 16.7 fmol (~33.3 ng) |
| Final pool concentration | 400 fmol (~800 ng) | 400 fmol (~800 ng) | 400 fmol (~800 ng) | 400 fmol (~800 ng) |
Note: Please ensure you have quantified your samples prior to this step and take forward an equimolar concentration of each of the samples for optimal barcode balancing. Samples may vary in concentration following the barcoded PCR, therefore the volume of each barcoded sample added to the pool will be different.
Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.
To the pool of barcoded samples, add a 0.6X volume ratio of resuspended AMPure XP Beads (AXP) and mix by pipetting:
| Volume of barcoded sample pool | 37.5 μl | 75 μl | 150 μl | 300 μl | 600 μl |
|---|---|---|---|---|---|
| Volume of AMPure XP Beads (AXP) | 22.5 μl | 45 μl | 90 μl | 180 μl | 360 μl |
Note: Table contains example volumes for reference. Please adjust the volume of AMPure XP Beads (AXP) added for the volume of your barcoded sample pool to ensure a 0.6X volume ratio.
Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 5 minutes at room temperature.
Prepare 2 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.
Briefly spin down the sample and pellet on a magnetic rack until supernatant is clear and colourless. Keep the tube on the magnetic rack, and pipette off the supernatant.
Keep the tube on the magnet and wash the beads with 1 ml of freshly-prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.
Repetir el paso anterior.
Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet by pipetting in 15 µl Elution Buffer (EB). Spin down and incubate for 5 minutes at room temperature.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Remove and retain 15 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
- Remove and retain the eluate which contains the DNA library in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
- Dispose of the pelleted beads
CHECKPOINT
Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.
Transfer 10–50 fmol of your eluted samples into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Make up the volume to 11 µl with Elution Buffer (EB).
In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, dilute the Rapid Adapter (RA) as follows and pipette mix:
| Reagent | Volume |
|---|---|
| Rapid Adapter (RA) | 1.5 μl |
| Adapter Buffer (ADB) | 3.5 μl |
| Total | 5 μl |
Add 1 µl of the diluted Rapid Adapter (RA) to the barcoded DNA.
Mix gently by flicking the tube, and spin down.
Incubate the reaction for 5 minutes at room temperature.
FIN DEL PROCESO
The prepared library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice until ready to load.
5. Priming and loading the MinION and GridION Flow Cell
Material
- Flow Cell Flush (FCF) (enjuague de celda de flujo)
- Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
- Library Solution (LIS)
- Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
- Sequencing Buffer (SB) (tampón de secuenciación)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora para celdas de flujo MinION
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE
Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).
CONSEJO
Cebado y carga de la celda de flujo
Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.
Uso de Library Solution (LIS)
En la mayoría de experimentos de secuenciación, recomendamos usar Library Beads (LIB) para cargar la biblioteca en la celda de flujo. Nótese, si previamente se ha usado agua para cargar la biblioteca, se deberá usar Library Solution (LIS) en su lugar. Nota: Algunos clientes han notado que las bibliotecas viscosas pueden cargarse con mayor facilidad cuando no se usan Library Beads (LIB).
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
IMPORTANTE
Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.
Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).
To prepare the flow cell priming mix with BSA, combine the following reagents in a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube. Mix by inverting the tube and pipette mix at room temperature:
| Reagents | Volume per flow cell |
|---|---|
| Flow Cell Flush (FCF) | 1,170 µl |
| Bovine Serum Albumin (BSA) at 50 mg/ml | 5 µl |
| Flow Cell Tether (FCT) | 30 µl |
| Final total volume in tube | 1,205 µl |
Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.
MEDIDA OPCIONAL
Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.
Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.
Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.
Para abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizar la tapa en el sentido de las agujas del reloj.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Cargar 800 μl de mezcla de cebado en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.
Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).
IMPORTANTE
Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.
En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.
En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 37,5 µl |
| Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere | 25,5 µl |
| Biblioteca de ADN | 12 µl |
| Total | 75 µl |
Completar el cebado de la celda de flujo:
- Levantar suavemente la tapa del puerto de muestra SpotON.
- Cargar 200 µl de mezcla de cebado en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.
Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, instale la pantalla protectora justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos poner la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
FIN DEL PROCESO
Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.
6. Data acquisition and basecalling
Aspectos generales del análisis de datos de nanoporos
Para obtener una descripción completa del análisis de datos de nanoporos, que incluya distintas posibilidades para el análisis de identificación y postidentificicación de bases, consultar el documento Data Analysis.
Cómo empezar a secuenciar
El programa MinKNOW realiza el control del dispositivo de secuenciación, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Una vez que el usuario ha instalado MinKNOW en su ordenador, hay diferentes maneras de llevar a cabo la secuenciación:
1. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el programa MinKNOW.
Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run".
2. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo GridION.
Seguir las instrucciones del manual de usuario de GridION.
3. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo MinION Mk1C.
Seguir las instrucciones del manual de usuario de MinION Mk1C.
4. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo PromethION.
Seguir las instrucciones de los manuales de usuario de PromethION o PromethION 2 Solo.
5. Adquisición de datos e identificación de bases posterior mediante MinKNOW.
Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run". Al configurar los parámetros del experimento, ajustar la pestaña Basecalling (Identificación de bases) en posición de APAGADO. Al terminar el experimento de secuenciación, seguir las instrucciones del apartado "Post-run analysis" del protocolo de MinKNOW.
7. Análisis posterior
Análisis posterior a la identificación de bases
Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de identificación de bases:
1. Procesos de trabajo en EPI2ME
Para realizar un análisis de datos exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y procesos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, situados en la sección EPI2ME Labs de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los procesos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
2. Herramientas de análisis
El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.
3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad
Si en ninguno de los recursos anteriores se proporciona un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.
8. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
CONSEJO
Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.
Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.
IMPORTANTE
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
9. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) | El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI. |
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas. |
Low DNA recovery after AMPure bead clean-up
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Low recovery | DNA loss due to a lower than intended AMPure beads-to-sample ratio | 1. AMPure beads settle quickly, so ensure they are well resuspended before adding them to the sample. 2. When the AMPure beads-to-sample ratio is lower than 0.4:1, DNA fragments of any size will be lost during the clean-up. |
| Low recovery | DNA fragments are shorter than expected | The lower the AMPure beads-to-sample ratio, the more stringent the selection against short fragments. Please always determine the input DNA length on an agarose gel (or other gel electrophoresis methods) and then calculate the appropriate amount of AMPure beads to use.  |
| Low recovery after end-prep | The wash step used ethanol <80% | DNA will be eluted from the beads when using ethanol <80%. Make sure to use the correct percentage. |
10. Issues during the sequencing run using a Rapid-based sequencing kit
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales. |
Pore occupancy below 40%
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Pore occupancy <40% | Not enough library was loaded on the flow cell | 10–50 fmol of good quality library can be loaded on to a MinION Mk1B/GridION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol" |
| Pore occupancy close to 0 | The Rapid PCR Barcoding Kit V14 was used, and sequencing adapters did not attach to the DNA | Make sure to closely follow the protocol and use the correct volumes and incubation temperatures. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of reagents. |
| Pore occupancy close to 0 | No tether on the flow cell | Tethers are added during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.  En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)  Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles. | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Fluctuación de la temperatura
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector están bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo de secuenciación para asegurarse de que se encuentra a temperatura ambiente y con buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ. |
Last updated: 9/17/2024
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