Ligation sequencing influenza whole genome V14 (SQK-NBD114.24 or SQK-NBD114.96)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Ligation sequencing influenza whole genome V14 (SQK-NBD114.24 or SQK-NBD114.96) V INF_9189_v114_revJ_13Dec2024

  • This protocol uses extracted RNA samples
  • Includes reverse transcription and PCR amplification using two separate primer schemes for Influenza A and Influenza B
  • Includes quantification and normalisation steps to ensure equal distribution of barcodes for 24, 48 and 96 samples.
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

  • This protocol uses extracted RNA samples
  • Includes reverse transcription and PCR amplification using two separate primer schemes for Influenza A and Influenza B
  • Includes quantification and normalisation steps to ensure equal distribution of barcodes for 24, 48 and 96 samples.
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: INF_9189_v114_revJ_13Dec2024

1. Overview of the protocol

Introduction to the influenza whole genome sequencing protocol

This protocol has been upgraded to our Kit 14 chemistry and describes how to carry out PCR amplification and native barcoding of influenza amplicons using the Native Barcoding Kit 24 or 96 V14 (SQK-NBD114.24 or SQK-NBD114.96). There are 96 unique barcodes available, allowing the user to pool up to 96 different Influenza A and/or Influenza B samples in one sequencing experiment.

While this protocol is available in the Nanopore Community, we kindly ask users to ensure they are citing the following references, that this protocol is based on.

Single-reaction genomic amplification accelerates sequencing and vaccine production for classical and Swine origin human influenza A viruses by Bin Zhou et al., 2009. and Universal influenza B virus genomic amplification facilitates sequencing, diagnostics, and reverse genetics by Bin Zhou et al., 2014.


Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Ensure you have the sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Prepare your library

You will need to:

  • Perform RT-PCR amplification on influenza samples
  • Prepare the DNA ends for adapter attachment
  • Ligate native barcodes supplied in the kit to the DNA ends
  • Ligate sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
  • Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell

Sequencing

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and basecall the reads
  • Demultiplex barcoded reads in MinKNOW choosing the SQK-NBD114.24 or SQK-NBD114.96 kit option
  • Analyse your data using the Influenza typing workflow (wf-flu) in EPI2ME Labs.
IMPORTANTE

We do not recommend mixing barcoded libraries with non-barcoded libraries prior to sequencing.

IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

  • Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
  • Native Barcoding Kit 96 V14 (SQK-NBD114.96)
  • R10.4.1 flow cells (FLO-MIN114)
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
  • Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003)
  • Native Barcoding Expansion V14 (EXP-NBA114)

2. Equipment and consumables

Material
  • Input influenza RNA
  • Influenza A primers
  • Influenza B primers
  • Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) OR Native Barcoding Kit 96 V14 (SQK-NBD114.96)
  • SFB Expansion (EXP-SFB001)
Consumibles
  • SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (ThermoFisher, cat # 12574018 or 12574026)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
  • NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (NEB E7546) (Módulo de reparación de extremos/Adición de dA)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056) (Módulo de ligación rápida)
  • Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Eppendorf™, cat # 0030129504) with heat seals
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 15 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Reagent reservoirs for multichannel pipetting
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32851)
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
Instrumental
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Magnetic rack suitable for 96 well plates, e.g. DynaMag™-96 Side Skirted Magnet (Thermo Fisher CAT#12027)
  • Microfuge
  • Mezclador vórtex
  • Termociclador
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
  • Multichannel pipette and tips
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Cubeta con hielo
  • Temporizador
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Equipo opcional
  • PCR hoods with UV steriliser
  • PCR-Cooler (Eppendorf)
  • Eppendorf 5424 centrifuge (or equivalent)

For this protocol, you will need your extracted Influenza RNA input in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0.

A minimum volume of 1 µl is required per sample input of Influenza A or B.

If performing typing of an unknown sample, 2 µl of input will be required:

  • 1 µl input for the Influenza A primer mix
  • 1 µl for the Influenza B primer mix

Before starting

This protocol outlines how to carry out PCR amplification and native barcoding of influenza amplicons from multiple samples on a 96-well plate using the Native Barcoding Kit 24 or 96 V14 (SQK-NBD114.24 or SQK-NBD114.96).

When processing multiple samples simultaneously, we recommend making master mixes with an additional 10% of the volume. We also recommend using a template-free pre-PCR hood for making up the master mixes, and a separate template pre-PCR hood for handling the samples. It is important to clean and/or UV irradiate these hoods between sample batches. Furthermore, to track and monitor cross-contamination events, it is important to run a negative control reaction at the reverse transcription stage using nuclease-free water instead of sample, and carrying this control through the rest of the prep.

All post-PCR procedures must be carried out in a separate area to the pre-PCR preparation, with dedicated equipment for liquid handling in each area.

Reactivos de otros fabricantes

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Influenza primer sequences

Influenza A primer sequences described in the protocol originated from: Single-reaction genomic amplification accelerates sequencing and vaccine production for classical and Swine origin human influenza A viruses by Bin Zhou et al., 2009.

Component Sequence
Tuni 12 ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG
Tuni 12.4 ACGCGTGATCAGCGAAAGCAGG
Tuni 13 ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG

Influenza B primer sequences described in the protocol originated from: Universal influenza B virus genomic amplification facilitates sequencing, diagnostics, and reverse genetics by Bin Zhou et al., 2014.

Component Sequence
B-PBs-UniF GGGGGGAGCAGAAGCGGAGC
B-PBs-UniR CCGGGTTATTAGTAGAAACACGAGC
B-PA-UniF GGGGGGAGCAGAAGCGGTGC
B-PA-UniR CCGGGTTATTAGTAGAAACACGTGC
B-HANA-UniF GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC
B-HANA-UniR CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC
B-NP-UniF GGGGGGAGCAGAAGCACAGC
B-NP-UniR CCGGGTTATTAGTAGAAACAACAGC
B-M-Uni3F GGGGGGAGCAGAAGCACGCACTT
B-Mg-Uni3F GGGGGGAGCAGAAGCAGGCACTT
B-M-Uni3R CCGGGTTATTAGTAGAAACAACGCACTT
B-NS-Uni3F GGGGGGAGCAGAAGCAGAGGATT
B-NS-Uni3R CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGGATT
IMPORTANTE

Short Fragment Buffer (SFB)

Within the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) and Native Barcoding Kit 96 V14 (SQK-NBD114.96), Short Fragment Buffer (SFB) is supplied at the volume needed to complete the "reverse transcription, PCR and clean-up" and "adapter ligation and clean-up" steps of the protocol.

