Microbial Amplicon Barcoding Sequencing for 16S and ITS (SQK-MAB114.24) (MAB_9229_v114_revA_17Sep2025)
MinION: Protocol
Microbial Amplicon Barcoding Sequencing for 16S and ITS (SQK-MAB114.24) V MAB_9229_v114_revA_17Sep2025
A protocol for amplifying and full-length sequencing of 16S rRNA for bacterial profiling and ITS for fungal profiling from diverse sample types. This kit and method feature:
- Inclusive 16S primers with boosted taxa representation, and/or ITS primers
- Genus-level bacterial identification
- Up to 24 barcodes to multiplex different samples
- A rapid workflow that is faster and more cost-effective than a ligation-based approach
- A fragmentation-free workflow that preserves full-length amplicons
For Research Use Only.
This is an Early Access product.
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introducción
Preparación de la biblioteca
- 3. PCR amplification
- 4. Amplicon barcoding
- 5. Rapid Adapter Attachment
- 6. Priming and loading the MinION and GridION Flow Cell
Adquisición de datos e identificación de bases
- 7. Adquisición de datos e identificación de bases
- 8. Reutilización y devolución de celdas de flujo
- 9. Análisis posterior
Resolución de problemas
Descripción general
A protocol for amplifying and full-length sequencing of 16S rRNA for bacterial profiling and ITS for fungal profiling from diverse sample types. This kit and method feature:
- Inclusive 16S primers with boosted taxa representation, and/or ITS primers
- Genus-level bacterial identification
- Up to 24 barcodes to multiplex different samples
- A rapid workflow that is faster and more cost-effective than a ligation-based approach
- A fragmentation-free workflow that preserves full-length amplicons
For Research Use Only.
This is an Early Access product.
1. Aspectos generales
Presentación del kit de 24 códigos para 16S V14 —16S Barcoding Kit 24 V14— (en adelante nombrado solo en inglés)
Este protocolo describe cómo llevar a cabo la adición de códigos con química rápida de amplicones 16S con el kit 16S Rapid Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24). Dada a la presencia tanto de variantes de regiones altamente conservadas (adecuadas para cebadores universales y señales filogenéticas) como de regiones altamente variables (diferentes en las especies), el gen 16S ARNr se utiliza a menudo para la identificación bacteriana basada en secuencias.
El kit 16S Barcoding Kit 24 V14 permite acceder a una secuenciación rápida del 16S como método de identificación de organismos. Al acotar a una región de interés específica, es posible ver todos los organismos de la muestra sin necesidad de secuenciar regiones innecesarias del genoma, lo que ágiliza la prueba y la hace más barata. Hay 24 códigos diferentes, que permiten agrupar hasta 24 muestras diferentes en un único experimento de secuenciación.
Tras la secuenciación, es posible realizar el análisis utilizando el flujo de trabajo 16S de EPI2ME, que permite clasificar amplicones 16S a partir de las muestras.
Pasos del proceso de secuenciación:
Preparación del experimento
Pasos:
- Extraer el ADNg, evaluar su longitud, cantidad y pureza, según el protocolo de control de calidad Input DNA/RNA QC. Los controles de calidad realizados durante el protocolo son esenciales para garantizar el éxito del experimento.
- Tener a disposición el kit de secuenciación, el instrumental pertinente y los reactivos de otros fabricantes.
- Descargar el programa para obtener y analizar los datos
- Comprobar que la celda de flujo tiene poros suficientes para realizar una buena secuenciación.
Preparación de la biblioteca
La tabla siguiente es un resumen de los pasos necesarios en la preparación de la biblioteca.
