This protocol requires the use of two kits to generate the dual barcoded libraries:

• PCR Barcoding Expansion 1-96 (EXP-PBC096): up to 96 unique barcodes are available. These PCR barcodes are used as the primary "inner" barcodes.
• Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24): up to 24 unique barcodes are available. These native barcodes are used as the secondary "outer" barcodes.

These kits are used in successive order and recommended for users who:

• Want to multiplex up to 2,304 samples, depending on the barcodes they are using from each expansion.
• Would like to achieve raw read sequencing modal accuracy of Q20+ (99%) or above.
• Require control over read length.
• Would like to utilise upstream processes such as size selection or whole genome amplification.

This protocol allows massively parallel sequencing of up to 2,304 samples (gDNA or amplicons) on a single flow cell. It uses both the PCR Barcoding Expansion 1-96 (EXP-PBC096) and the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24).

Samples are initially PCR barcoded with the PCR Barcoding Expansion 1-96 (EXP-PBC096), allowing up to 96 samples to be pooled together. There can be up to 24 pools of 96 samples. Each pool of 96 samples will then undergo secondary barcoding through the ligation of one of 24 native barcodes using the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24). After secondary barcoding, all pools are combined into a single library for sequencing.

Note: For amplicon inputs, first-round PCR product with the following tailed primers are required. 5’ TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC-[ project-specific forward primer sequence ] 3’ 5’ ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC-[ project-specific reverse primer sequence ] 3’

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

• Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
• Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
• Download the software for acquiring and analysing your data
• Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

You will need to:

• Prepare the DNA ends for adapter attachment
• Attach barcoding adapters supplied in the 96 PCR Barcoding kit to the DNA ends
• Amplify each barcoded sample by PCR, then pool the 96 samples together (up to 24 pools of 96 samples can be generated)
• Prepare the DNA ends of your pooled samples for native barcode attachment
• Ligate native barcodes to the DNA ends for each pool of 96 samples
• Pool up to 24 native barcoded libraries together
• Attach sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends of your combined dual barcoded libraries
• Prime the flow cell, and load your dual barcoded DNA library into the flow cell

Sequencing and analysis

You will need to:

• In the current MinKNOW software version, we recommend setting up live basecalling during the sequencing run without live barcoding. Demultiplexing of the dual barcoded reads will be carried out post-run:
  • Start a sequencing run in the MinKNOW software using SQK-LSK114, which will collect raw data from the device and basecall the reads.
  • Demultiplex your run post-sequencing unsing the MinKNOW software.
• Start the EPI2ME software and select the barcoding workflow for further analysis (this step is optional).

If using amplicons, 100 ng of first-round PCR product (with tailed primers) is required per sample.

Cómo realizar un control de calidad del ADN de la muestra inicial

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo	Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle	50
MinION/GridION	800
PromethION	5000

Name	Acronym	Cap colour	No. of vials/plates	Fill volume per well (µl)
PCR Barcode Primer Mix plate	BC01-96	White	1 plate	24
Barcode Adapter plate	BCA	Blue	1 plate	240

The wells of the 96 tube plate correspond to the barcodes in the following way. All barcodes are supplied at 10 µM concentration and to be used at a final concentration of 0.2 µM.

Note: We are in the process of reformatting the barcodes provided in this kit into a plate format. This will reduce plastic waste and will facilitate automated applications.

Plate format

Name	Acronym	Cap colour	No. of vials	Fill volume per vial (µl)
DNA Control Sample	DCS	Yellow	2	35
Native Adapter	NA	Green	1	40
Sequencing Buffer	SB	Red	1	700
Library Beads	LIB	Pink	1	600
Library Solution	LIS	White cap, pink label	1	600
Elution Buffer	EB	Black	2	500
AMPure XP Beads	AXP	Clear cap, light teal label	1	6,000
Long Fragment Buffer	LFB	Orange	1	1,800
Short Fragment Buffer	SFB	Clear	1	1,800
EDTA	EDTA	Blue	1	700
Flow Cell Flush	FCF	Clear cap, light blue label	1	8,000
Flow Cell Tether	FCT	Purple	1	200
Native Barcode plate	NB01-24	-	2 plates, 3 sets of barcodes per plate	5 µl per well

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.

Vial format

Name	Acronym	Cap colour	No. of vials	Fill volume per vial (µl)
Native Barcodes	NB01-24	Clear	24 (one per barcode)	20
DNA Control Sample	DCS	Yellow	2	35
Native Adapter	NA	Green	1	40
Sequencing Buffer	SB	Red	1	700
Library Beads	LIB	Pink	1	600
Library Solution	LIS	White cap, pink label	1	600
Elution Buffer	EB	Black	2	500
AMPure XP Beads	AXP	Clear cap, light teal label	1	6,000
Long Fragment Buffer	LFB	Orange	1	1,800
Short Fragment Buffer	SFB	Clear	1	1,800
EDTA	EDTA	Blue	1	700
Flow Cell Flush	FCF	Clear cap, light blue label	1	8,000
Flow Cell Tether	FCT	Purple	1	200

Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.

These expansions provide extra library preparation and flow cell priming reagents to allow users to utilise any unused barcodes for those running in smaller subsets.

Both expansion packs used together will provide enough reagents for 12 reactions. For customers requiring extra EDTA to maximise the use of barcodes, we recommend using 0.25 M EDTA and adding 4 µl for library preps using the SQK-NBD114.24 kit.

Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) contents:

Note: This Product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) contents:

En la mayoría de experimentos de secuenciación, recomendamos usar Library Beads (LIB) para cargar la biblioteca en la celda de flujo. Nótese, si previamente se ha usado agua para cargar la biblioteca, se deberá usar Library Solution (LIS) en su lugar. Nota: Algunos clientes han notado que las bibliotecas viscosas pueden cargarse con mayor facilidad cuando no se usan Library Beads (LIB).

Para obtener una descripción completa del análisis de datos de nanoporos, que incluya distintas posibilidades para el análisis de identificación y postidentificicación de bases, consultar el documento Data Analysis.

The sequencing device control, data acquisition and real-time basecalling are carried out by the MinKNOW software. Please ensure MinKNOW is installed on your computer or device. Instructions for this can be found in the MinKNOW protocol.

We recommend setting up real-time basecalling as follows:

Real-time basecalling

Follow the instructions in the MinKNOW protocol beginning from the "Starting a sequencing run" section for your device until the end of the "Completing a MinKNOW run" section.

Select Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK114) in "Kit selection". The barcoding option will be unavailable as default. Other parameters can be kept at their default settings.

We currently recommend performing demultiplexing for the dual barcoding protocol post-sequencing using the Guppy software.

For a complete guide please refer to our Guppy protocol

Barcode demultiplexing in Guppy for dual barcoding:

To demultiplex your reads by barcode, use the dual barcoding configuration file, specifying the barcode kit as "EXP-DUAL00":

guppy_barcoder --input_path <folder containing FASTQ and/or FASTA files> --save_path <output folder> --config configuration_dual.cfg --barcode_kits "EXP-DUAL00"

For more information and instructions on how to use Guppy, please refer to the relevant sections of the protocol:

Barcode demultiplexing Quick Start

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de identificación de bases:

1. Procesos de trabajo en EPI2ME

Para realizar un análisis de datos exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y procesos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, situados en la sección EPI2ME Labs de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los procesos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis

El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si en ninguno de los recursos anteriores se proporciona un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.