However, extra Short Fragment Buffer (SFB) is required for the "native barcode ligation" step of the protocol. This can be purchased with our SFB Expansion (EXP-SFB001).

IMPORTANTE

AMPure XP Beads

Within the Native Barcoding Kits V14 (SQK-NBD114.24 and SQK-NBD114.96), AMPure XP Beads (AXP) are supplied at the volume needed to complete the native barcoding sections of the protocol: "Native barcode ligation" and "Adapter ligation and clean-up".

However, extra AMPure XP Beads are required for the "Reverse transcription, PCR and clean-up" step of the protocol.

IMPORTANTE

The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) contents

Note: We are in the process of reformatting the barcodes provided in this kit into a plate format. This will reduce plastic waste and will facilitate automated applications.

Plate format

SQK-NBD114.24 plate format

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
DNA Control Sample DCS Yellow 2 35
Native Adapter NA Green 1 40
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Elution Buffer EB Black 2 500
AMPure XP Beads AXP Clear cap, light teal label 1 6,000
Long Fragment Buffer LFB Orange 1 1,800
Short Fragment Buffer SFB Clear 1 1,800
EDTA EDTA Blue 1 700
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200
Native Barcode plate NB01-24 - 2 plates, 3 sets of barcodes per plate 5 µl per well

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.


Vial format

SQK-NBD114.24 bottle format

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
Native Barcodes NB01-24 Clear 24 (one per barcode) 20
DNA Control Sample DCS Yellow 2 35
Native Adapter NA Green 1 40
Sequencing Buffer SB Red 1 700
Library Beads LIB Pink 1 600
Library Solution LIS White cap, pink label 1 600
Elution Buffer EB Black 2 500
AMPure XP Beads AXP Clear cap, light teal label 1 6,000
Long Fragment Buffer LFB Orange 1 1,800
Short Fragment Buffer SFB Clear 1 1,800
EDTA EDTA Blue 1 700
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 1 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 1 200

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.

Native Barcoding Kit 96 V14 (SQK-NBD114.96) contents

Note: We are in the process of updating our kits with reduced EDTA concentration.

Higher EDTA concentration format:

SQK-NBD114.96 2

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
Native Barcode plate NB01-96 - 3 plates 8 µl per well
DNA Control Sample DCS Yellow 3 35
Native Adapter NA Green 2 40
Sequencing Buffer SB Red 2 700
Library Beads LIB Pink 2 600
Library Solution LIS White cap, pink label 2 600
Elution Buffer EB Black 1 1,500
AMPure XP Beads AXP Amber 1 6,000
Long Fragment Buffer LFB Orange 1 7,500
Short Fragment Buffer SFB Clear 1 7,500
EDTA† EDTA Clear 1 700
Flow Cell Flush FCF Blue 1 15,500
Flow Cell Tether FCT Purple 2 200

† Higher concentration of EDTA with a clear cap.


Reduced EDTA concentration format:

SQK-NBD114.96 EDTA

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
Native Barcode plate NB01-96 - 3 plates 8 µl per well
DNA Control Sample DCS Yellow 3 35
Native Adapter NA Green 2 40
Sequencing Buffer SB Red 2 700
Library Beads LIB Pink 2 600
Library Solution LIS White cap, pink label 2 600
Elution Buffer EB Black 1 1,500
AMPure XP Beads AXP Clear cap, light teal 1 6,000
Long Fragment Buffer LFB Clear cap, orange label 1 7,500
Short Fragment Buffer SFB Clear cap, dark blue label 1 7,500
EDTA‡ EDTA Blue 1 700
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 1 15,500
Flow Cell Tether FCT Purple 2 200

‡ Reduced concentration of EDTA with a blue cap.

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

The barcodes are orientated in columns in the barcode plate.

2021-09-14 Native Barcoding 96 kit contents v2 columns

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.

To maximise the use of the Native Barcoding Kits, the Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) and the Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) expansion packs are available.

These expansions provide extra library preparation and flow cell priming reagents to allow users to utilise any unused barcodes for those running in smaller subsets.

Both expansion packs used together will provide enough reagents for 12 reactions. For customers requiring extra EDTA to maximise the use of barcodes, we recommend using 0.25 M EDTA and adding 4 µl for library preps using the SQK-NBD114.24 kit and 2 µl for preps using the SQK-NBD114.96 kit.

Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) contents:

EXP-NBA114 tubes

Note: This Product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) contents:

EXP-AUX003 bottles

Native barcode sequences

Below is the full list of our native barcode (NB01-96) sequences. The first 24 unique barcodes are available in the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24). The Native Barcoding Kit 96 V14 (SQK-NBD114.96) include the first 24 native barcodes, with the additional 72 unique barcodes. The native barcodes are shipped at 640 nM.

In addition to the barcodes, there are also flanking sequences which add an extra level of context during analysis.

Barcode flanking sequences:

Forward sequence: 5' - AAGGTTAA - barcode - CAGCACCT - 3' Reverse sequence: 5' - GGTGCTG - barcode - TTAACCTTAGCAAT - 3'