| Preparación de la biblioteca | Proceso | Tiempo | Parada opcional |
|---|---|---|---|
| Amplificación por PCR de código 16S | Amplificar el gen 16S utilizando los códigos suministrados en el kit | 10 minutos + PCR | 4 °C durante la noche |
| Agrupación de muestras codificadas y lavado de microesferas | Cuantificar y agrupar las muestras codificadas y realizar un lavado de la biblioteca mediante microesferas | 15 minutos | Almacenamiento a corto plazo o durante un uso repetido a 4 °C, como la recarga de la celda de flujo. Almacenamiento a largo plazo de un solo uso a -80 °C. |
| Ligación de los adaptadores | Ligar los adaptadores de secuenciación rápida a los extremos de ADN | 5 minutos | Recomendamos secuenciar la biblioteca tan pronto como se liguen los adaptadores. |
| Acondicionar y cargar la celda de flujo | Acondicionar la celda de flujo y cargar la biblioteca de ADN | 5 minutos |
Secuenciación y análisis
Pasos:
- Empezar el proceso de secuenciación usando el programa MinKNOW, que obtendrá datos brutos del dispositivo y los convertirá en lecturas de bases identificadas.
- Opcional: Iniciar el programa EPI2ME y seleccionar el flujo de trabajo 16S.
Compatibilidad del protocolo
Este protocolo debería usarse solo en combinación con los siguientes productos:
- 16S Barcoding Kit 24 V14 (SQK-16S114.24)
- Celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
- Rapid Adapter Auxiliary V14 (EXP-RAA114)
- Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003)
- Flow Cell Priming Kit V14 (EXP-FLP004)
- MinION Mk1B - Requisitos informáticos MinION Mk1B
- MinION Mk1C - Requisitos informáticos del MinION Mk1C
- MinION Mk1D - Requisitos informáticos del MinION Mk1D
2. Material y consumibles
Material
- 10 ng genomic DNA per sample
- Microbial Amplicon Barcoding Kit 24 V14 (SQK-MAB114.24)
Consumibles
- Celdas de flujo MinION/GridION
- Thermolabile Proteinase K (P8111)
- Mezcla maestra 2X LongAmp Hot Start Taq (NEB, M0533)
- Kit Qubit dsDNA HS (Invitrogen Q32851)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
- Tubos Qubit™ Assay (Invitrogen Q32856)
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla(s) protectora(s) de celdas de flujo MinION/GridION
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Microcentrífuga
- Mezclador vórtex
- Gradilla magnética, adecuada para tubos Eppendorf de 1,5 ml
- Termociclador
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Pipeta multicanal y puntas de varios tamaños
- Cubeta con hielo
- Temporizador
- Fluorímetro Qubit (o equivalente)
En este protocolo, necesitará 10 ng de ADN genómico de alto peso molecular por código.
A fin de obtener los mejores resultados, recomendamos utilizar al menos 4 códigos. Si desea multiplexar menos de 4 muestras, procure dividir la(s) muestra(s) entre múltiples códigos, para que al menos se secuencien 4 códigos (por ejemplo, para 2 muestras, utilice cebadores 16S con códigos 01-02 para la muestra A y cebadores 16S con códigos 03-04 para la muestra B). Nótese, la cantidad de muestra requerida por código es de 10 ng de ADNg.
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| Flongle | 50 |
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
Contenido del Kit de 24 códigos para 16S V14
| Nombre | Sigla | Tapón color | Nº de viales | Volumen (μl) |
|---|---|---|---|---|
| Cebadores 16S con códigos 01-24 | 1-24 | - | 2 placas, 3 sets de códigos por placa | 15 μl por pocillo |
| Rapid Adapter | RA | Verde | 1 | 15 |
| Adapter Buffer | ADB | Transparente | 1 | 100 |
| AMPure XP Beads | AXP | (tapón) Transparente, (etiqueta) Verde azulada | 1 | 6,000 |
| Elution buffer | EB | Negro | 1 | 1 500 |
| EDTA | EDTA | Azul | 1 | 700 |
| Sequencing Buffer | SB | Rojo | 1 | 700 |
| Library Beads | LIB | Rosa | 1 | 600 |
| Library Solution | LIS | (tapón) Blanco, (etiqueta) Rosa | 1 | 600 |
| Flow Cell Flush | FCF | (tapón) Transparente, (etiqueta) Azul claro | 1 | 8,000 |
| Flow Cell Tether | FCT | Violeta | 1 | 200 |
Nota: Este producto contiene un reactivo, AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter Inc., que puede conservarse con el kit a -20 °C sin perjudicar su estabilidad.