Native barcode sequences

Component Forward sequence Reverse sequence
NB01 CACAAAGACACCGACAACTTTCTT AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG
NB02 ACAGACGACTACAAACGGAATCGA TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT
NB03 CCTGGTAACTGGGACACAAGACTC GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG
NB04 TAGGGAAACACGATAGAATCCGAA TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA
NB05 AAGGTTACACAAACCCTGGACAAG CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT
NB06 GACTACTTTCTGCCTTTGCGAGAA TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC
NB07 AAGGATTCATTCCCACGGTAACAC GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT
NB08 ACGTAACTTGGTTTGTTCCCTGAA TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT
NB09 AACCAAGACTCGCTGTGCCTAGTT AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT
NB10 GAGAGGACAAAGGTTTCAACGCTT AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC
NB11 TCCATTCCCTCCGATAGATGAAAC GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA
NB12 TCCGATTCTGCTTCTTTCTACCTG CAGGTAGAAAGAAGCAGAATCGGA
NB13 AGAACGACTTCCATACTCGTGTGA TCACACGAGTATGGAAGTCGTTCT
NB14 AACGAGTCTCTTGGGACCCATAGA TCTATGGGTCCCAAGAGACTCGTT
NB15 AGGTCTACCTCGCTAACACCACTG CAGTGGTGTTAGCGAGGTAGACCT
NB16 CGTCAACTGACAGTGGTTCGTACT AGTACGAACCACTGTCAGTTGACG
NB17 ACCCTCCAGGAAAGTACCTCTGAT ATCAGAGGTACTTTCCTGGAGGGT
NB18 CCAAACCCAACAACCTAGATAGGC GCCTATCTAGGTTGTTGGGTTTGG
NB19 GTTCCTCGTGCAGTGTCAAGAGAT ATCTCTTGACACTGCACGAGGAAC
NB20 TTGCGTCCTGTTACGAGAACTCAT ATGAGTTCTCGTAACAGGACGCAA
NB21 GAGCCTCTCATTGTCCGTTCTCTA TAGAGAACGGACAATGAGAGGCTC
NB22 ACCACTGCCATGTATCAAAGTACG CGTACTTTGATACATGGCAGTGGT
NB23 CTTACTACCCAGTGAACCTCCTCG CGAGGAGGTTCACTGGGTAGTAAG
NB24 GCATAGTTCTGCATGATGGGTTAG CTAACCCATCATGCAGAACTATGC
NB25 GTAAGTTGGGTATGCAACGCAATG CATTGCGTTGCATACCCAACTTAC
NB26 CATACAGCGACTACGCATTCTCAT ATGAGAATGCGTAGTCGCTGTATG
NB27 CGACGGTTAGATTCACCTCTTACA TGTAAGAGGTGAATCTAACCGTCG
NB28 TGAAACCTAAGAAGGCACCGTATC GATACGGTGCCTTCTTAGGTTTCA
NB29 CTAGACACCTTGGGTTGACAGACC GGTCTGTCAACCCAAGGTGTCTAG
NB30 TCAGTGAGGATCTACTTCGACCCA TGGGTCGAAGTAGATCCTCACTGA
NB31 TGCGTACAGCAATCAGTTACATTG CAATGTAACTGATTGCTGTACGCA
NB32 CCAGTAGAAGTCCGACAACGTCAT ATGACGTTGTCGGACTTCTACTGG
NB33 CAGACTTGGTACGGTTGGGTAACT AGTTACCCAACCGTACCAAGTCTG
NB34 GGACGAAGAACTCAAGTCAAAGGC GCCTTTGACTTGAGTTCTTCGTCC
NB35 CTACTTACGAAGCTGAGGGACTGC GCAGTCCCTCAGCTTCGTAAGTAG
NB36 ATGTCCCAGTTAGAGGAGGAAACA TGTTTCCTCCTCTAACTGGGACAT
NB37 GCTTGCGATTGATGCTTAGTATCA TGATACTAAGCATCAATCGCAAGC
NB38 ACCACAGGAGGACGATACAGAGAA TTCTCTGTATCGTCCTCCTGTGGT
NB39 CCACAGTGTCAACTAGAGCCTCTC GAGAGGCTCTAGTTGACACTGTGG
NB40 TAGTTTGGATGACCAAGGATAGCC GGCTATCCTTGGTCATCCAAACTA
NB41 GGAGTTCGTCCAGAGAAGTACACG CGTGTACTTCTCTGGACGAACTCC
NB42 CTACGTGTAAGGCATACCTGCCAG CTGGCAGGTATGCCTTACACGTAG
NB43 CTTTCGTTGTTGACTCGACGGTAG CTACCGTCGAGTCAACAACGAAAG
NB44 AGTAGAAAGGGTTCCTTCCCACTC GAGTGGGAAGGAACCCTTTCTACT
NB45 GATCCAACAGAGATGCCTTCAGTG CACTGAAGGCATCTCTGTTGGATC
NB46 GCTGTGTTCCACTTCATTCTCCTG CAGGAGAATGAAGTGGAACACAGC
NB47 GTGCAACTTTCCCACAGGTAGTTC GAACTACCTGTGGGAAAGTTGCAC
NB48 CATCTGGAACGTGGTACACCTGTA TACAGGTGTACCACGTTCCAGATG
NB49 ACTGGTGCAGCTTTGAACATCTAG CTAGATGTTCAAAGCTGCACCAGT
NB50 ATGGACTTTGGTAACTTCCTGCGT ACGCAGGAAGTTACCAAAGTCCAT
NB51 GTTGAATGAGCCTACTGGGTCCTC GAGGACCCAGTAGGCTCATTCAAC
NB52 TGAGAGACAAGATTGTTCGTGGAC GTCCACGAACAATCTTGTCTCTCA
NB53 AGATTCAGACCGTCTCATGCAAAG CTTTGCATGAGACGGTCTGAATCT
NB54 CAAGAGCTTTGACTAAGGAGCATG CATGCTCCTTAGTCAAAGCTCTTG
NB55 TGGAAGATGAGACCCTGATCTACG CGTAGATCAGGGTCTCATCTTCCA
NB56 TCACTACTCAACAGGTGGCATGAA TTCATGCCACCTGTTGAGTAGTGA
NB57 GCTAGGTCAATCTCCTTCGGAAGT ACTTCCGAAGGAGATTGACCTAGC
NB58 CAGGTTACTCCTCCGTGAGTCTGA TCAGACTCACGGAGGAGTAACCTG
NB59 TCAATCAAGAAGGGAAAGCAAGGT ACCTTGCTTTCCCTTCTTGATTGA
NB60 CATGTTCAACCAAGGCTTCTATGG CCATAGAAGCCTTGGTTGAACATG
NB61 AGAGGGTACTATGTGCCTCAGCAC GTGCTGAGGCACATAGTACCCTCT
NB62 CACCCACACTTACTTCAGGACGTA TACGTCCTGAAGTAAGTGTGGGTG
NB63 TTCTGAAGTTCCTGGGTCTTGAAC GTTCAAGACCCAGGAACTTCAGAA
NB64 GACAGACACCGTTCATCGACTTTC GAAAGTCGATGAACGGTGTCTGTC
NB65 TTCTCAGTCTTCCTCCAGACAAGG CCTTGTCTGGAGGAAGACTGAGAA
NB66 CCGATCCTTGTGGCTTCTAACTTC GAAGTTAGAAGCCACAAGGATCGG
NB67 GTTTGTCATACTCGTGTGCTCACC GGTGAGCACACGAGTATGACAAAC
NB68 GAATCTAAGCAAACACGAAGGTGG CCACCTTCGTGTTTGCTTAGATTC
NB69 TACAGTCCGAGCCTCATGTGATCT AGATCACATGAGGCTCGGACTGTA
NB70 ACCGAGATCCTACGAATGGAGTGT ACACTCCATTCGTAGGATCTCGGT
NB71 CCTGGGAGCATCAGGTAGTAACAG CTGTTACTACCTGATGCTCCCAGG
NB72 TAGCTGACTGTCTTCCATACCGAC GTCGGTATGGAAGACAGTCAGCTA
NB73 AAGAAACAGGATGACAGAACCCTC GAGGGTTCTGTCATCCTGTTTCTT
NB74 TACAAGCATCCCAACACTTCCACT AGTGGAAGTGTTGGGATGCTTGTA
NB75 GACCATTGTGATGAACCCTGTTGT ACAACAGGGTTCATCACAATGGTC
NB76 ATGCTTGTTACATCAACCCTGGAC GTCCAGGGTTGATGTAACAAGCAT
NB77 CGACCTGTTTCTCAGGGATACAAC GTTGTATCCCTGAGAAACAGGTCG
NB78 AACAACCGAACCTTTGAATCAGAA TTCTGATTCAAAGGTTCGGTTGTT
NB79 TCTCGGAGATAGTTCTCACTGCTG CAGCAGTGAGAACTATCTCCGAGA
NB80 CGGATGAACATAGGATAGCGATTC GAATCGCTATCCTATGTTCATCCG
NB81 CCTCATCTTGTGAAGTTGTTTCGG CCGAAACAACTTCACAAGATGAGG
NB82 ACGGTATGTCGAGTTCCAGGACTA TAGTCCTGGAACTCGACATACCGT
NB83 TGGCTTGATCTAGGTAAGGTCGAA TTCGACCTTACCTAGATCAAGCCA
NB84 GTAGTGGACCTAGAACCTGTGCCA TGGCACAGGTTCTAGGTCCACTAC
NB85 AACGGAGGAGTTAGTTGGATGATC GATCATCCAACTAACTCCTCCGTT
NB86 AGGTGATCCCAACAAGCGTAAGTA TACTTACGCTTGTTGGGATCACCT
NB87 TACATGCTCCTGTTGTTAGGGAGG CCTCCCTAACAACAGGAGCATGTA
NB88 TCTTCTACTACCGATCCGAAGCAG CTGCTTCGGATCGGTAGTAGAAGA
NB89 ACAGCATCAATGTTTGGCTAGTTG CAACTAGCCAAACATTGATGCTGT
NB90 GATGTAGAGGGTACGGTTTGAGGC GCCTCAAACCGTACCCTCTACATC
NB91 GGCTCCATAGGAACTCACGCTACT AGTAGCGTGAGTTCCTATGGAGCC
NB92 TTGTGAGTGGAAAGATACAGGACC GGTCCTGTATCTTTCCACTCACAA
NB93 AGTTTCCATCACTTCAGACTTGGG CCCAAGTCTGAAGTGATGGAAACT
NB94 GATTGTCCTCAAACTGCCACCTAC GTAGGTGGCAGTTTGAGGACAATC
NB95 CCTGTCTGGAAGAAGAATGGACTT AAGTCCATTCTTCTTCCAGACAGG
NB96 CTGAACGGTCATAGAGTCCACCAT ATGGTGGACTCTATGACCGTTCAG