3. PCR amplification
Material
- 10 ng genomic DNA per sample
- 16S Primers
- ITS Primers
Consumibles
- Mezcla maestra 2X LongAmp Hot Start Taq (NEB, M0533)
- Kit Qubit dsDNA HS (ThermoFisher, Q32851)
- Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937) (chilled)
- 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tubes
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Mezclador vórtex
- Microcentrífuga
- Thermal cycler and/or heating block
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Cubeta con hielo
- Temporizador
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos verificar la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.
Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.
Thaw the following reagents, then spin down briefly using a microfuge and mix as indicated in the table below. Then place the reagents on ice.
| Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Briefly spin down | 3. Mix well by pipetting |
|---|---|---|---|
| 16S Primers | ✓ | ✓ | ✓ |
| ITS Primers | ✓ | ✓ | ✓ |
| LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix | ✓ | ✓ | ✓ |
Keep your 16S and ITS samples separate.
Please ensure you use the correct primer for your sample type.
Note: For optimal results we recommend sequencing only the same type of amplicons (e.g. 16S amplicons only or ITS amplicons only) on the same flow cell.
Preparar el ADN en agua sin nucleasas.
- Transferir 10 ng de cada muestra de ADN genómico en un tubos de PCR de pared fina (0,2 ml).
- Ajustar el volumen a un total de 15 μl con agua sin nucleasas.
- Dar suaves golpecitos en el tubo con el dedo hasta mezclar bien el contenido, para evitar cizalladuras indeseadas.
- Centrifugar brevemente en la microcentrífuga
En cada tubo de PCR de pared fina (0,2 ml) que contenga una muestra que vaya a ser analizada, preparar la siguiente mezcla:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| 10 ng de muestra inicial de ADN (del paso anterior) | 15 μl |
| LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix | 25 μl |
| Total | 40 μl |
Nótese, si se cambia la cantidad de muestra inicial, tal vez sea necesario ajustar el número de ciclos de PCR, para obtener el mismo rendimiento.
Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para que los ingredientes se mezclen completamente.
Amplificar utilizando las siguientes condiciones de ciclado:
| Fase | Temperatura | Tiempo | Nº de ciclos |
|---|---|---|---|
| Desnaturalización inicial | 95 °C | 1 min | 1 |
| Desnaturalización | 95 °C | 20 secs | 25 |
| Hibridación | 55 °C | 30 secs | 25 |
| Extensión | 65 °C | 2 mins | 25 |
| Extensión final | 65 °C | 5 mins | 1 |
| Mantener | 4 °C | ∞ |
Remove your amplified samples from your thermal cycler, spin them down briefly, and pipette mix each of them using a fresh pipette tip each time.
Cuantificar 1 μl de cada muestra etiquetada utilizando un fluorímetro Qubit (o equivalente) para realizar el control de calidad.
Take forward your amplified sample(s) to the barcoding step of this protocol.
At this stage your amplified sample(s) can be stored short-term at 4°C.
4. Amplicon barcoding
Material
- 10 ng of each amplicon sample (from previous step)
- OR 20 ng of each amplicon sample (from previous step) if using fewer than 12 Amplicon Barcodes
- Amplicon Barcodes 01-24 (AB01-24)
- Short Fragment Buffer (SFB)
- Elution Buffer (EB)
Consumibles
- Thermolabile Proteinase K (e.g. NEB, cat # P8111)
- Kit Qubit dsDNA HS (ThermoFisher, Q32851)
- Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937) (chilled)
- 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tubes
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Mezclador vórtex
- Microcentrífuga
- Thermal cycler and/or heating block
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Cubeta con hielo
- Temporizador
Requisitos mínimos en el uso de cebadores con códigos 16S
A fin de obtener los mejores resultados, recomendamos utilizar al menos 4 códigos. Si desea multiplexar menos de 4 muestras, distribuya la(s) muestra(s) en varios códigos, para que se procesen un mínimo de 4:
- Para procesar 1 muestra, utilice 4 códigos por muestra (por ejemplo, cebadores con códigos 16S 01-04, con 10 ng de muestra A por código identificador).