3. Computer requirements and software

Requisitos informáticos para el MinION Mk1B

Para secuenciar con el MinION Mk1B es necesario tener un ordenador o portátil de alto rendimiento, que pueda soportar la velocidad de adquisición de datos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1B IT Requirements.

Requisitos informáticos para el MinION Mk1C

El MinION Mk1C contiene ordenador y pantalla integrados, lo que elimina la dependencia de cualquier accesorio para generar y analizar datos de nanoporos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1C IT Requirements.

MinION Mk1D IT requirements

Sequencing on a MinION Mk1D requires a high-spec computer or laptop to keep up with the rate of data acquisition. For more information, refer to the MinION Mk1D IT requirements document.

Software for nanopore sequencing

MinKNOW

The MinKNOW software controls the nanopore sequencing device, collects sequencing data and basecalls in real time. You will be using MinKNOW for every sequencing experiment to sequence, basecall and demultiplex if your samples were barcoded.

For instructions on how to run the MinKNOW software, please refer to the MinKNOW protocol.

EPI2ME (optional)

The EPI2ME cloud-based platform performs further analysis of basecalled data, for example alignment to the Lambda genome, barcoding, or taxonomic classification. You will use the EPI2ME platform only if you would like further analysis of your data post-basecalling.

For instructions on how to create an EPI2ME account and install the EPI2ME Desktop Agent, please refer to this link.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000

4. Reverse transcription, PCR and clean-up

Material
  • Input influenza RNA
  • Influenza A primers
  • Influenza B primers
Consumibles
  • SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (ThermoFisher, cat # 12574018 or 12574026)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat # AM9937)
  • Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Cat # 0030129504) with heat seals
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • 5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 15 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
  • Termociclador
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
  • Multichannel pipettes suitable for dispensing 20–200 μl, and tips
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • P20 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P10
  • P2 pipette and tips
  • Magnetic rack suitable for 96 well plates, e.g. DynaMag™-96 Side Skirted Magnet (Thermo Fisher CAT#12027)
  • Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
  • Microfuge
Equipo opcional
  • PCR hoods with UV steriliser
  • PCR-Cooler (Eppendorf) or ice bucket with ice
IMPORTANTE

Keep the RNA sample on ice as much as possible to prevent nucleolytic degradation, which may affect sensitivity.

To reduce risk of contamination, we recommend the use of PCR hoods with a UV steriliser when setting up the PCR plates.

  • When handling the primer stocks and derivatives, use a clean template-free PCR hood.
  • When handling the samples and/or a positive control, use a clean template-addition PCR hood.

In a clean template-free pre-PCR hood, prepare the primer mixes for influenza A and influenza B as follows in 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes:

Note: The volume requirements can be adjusted according to stock concentrations and experiment needs.

Influenza A primer mix

Primer Concentration Volume
Nuclease-free water - 378 µl
Tuni 12 100 µM 16.8 µl
Tuni 12.4 100 µM 4.2 µl
Tuni 13 100 µM 21 µl
Total 420 µl

Influenza B primer mix

Primer Concentration Volume
Nuclease-free water - 378 µl
B-PBs-UniF 100 µM 5 µl
B-PBs-UniR 100 µM 5 µl
B-PA-UniF 100 µM 2.5 µl
B-PA-UniR 100 µM 2.5 µl
B-HANA-UniF 100 µM 5 µl
B-HANA-UniR 100 µM 5 µl
B-NP-UniF 100 µM 3 µl
B-NP-UniR 100 µM 3 µl
B-M-Uni3F 100 µM 1.5 µl
B-Mg-Uni3F 100 µM 1.5 µl
B-M-Uni3R 100 µM 3 µl
B-NS-Uni3F 100 µM 2.5 µl
B-NS-Uni3R 100 µM 2.5 µl
Total 420 µl

In the template-free pre-PCR hood, prepare the following master mixes in Eppendorf DNA LoBind tubes and mix thoroughly as follows:

For X12 samples, use 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes:

Component Influenza A RT-PCR Master Mix Influenza B RT-PCR Master Mix
Nuclease free water 280 µl 280 µl
Influenza A primer mix 28 µl -
Influenza B primer mix - 28 µl
2X Reaction Mix 350 µl 350 µl
SuperScript™ III RT/Platinum™ Taq Mix 28 µl 28 µl
Total volume 686 µl 686 µl

For X24 samples, use 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes:

Component Influenza A RT-PCR Master Mix Influenza B RT-PCR Master Mix
Nuclease free water 560 µl 560 µl
Influenza A primer mix 56 µl -
Influenza B primer mix - 56 µl
2X Reaction Mix 700 µl 700 µl
SuperScript™ III RT/Platinum™ Taq Mix 56 µl 56 µl
Total volume 1372 µl 1372 µl

For X48 samples, use 5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes:

Component Influenza A RT-PCR Master Mix Influenza B RT-PCR Master Mix
Nuclease free water 1120 µl 1120 µl
Influenza A primer mix 112 µl -
Influenza B primer mix - 112 µl
2X Reaction Mix 1400 µl 1400 µl
SuperScript™ III RT/Platinum™ Taq Mix 112 µl 112 µl
Total volume 2744 µl 2744 µl

For X96 samples, use 15 ml Eppendorf DNA LoBind tubes:

Component Influenza A RT-PCR Master Mix Influenza B RT-PCR Master Mix
Nuclease free water 2240 µl 2240 µl
Influenza A primer mix 224 µl -
Influenza B primer mix - 224 µl
2X Reaction Mix 2800 µl 2800 µl
SuperScript™ III RT/Platinum™ Taq Mix 224 µl 224 µl
Total volume 5488 µl 5488 µl

For each influenza type, place a clean 96-well RT-PCR plate into a PCR-cooler or ice bucket with ice (if using).

Note: Enusre the RT-PCR plates for each influenza type are separate:

  • One plate for Influenza A (Influenza A RT-PCR plate)
  • One plate for Influenza B (Influenza B RT-PCR plate)

Using a stepper pipette or a multichannel pipette, aliquot 49 µl of influenza A RT-PCR Master Mix into the influenza A RT-PCR plate.

Using a stepper pipette or a multichannel pipette, aliquot 49 µl of influenza B RT-PCR Master Mix into the influenza B RT-PCR plate.

IMPORTANTE

We recommend having a negative control for every plate of samples to monitor for contamination events.

Use 1 µl of nuclease-free water as your negative control input into a single well of each Influenza RT-PCR plate.

Seal the RT-PCR plate(s) and transfer to a template-addition pre-PCR hood.

Transfer 1 µl of influenza A samples to the wells containing influenza A RT-PCR Master Mix in the influenza A RT-PCR plate and mix thoroughly by pipetting the contents of each well up and down.

Transfer 1 µl of influenza B samples to the wells containing influenza B RT-PCR Master Mix in the influenza B RT-PCR plate and mix thoroughly by pipetting the contents of each well up and down.

Seal the RT-PCR plate(s) and spin down in a centrifuge.

IMPORTANTE

Please note the thermal cycler programs are different for the Influenza A RT-PCR and Influenza B RT-PCR reactions.

Ensure you are using the correct program for your reaction plate.

Incubate the influenza A RT-PCR plate using the following program, with the heated lid set to 105°C:

Step Temperature Time Cycles
cDNA synthesis 42°C 60 min 1
Initial denaturation 94°C 2 min 1
Denaturation

Annealing and extension		 94°C

45°C
68°C		 30 sec

30 sec
3 min
5
Denaturation

Annealing and extension		 94°C

57°C
68°C		 30 sec

30 sec
3 min
31
Hold 4°C ∞

Incubate the influenza B RT-PCR plate using the following program, with the heated lid set to 105°C:

Step Temperature Time Cycles
cDNA synthesis 45°C 60 min 1
cDNA synthesis 55°C 30 min 1
Initial denaturation 94°C 2 min 1
Denaturation

Annealing and extension		 94°C

40°C
68°C		 20 sec

30 sec
3 min 30 sec
5
Denaturation

Annealing and extension		 94°C

58°C
68°C		 20 sec

30 sec
3 min 30 sec
30
Final extension 68°C 10 min 1
Hold 4°C ∞
MEDIDA OPCIONAL

If necessary, the protocol can be paused at this point. The samples should be kept at 4°C and can be stored overnight.

IMPORTANTE

From this point onwards, a clean post-PCR hood can be used if available. Decontamination with UV and or DNAzap between sample batches is recommended.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 50 µl of resuspended AMPure XP beads to each well of the RT-PCR plate(s) and mix by gently pipetting.

Incubate the PT-PCR plate(s) at room temperature for 10 minutes.