- Para procesar 2 muestras, utilice dos códigos por muestra, (por ejemplo, cebadores con códigos 16S 01-02 para la muestra A y cebadores con códigos 16S 03-04 para la muestra B).
- Para procesar 3 muestras, ejecute 2 muestras individualmente y una muestra repartida en dos códigos (por ejemplo, cebador con códigos 16S 01 y cebador con códigos 16S 02 para las muestras A y B respectivamente y los cebadores 16S 03-04 para la muestra C).
Nótese, la cantidad de muestra requerida por código es 10 ng de ADNg.
Thaw the following reagents, then spin down briefly using a microfuge and mix as indicated in the table below. Then place the reagents on ice.
| Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Briefly spin down | 3. Mix well by pipetting |
|---|---|---|---|
| Amplicon Barcodes 01-24 (AB01-24) | ✓ | ✓ | ✓ |
| EDTA (EDTA) | ✓ | ✓ | ✓ |
| S Fragment Buffer (SFB) | ✓ | ✓ | ✓ |
| AMPure XP Beads (AXP) | ✓ | ✓ | Mix by pipetting or vortexing immediately before use |
| Elution Buffer (EB) | ✓ | ✓ | ✓ |
| Thermolabile Proteinase K | ✓ | ✓ | ✓ |
Preparar el ADN en agua sin nucleasas.
- Transferir 10 ng de cada muestra de ADN genómico en un tubos de PCR de pared fina (0,2 ml).
- Ajustar el volumen a un total de 15 μl con agua sin nucleasas.
- Dar suaves golpecitos en el tubo con el dedo hasta mezclar bien el contenido, para evitar cizalladuras indeseadas.
- Centrifugar brevemente en la microcentrífuga
Select a unique Amplicon Barcode for each sample to be run together on the same flow cell.
Up to 24 samples can be barcoded and combined in one experiment.
Note: Only use one barcode per sample. For optimal results, we recommend running only the same type of amplicons (e.g. 16S amplicons only or ITS amplicons only) on the same flow cell.
En cada tubo de PCR de pared fina (0,2 ml) que contenga una muestra que vaya a ser analizada, preparar la siguiente mezcla:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| 10 ng de muestra inicial de ADN (del paso anterior) | 15 μl |
| LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix | 25 μl |
| Total | 40 μl |
Nótese, si se cambia la cantidad de muestra inicial, tal vez sea necesario ajustar el número de ciclos de PCR, para obtener el mismo rendimiento.
Mezclar meticulosamente el contenido de los tubos 10 veces con la pipeta y centrifugar brevemente.
Nota: mezclar despacio procurando no introducir burbujas de aire en las reacciones.
Incubate the reactions in a thermal cycler at 65°C for 10 minutes, then at 80°C for 2 minutes.
Remove your samples from your thermal cycler and spin them down briefly.
Add 1 ul Thermolabile Proteinase K to each reaction and mix thoroughly by pipetting.
Incubate the reactions in a thermal cycler at 37°C for 15 minutes, then at 55°C for 10 minutes.
Remove your samples from your thermal cycler and spin them down briefly.
Agrupar las muestras etiquetadas en proporciones equimolares en un tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml.
Nota: antes de dar este paso, cuantifique las muestras y utilice una concentración equimolar de cada una de ellas, a fin de obtener un balance óptimo de códigos. Tras la PCR, la concentración de las muestras puede variar, por lo que el volumen de cada muestra etiquetada que se añada al conjunto será diferente.
Resuspender las microesferas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.
Añadir al conjunto de muestras, un volumen de microesferas resuspendidas AMPure XP Beads, que sea 0.6 veces su volumen y mezclar con la pipeta:
| Volumen del conjunto de muestras etiquetadas | 37,5 μl | 75 μl | 150 μl | 300 μl | 600 μl |
|---|---|---|---|---|---|
| Volumen de AMPure XP Beads (AXP) | 22,5 μl | 45 μl | 90 μl | 180 μl | 360 μl |
Nota: la tabla contiene volúmenes de ejemplo como referencia. Ajustar el volumen añadido de AMPure XP Beads (AXP) al volumen del conjunto de muestras etiquetadas para garantizar una relación de 0,6 veces.
Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar brevemente la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Sin quitar el tubo del imán, retirar el sobrenadante con una pipeta.
Con el tubo en el imán, lavar las microesferas con 1 ml de etanol al 80 %, sin desplazar el precipitado. Retirar el etanol con una pipeta y desechar.
Repetir el paso anterior.
Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el precipitado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.
Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el precipitado en 15 µl de Elution Buffer (EB). Centrifugar e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Extraer 15 µl de eluido y guardarlo en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.
- Extraer y colocar el eluido que contiene la biblioteca de ADN, en un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.
- Deshechar las microesferas precipitadas.
Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.
Transferir 50 fmol de muestra eluida a un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA Lobind. Añadir Elution Buffer (EB) hasta llegar a volumen total de 11 μl.
Take forward your eluted barcoded DNA library to the rapid adapter attachment step of this protocol.
At this stage your eluted barcoded DNA library can be stored at 4°C for short-term storage. For longer term storage you can store the DNA library at -80°C.
5. Rapid Adapter Attachment
Material
- DNA library eluate
- Rapid Adapter (RA)
- Adapter Buffer (ADB)
Consumibles
- 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tubes
Instrumental
- Mezclador vórtex
- Microcentrífuga
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Cubeta con hielo
- Temporizador
Thaw the following reagents, then spin down briefly using a microfuge and mix as indicated in the table below. Then place the reagents on ice.
| Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Briefly spin down | 3. Mix well by pipetting |
|---|---|---|---|
| Rapid Adapter (RA) | ✓ | ✓ | ✓ |
| Adapter Buffer (ADB) | ✓ | ✓ | ✓ |
En un tubo nuevo Eppendorf DNA LoBind, diluir el adaptador como se indica a continuación y mezclar con la pipeta:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| Rapid Adapter (RA) | 1,5 μl |
| Adapter Buffer (ADB) | 3,5 μl |
| Total | 5 μl |
Añadir 1 μl de Rapid Adapter (RA) diluido al ADN etiquetado con códigos de barras.
Mezclar dando suaves golpes en el tubo con el dedo y centrifugar brevemente.
Incubar la reacción durante 5 minutos a temperatura ambiente.
La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo hasta el momento de cargar.
6. Priming and loading the MinION and GridION Flow Cell
Material
- Flow Cell Flush (FCF)
- Flush Tether UL (FTU)
- Library Beads (LIB)
- Sequencing Buffer (SB)
Consumibles
- Celdas de flujo MinION/GridION
- Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla(s) protectora(s) de celdas de flujo MinION/GridION
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Mezclador vórtex
Please note, this kit is only compatible with R10.4.1 flow cells (FLO-MIN114).
Priming and loading a flow cell
We recommend all new users watch the 'Priming and loading your flow cell' video before your first run.
Thaw the Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB), Flush Tether UL (FTU) and Flow Cell Flush (FCF) at room temperature before mixing by vortexing. Then spin down and store on ice.
To prepare the flow cell priming mix, combine Flow Cell Flush (FCF) and Flush Tether UL (FTU), as directed below. Mix by pipetting at room temperature.
In a suitable tube for the number of flow cells, combine the following reagents:
| Reagent | Volume per flow cell |
|---|---|
| Flow Cell Flush (FCF) | 1,197 µl |
| Flush Tether UL (FTU) | 3 µl |
| Total volume | 1,200 µl |
Open the MinION or GridION device lid and slide the flow cell under the clip. Press down firmly on the priming port cover to ensure correct thermal and electrical contact.
Complete a flow cell check to assess the number of pores available before loading the library.
This step can be omitted if the flow cell has been checked previously.
See the flow cell check instructions in the MinKNOW protocol for more information.
Slide the flow cell priming port cover clockwise to open the priming port.
Take care when drawing back buffer from the flow cell. Do not remove more than 20-30 µl, and make sure that the array of pores are covered by buffer at all times. Introducing air bubbles into the array can irreversibly damage pores.
After opening the priming port, check for a small air bubble under the cover. Draw back a small volume to remove any bubbles:
- Set a P1000 pipette to 200 µl
- Insert the tip into the priming port
- Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, to draw back 20-30 µl, or until you can see a small volume of buffer entering the pipette tip
Note: Visually check that there is continuous buffer from the priming port across the sensor array.