Prepare at least 500 µl 80% ethanol in nuclease-free water per sample.

Spin down the RT-PCR plate(s) and pellet the beads on a magnet for 5 minutes. Keep the plate on the magnet until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.

Keep the plate on the magnet and wash the beads in each well with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repeat the previous step.

Spin down and place the plate back on the magnet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the plate from the magnetic rack and resuspend each pellet in 15 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 15 µl of eluate containing the DNA per well, into a clean 96-well plate(s).

Dispose of the pelleted beads.

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of each eluted sample using a Qubit fluorometer.

FIN DEL PROCESO

Take forward your quantified samples to the end-prep step.

However, at this point it is also possible to store the samples at 4°C overnight.

For long-term storage or to store any unused amplified material for use in later experiments, store your samples at -20°C.

5. End-prep

Consumibles
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat # AM9937)
  • NEBNext® Ultra™ II End Repair/dA-Tailing Module (E7546)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Cat # 0030129504) with heat seals
Instrumental
  • Multichannel pipette capable of dispensing 0.5 – 10 µL, and tips
  • P1000 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P200
  • P100 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Termociclador
  • Microfuge
  • Cubeta con hielo
  • Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
  • Vortex mixer
IMPORTANTE

We recommended carrying the negative control through this step until sequencing.

Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Ensure the reagents are well mixed.
    Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.

Determine the volume of the cleaned-up PCR reaction that yields 200 fmol of DNA per sample and aliquot into a clean 96-well plate (End-prep plate).

Make up each sample per well to 12.5 µl using nuclease-free water.

Prepare the following end-prep master mix in 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube and mix thoroughly by pipetting:

Reagent Volume per reaction For X24 samples For X48 samples For X96 samples
Ultra II End-prep reaction buffer 1.75 µl 52.5 µl 105 µl 210 µl
Ultra II End-prep enzyme mix 0.75 µl 22.5 µl 45 µl 90 µl
Total 2.5 µl 75 µl 150 µl 300 µl

Using a stepper pipette or multi-channel pipette, add 2.5 µl of the end-prep master mix to each well containing 12.5 µl sample.

Ensure the reactions are thoroughly mixed by pipetting. Seal the End-prep plate and spin down briefly.

Using a thermal cycler, incubate the plate at 20°C for 5 minutes and 65°C for 5 minutes.

FIN DEL PROCESO

Take forward the end-prepped DNA into the native barcode ligation step.

If users want to pause the library preparation here, we recommend cleaning up your sample with 1X Agencourt AMPure XP beads and eluting in nuclease-free water before storing at 4°C.

6. Native barcode ligation

Material
  • Native Barcodes (NB01-24) OR Native Barcodes (NB01-NB96)
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
  • EDTA (EDTA)
  • Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
Consumibles
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
Instrumental
  • Magnetic rack suitable for 96-well plates
  • Termociclador
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Mezclador vórtex
  • Cubeta con hielo
  • Microcentrífuga
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P10
Equipo opcional
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
IMPORTANTE

To monitor cross-contamination events, we recommend that the negative control is carried through this process and a barcode is used to sequence this control.

Prepare the NEB Blunt/TA Ligase Master Mix according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes.

Thaw kit components at room temperature, then spin down briefly using a microfuge and mix as indicated by the table below. Then place on ice:

Reagent 1. Thaw at room temperature 2. Briefly spin down 3. Mix by pipetting or vortexing 4. Place on ice
EDTA (EDTA) ✓ ✓ Vortexing ✓
Native Barcodes (NB01-24) or (NB01-96) ✓ ✓ Only pipette mix immediately before use ✓
Short Fragment Buffer (SFB) ✓ ✓ Vortexing ✓

Select a unique barcode for each sample to be run together on the same flow cell.

Please note: Only use one barcode per sample.

Using a stepper pipette, or a multichannel pipette, make up the Native Barcode Ligation Plate in a clean 96-well plate. Add the reagents in the following order per well:

Reagent Volume per well for up to x24 samples Volume per well for x25—x96 samples
Nuclease-free water 6 µl 3 µl
End-prepped DNA
Note: Transfer to the corresponding well		 1.5 µl 0.75 µl
Native barcode
Note: Transfer to the corresponding well		 2.5 µl 1.25 µl
Blunt/TA Ligation Master Mix 10 µl 5 µl
Total 20 µl 10 µl

Depending on the number of samples, aliquot to each well of the columns:

Plate location x24 samples x48 samples x96 samples
Columns 1-3 1-6 1-12

NB Ligation Plate prep

Mix the contents thoroughly by pipetting.

Seal the plate(s) and spin down briefly.

Incubate for 20 minutes at room temperature.

Add EDTA to each well and mix thoroughly by pipetting and spin down briefly.

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

Up to x24 samples x25 — x96 samples
Volume of clear capped EDTA per sample 2 µl 1 µl
Volume of blue capped EDTA per sample 4 µl 2 µl
CONSEJO

EDTA is added at this step to stop the reaction.

Pool the barcoded samples in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube:

Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.

x24 samples x48 samples x96 samples
Total volume for preps using clear cap EDTA ~528 µl ~528 µl ~1,056 µl
Total volume for preps using blue cap EDTA ~576 µl ~576 µl ~1,152 µl
CONSEJO

We recommend checking the base of your tubes/plate are all the same volume before pooling and after to ensure all the liquid has been taken forward.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

Add AMPure XP Beads (AXP) to the pooled reaction, and mix by pipetting for a 0.4X clean.

Volume for 10 µl of sample For 265 µl of samples For 528 µl of samples For 1,056 µl of samples
Volume of AXP 4 µl 106 µl 211 µl 422 µl

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Prepare 500 µl of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.

Spin down the sample and pellet the beads on a magnet for 5 minutes. Keep the tube on the magnet until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.

Wash the beads by adding 700 μl Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 100 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 35 µl nuclease-free water by gently flicking.

Incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.

Note: If stuggling to obtain the necessary yield, increasing the incubation period up to 30 minutes may improve elution efficacy.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Remove and retain 35 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

FIN DEL PROCESO

Take forward the barcoded DNA library to the adapter ligation and clean-up step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

7. Adapter ligation and clean-up

Material
  • Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
  • Elution Buffer (EB)
  • Native Adapter (NA)
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
Consumibles
  • NEBNext® Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32851)
Instrumental
  • Microcentrífuga
  • Gradilla magnética
  • Mezclador vórtex
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Termociclador
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Ice bucket with ice
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
IMPORTANTE

The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Prepare the NEBNext Quick Ligation Reaction Module according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes. Note: Do NOT vortex the Quick T4 DNA Ligase.

The NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5x) may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for several seconds to ensure the reagent is thoroughly mixed.

IMPORTANTE

Do not vortex the Quick T4 DNA Ligase.

Spin down the Native Adapter (NA) and Quick T4 DNA Ligase, pipette mix and place on ice.

Thaw the Elution Buffer (EB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

Thaw the Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

In a 1.5 ml Eppendorf LoBind tube, mix in the following order:

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent Volume
Pooled barcoded sample 30 µl
Native Adapter (NA) 5 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5X) 10 µl
Quick T4 DNA Ligase 5 µl
Total 50 µl

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.

Incubate the reaction for 20 minutes at room temperature.

IMPORTANTE

The next clean-up step uses Short Fragment Buffer (SFB) and not 80% ethanol to wash the beads. The use of ethanol will be detrimental to the sequencing reaction.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

Add 20 µl of resuspended AMPure XP Beads (AXP) to the reaction and mix by pipetting.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Spin down the sample and pellet the beads on a magnet for 5 minutes. Keep the tube on the magnet until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.

Wash the beads by adding 125 μl Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Keep the tube on the magnet until the eluate is clear and colourless. Remove the supernatant using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 15 µl Elution Buffer (EB).

Spin down and incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 15 μl del eluido que contiene la biblioteca de ADN y conservar en un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.

Deshechar las microesferas precipitadas.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

Depending on your DNA library fragment size, prepare your final library in 12 µl of Elution Buffer (EB).

Fragment library length Flow cell loading amount
Very short (<1 kb) 100 fmol
Short (1-10 kb) 35–50 fmol
Long (>10 kb) 300 ng

Note: If the library yields are below the input recommendations, load the entire library.

If required, we recommend using a mass to mol calculator such as the NEB calculator.

FIN DEL PROCESO

The prepared library is used for loading onto the flow cell. Store the library on ice or at 4°C until ready to load.

CONSEJO

Recomendaciones de guardado de la biblioteca

Se recomienda guardar las bibliotecas en tubos Eppendorf DNA LoBind a 4 ⁰C, durante periodos de tiempo cortos o en caso de uso repetido, por ejemplo, para recargar celdas de flujo entre lavados. Para uso individual y para conservar a largo plazo por periodos de más de 3 meses, se recomienda guardar las bibliotecas a -80 ⁰C en tubos Eppendorf DNA LoBind.

MEDIDA OPCIONAL

If quantities allow, the library may be diluted in Elution Buffer (EB) for splitting across multiple flow cells.

Depending on how many flow cells the library will be split across, more Elution Buffer (EB) than what is supplied in the kit will be required.

8. Priming and loading the SpotON flow cell

Material
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
  • Sequencing Buffer (SB)
Consumibles
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • SpotON Flow Cell
  • Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE

Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).

CONSEJO

Cebado y carga de la celda de flujo

Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Uso de Library Solution (LIS)

En la mayoría de experimentos de secuenciación, recomendamos usar Library Beads (LIB) para cargar la biblioteca en la celda de flujo. Nótese, si previamente se ha usado agua para cargar la biblioteca, se deberá usar Library Solution (LIS) en su lugar. Nota: Algunos clientes han notado que las bibliotecas viscosas pueden cargarse con mayor facilidad cuando no se usan Library Beads (LIB).

Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

IMPORTANTE

Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.

Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).

Para preparar la mezcla de cebado con seroalbúmina bovina, mezclar Flow Cell Flush (FCF) y Flow Cell Tether (FCT) como se indica a continuación. Mezclar con la pipeta a temperatura ambiente.

Nota: Hemos cambiando el formato de algunos de los viales de nuestros kits, de tubos monouso a botellas de mayor cantidad.

Formato en tubos monouso En el tubo de Flow Cell Flush (FCF), añadir directamente 5 µl de seroalbúmina bovina (BSA), a una concentración de 50 mg/ml y 30 µl de Flow Cell Tether (FCT).

Formato en botella: En un tubo proporcionado a la cantidad de celdas de flujo que se vayan a utilizar, mezclar los siguientes reactivos:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Flow Cell Flush (FCF) 1 170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) a una concentración de 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Volumen total 1 205 µl

Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a

Paso 1b- Diagramas carga de la celda de flujo ES

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:

  1. Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
  2. Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
  3. Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5 SPANISH

Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).

IMPORTANTE

Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.

En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.

En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Sequencing Buffer (SB) 37,5 µl
Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere 25,5 µl
Biblioteca de ADN 12 µl
Total 75 µl

Completar el cebado de la celda de flujo:

  1. Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
  2. Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

Flow Cell Loading Diagrams Step 5

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5 SPANISH 2

Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.

Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.

Flow Cell Loading Diagram Step 07 V5 SPANISH

Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.

Step 8 update - SPANISH

Flow Cell Loading Diagrams Step 9 SPANISH

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:

  1. Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.

  2. Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised. SPANISH

ATENCIÓN

La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.

FIN DEL PROCESO

Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.

9. Data acquisition and basecalling

Aspectos generales del análisis de datos de nanoporos

Para obtener una descripción completa del análisis de datos de nanoporos, que incluya distintas posibilidades para el análisis de identificación y postidentificicación de bases, consultar el documento Data Analysis.

IMPORTANTE

Required settings in MinKNOW

The correct barcoding parameters must be set up on MinKNOW prior to the sequencing run. During the run setup, in the Analysis tab, enable Barcoding. Click Edit options and enable Barcode both ends and Mid-read barcodes. Optional: basecalling and/or demultiplexing of sequences can be performed using the stand-alone Guppy software.

Edit options barcoding FLU v14

Barcoding options FLU V14

Cómo empezar a secuenciar

El programa MinKNOW realiza el control del dispositivo de secuenciación, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Una vez que el usuario ha instalado MinKNOW en su ordenador, hay diferentes maneras de llevar a cabo la secuenciación:

1. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el programa MinKNOW.

Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run".

2. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo GridION.

Seguir las instrucciones del manual de usuario de GridION.

3. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo MinION Mk1C.

Seguir las instrucciones del manual de usuario de MinION Mk1C.

4. Adquisición de datos e identificación de bases en tiempo real con el dispositivo PromethION.

Seguir las instrucciones de los manuales de usuario de PromethION o PromethION 2 Solo.

5. Adquisición de datos e identificación de bases posterior mediante MinKNOW.

Seguir las instrucciones del protocolo de MinKNOW, desde el apartado "Starting a sequencing run" hasta el final del apartado "Completing a MinKNOW run". Al configurar los parámetros del experimento, ajustar la pestaña Basecalling (Identificación de bases) en posición de APAGADO. Al terminar el experimento de secuenciación, seguir las instrucciones del apartado "Post-run analysis" del protocolo de MinKNOW.

10. Downstream analysis

Recommended analysis pipeline

The analysis of the FASTQ format sequence data is performed using a Nextflow workflow called Influenza Typing Workflow (wf-flu). The use of the Nextflow software has been integrated into the EPI2ME Labs software that we recommend for running our downstream analysis methods.

Alternative methods for downstream analysis are available using your device terminal or command line, however we only suggest this for experienced users.

The workflow processes the basecalled and demultiplexed DNA sequence data output generated by MinKNOW:

  • The sequences are filtered for a minimum length and quality thresholds (200 nucleotides and Q9 respectively) prior to sequence alignment to the CDC multi-fasta Influenza reference.
  • The alignment is performed using the Minimap2 software.
  • Depth of coverage across the mapped sequences is measured using Samtools before genetic variants are called using Medaka.
  • A coverage-masked consensus sequence is prepared for each sample using bcftools.
  • The influenza strain typing is then performed using the abricate software with an insaflu database.

The influenza strains included in the database are listed in the project documentation pages for the Influenza Typing Workflow.

The workflow returns a per-run HTML-format summary report along with a CSV file of typing results. Additional files that include mapping BAM files and VCF files of Medaka variants are also included in the workflow output.

For more information, please refer to the Influenza workflow blog.

Software set-up and installation

The EPI2ME application provides a clean interface to accessing bioinformatics workflows, and is our recommended method in performing your post-sequencing analysis.

Follow the instructions in the EPI2ME Installation guide to install the application on your device.

For more information on how to use EPI2ME, refer to the EPI2ME Quick Start guide.

Installing and updating the wf-flu workflow in EPI2ME Labs:

Ensure you have installed the wf-flu workflow prior to the first analysis set-up.

In the EPI2ME Labs home page, scroll down to the "Install workflows" section and click on epi2me-labs/wf-flu:

EPI2ME FLU 1

If you have already installed the wf-flu workflow, ensure you are using the latest version.

Updating the workflow can be done directly through EPI2ME Labs by navigating to the wf-flu workflow page and clicking Update Workflow:

EPI2ME FLU 2

Demultiplexing of multiple barcoded samples

The wf-flu analysis requires FASTQ sequence data that has already been demultiplexed.

Reads will be demultiplexed during sequencing if you are following the recommended "Required settings in MinKNOW". However, demultiplexing can also be done post-sequencing using the MinKNOW software.

For more information and guides on demultiplexing using MinKNOW, refer to the "Post-run analysis" section in our MinKNOW Protocol.

The expected input for wf-flu is a folder of folders as shown below. Each of the barcode folders should contain the FASTQ sequence data and files may either be uncompressed or gzipped.

$ tree -d FluFastq/

FluFastq/

├── barcode01

├── barcode02

├── barcode03

├── barcode04

├── barcode05

├── barcode06

└── unclassified

IMPORTANTE

Basecalling model

The basecalling model should be specified when setting up the wf-flu analysis. This should reflect the basecalling model selected during your run set-up as follows:

  • If using the default model, High-accuracy basecalling (HAC): r1041_e82_400bps_hac_variant_g615
  • If you have used Super accurate basecalling (SUP), please use: r1041_e82_400bps_sup_variant_g615
  • If you have used FAST basecalling, please use: r1041_e82_400bps_fast_variant_g615

Running a Flu analysis using EPI2ME Labs

Open the EPI2ME Labs application on your device.

EPI2ME labs application logo

Open the "Workflows" tab in the EPI2ME Labs application and click on the "wf-flu" workflow:

EPI2ME FLU 3

In the "wf-flu" workflow page, select "Run this workflow" to open analysis set-up:

EPI2ME FLU 4

Complete the wf-flu run set-up:

Select your data input file location. Please note, this folder must contain the demultiplexed FASTQ files of your sequencing run.

Set the basecaller cgf to the basecalling model used in your sequencing run.

EPI2ME FLU 5

Expand the Extra configuration tab and set the Run name for your wf-flu analysis.

EPI2ME FLU 7

Click Launch workflow at the bottom of the page to begin your analysis.

Completed analysis and result files

The wf-flu analysis outputs will be written to the Working Directory folder specified in the EPI2ME Labs Settings tab. The location of this folder is specified in the wf-flu run Instance parameters preceeded by out_dir.

However, these files can also be accessed directly in the EPI2ME Labs application from the completed analysis page for your run:

EPI2ME FLU 8

Housekeeping and disk usage

The "Working Directory" can be specified in the EPI2ME Labs "Settings" tab and defines where the workflow intermediate files and outputs are stored.

This folder will accumulate a significant number of files that correspond to raw BAM files, other larger intermediates and analysis results files. We recommend this folder to be routinely cleared.

11. Reutilización y devolución de celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a entre 2 °C y 8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

12. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation for Kit 14

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <70 % Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

13. Issues during the sequencing run for Kit 14

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell 10–20 fmol of good quality library can be loaded on to a MinION/GridION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Native Barcoding Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones:

1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Reduction in sequencing speed and q-score later into the run

Observation Possible cause Comments and actions
Reduction in sequencing speed and q-score later into the run Fast fuel consumption is typically seen in Kit 9 chemistry (e.g. SQK-LSK109) when the flow cell is overloaded with library. Please see the appropriate protocol for your DNA library to find the recommendation. Add more fuel to the flow cell by following the instructions in the MinKNOW protocol. In future experiments, load lower amounts of library to the flow cell.

Fluctuación de la temperatura

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace.

Last updated: 12/13/2024

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