Load 800 µl of the priming mix into the flow cell via the priming port, avoiding the introduction of air bubbles. Wait for five minutes. During this time, prepare the library for loading by following the steps below.
Thoroughly mix the contents of the Library Beads (LIB) by pipetting.
The Library Beads (LIB) tube contains a suspension of beads. These beads settle very quickly. It is vital that they are mixed immediately before use.
In a new 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare the library for loading as follows:
| Reagent | Volume per flow cell |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 37.5 µl |
| Library Beads (LIB) mixed immediately before use, or Library Solution (LIS), if using | 25.5 µl |
| DNA library | 12 µl |
| Total | 75 µl |
Complete the flow cell priming:
- Gently lift the SpotON sample port cover to make the SpotON sample port accessible.
- Load 200 µl of the priming mix into the flow cell priming port (not the SpotON sample port), avoiding the introduction of air bubbles.
Mix the prepared library gently by pipetting up and down just prior to loading.
Add 75 μl of the prepared library to the flow cell via the SpotON sample port in a dropwise fashion. Ensure each drop flows into the port before adding the next.
Gently replace the SpotON sample port cover, making sure the bung enters the SpotON port and close the priming port.
Install the light shield on your flow cell as soon as library has been loaded for optimal sequencing output.
We recommend leaving the light shield on the flow cell when library is loaded, including during any washing and reloading steps. The shield can be removed when the library has been removed from the flow cell.
Place the light shield onto the flow cell, as follows:
Carefully place the leading edge of the light shield against the clip. Note: Do not force the light shield underneath the clip.
Gently lower the light shield onto the flow cell. The light shield should sit around the SpotON cover, covering the entire top section of the flow cell.
The MinION Flow Cell Light Shield is not secured to the flow cell and careful handling is required after installation.
Close the device lid and set up a sequencing run on MinKNOW.
Al insertar una celda de flujo en el MinION Mk1D, la tapa del dispositivo se asentará sobre ella dejando un pequeño espacio perimetral. Ello es normal y no afecta al funcionamiento del dispositivo.
Encontrará más información en este enlace.
7. Adquisición de datos e identificación de bases
Cómo empezar a secuenciar
Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.
Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:
- En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o a distancia.
- Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.
Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:
- Manual de usuario MinION Mk1B
- Manual de usuario MinION Mk1C
- Manual de usuario MinION Mk1D (EN)
- Manual de usuario GridION
Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:
1. Ir a la página principal y pulsar "Iniciar secuenciación".
2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de la muestra.
3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.
4. En la pestaña Configuración del experimento, ajustar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o mantener la configuración por defecto.
Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, es posible identificar las bases tras la ejecución en MinKNOW. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.
5. En la página Inicio, pulsar en la casilla Iniciar la secuenciación.
Análisis de datos
Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.
Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de análisis disponible durante y tras la identificación de bases, consulte el documento Data Analysis.
En la sección Análisis, se describen otras opciones para analizar los datos.
8. Reutilización y devolución de celdas de flujo
Material
- Kit Flow Cell Wash (EXP-WSH004)
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a entre 2 °C y 8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución, lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí están las instrucciones para devolver celdas de flujo.
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
9. Análisis posterior
Análisis posterior a la identificación de bases
Recomendamos realizar el análisis utilizando EPI2ME, ya que facilita el análisis bioinformático permitiendo a los usuarios realizar flujos de trabajo Nextflow en una aplicación de escritorio. EPI2ME contiene una colección de flujos de trabajo bioinformáticos, seleccionados y gestionados prontamente por expertos en análisis de secuencias de lecturas largas.
Aquí encontrará más información sobre los flujos de trabajo disponibles en EPI2ME, junto con la Guía de inicio rápido, útiles para abordar el primer flujo de trabajo bioinformático.
El flujo de trabajo 16S (wf-16s) de Nextflow saca el máximo partido de los flujos de trabajo de metagenómica, a fin de identificar el origen de las lecturas a partir de la secuenciación selectiva de amplicones. El flujo de trabajo tiene dos modos de funcionamiento: utiliza kraken2 o minimap2, para determinar el origen de las lecturas.
Aquí encontrará más información sobre el flujo de trabajo 16S de EPI2ME (wf-16s).
Las instrucciones de instalación se encuentran aquí.
Opciones complementarias para análizar más a fondo sus datos:
1. Herramientas para analizar datos de investigación
El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio de GitHub, de Oxford Nanopore. Han sido creadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están disponibles públicamente y cuentan con un mantenimiento mínimo.
2. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad
Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y flujos bioinformáticos para analizar los datos de secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Nótese, Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química o programas informáticos.
10. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) | El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI. |
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre el tema en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Al trabajar con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas. |
Escasa recuperación de ADN tras la purificación con microesferas AMPure
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Escasa recuperación | Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas AMPure por muestra inferior a lo previsto | 1. Las microesferas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas AMPure por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza. |
| Escasa recuperación | Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado | Cuanto menor sea la proporción de microesferas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel y, a continuación calcular la cantidad adecuada de microesferas AMPure que se debe utilizar.  |
| Escasa recuperación tras la preparación de extremos | El paso de lavado utilizó etanol a <80 % | Cuando se utilice etanol a <80 %, el ADN se eluirá de las microesferas. No olvide utilizar el porcentaje correcto. |
11. Problemas durante el experimento al utilizar un kit de secuenciación de base rápida
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que tras verificar la celda de flujo
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, y antes de acondicionarla, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de purgado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca podría haber dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la evaluación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación podría deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir instrucciones de almacenamiento adicionales. |
Ocupación de poro por debajo del 40 %
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Ocupación del poro < al 40 % | No se cargó suficiente biblioteca en la celda de flujo | En una celda de flujo MinION o GridION se cargan de 10 a 50 fmol de biblioteca de buena calidad. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular moles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, (opción "dsDNA: μg to pmol"). |
| Ocupación de los poros próxima a 0 | Se utilizó el kit, Rapid PCR Barcoding V14 y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN. | No olvidar seguir el protocolo paso a paso y utilizar los volúmenes y las temperaturas de incubación correctos. Es posible preparar una biblioteca de lambda control para valorar la integridad de los reactivos. |
| Ocupación de los poros próxima a 0 | No hay anclaje en la celda de flujo | Los anclajes se añaden mientras se acondiciona la celda de flujo (vial FCT). El anclaje debe añadirse al enjuague (vial FCF) antes de acondicionar la celda de flujo. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción y preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.  En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)  Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros "no disponibles". | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores". Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta: 1. Realizar un purgado de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el acondicionamiento de la celda y carga de la biblioteca podrían dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de acondicionamiento y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte los métodos de extracción de ADN en la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Purificar con el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Fluctuación de la temperatura
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar con una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW dispone de un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continúa. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede provocar disminuciones en el rendimiento y generar índices de calidad Qscore menores. Corrija la ubicación del dispositivo, procurando que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace. |
12. Primer design, PCR and sequencing considerations
16S and ITS rRNA sequences
A full list of the primer sequences for both the 16S primers (16S) and ITS primers (ITS) can be found in this downloadable document:
Our primer schemes are aligned with industry standards and provide coverage for the entire 16S rRNA and ITS rRNA gene respectively. However, the primers used bind within regions that are not 100% conserved across species and therefore we are unable to guarantee amplification for all species.
Please ensure you run a control experiment to determine if your targeted species will be amplified using the primers provided in this kit. If you require further support contact us via support@nanoporetech.com.
ITS primer design
The ITS primers supplied in this kit are aligned with industry standards.
Please note, the ITS1 primer can form dimers, leading to a small number of PCR artefacts that will be carried through the library preparation. This may produce a small population of longer or lower-quality reads (concatemer reads or 2D reads with supplementary alignments). These reads are automatically filtered in our EPI2ME workflow using minimap2, but if you use other analysis tools, please account for them.
16S primer design
The 16S primers supplied in this kit have not presented any behaviour conducive with dimerisation and the formation of hairpins.
Last updated: 9/26/2025
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