PromethION 2 Integrated 用户手册
PromethION: Protocol
PromethION 2 Integrated 用户手册 V P2I_9202_v1_revC_08Dec2023
本中文版本对应的英文原文实验指南版本为：P2I_9202_v1_revC_08Dec2023。
本手册将指导您安装、检测及配置您的 PromethION 2 Integrated。
仅供研究使用
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
概览
安装
测序前检查及运行测序
测序实验结束后
更新软件
故障排查
概览
本中文版本对应的英文原文实验指南版本为：P2I_9202_v1_revC_08Dec2023。
本手册将指导您安装、检测及配置您的 PromethION 2 Integrated。
仅供研究使用
1. 测序设备信息
The PromethION 2 Integrated
作为一款高性能的小型台式独立测序设备，PromethION 2 Integrated (P2i)可分别或同时运行两张测序芯片，且支持在本机上直接进行数据采集和碱基识别。
P2i自带触屏，便于用户操作 MinKNOW 测序软件。您可通过触屏启动、停止、监控测序过程及使用MinKNOW中的分析功能。设备后部提供外接显示器接口，连接后用户即可通过外部显示器访问Ubuntu操作系统和EPI2ME分析软件。
技术规格
| 组成 | 规格 |
|---|---|
| 尺寸和重量 | 180 mm x 225 mm x 430 mm，10.6 kg |
| 供电电压 | 100-240 交流电 (50/60 Hz) |
| 峰值功耗 | 750 W |
| 存储 | 15 TB 固态硬盘 |
| 内存 | 64 GB DDR4 |
| CPU/GPU | 1x Intel Core i7（12核/20线程） 1x NVIDIA Ampere-系列 GPU |
| 操作系统 | Ubuntu 20.04 LTS |
| 预装软件 | MinKNOW |
| 环境条件 | 请在+18℃至+25℃的环境温度范围内使用本测序设备* |
*电子设备的工作环境温度为+5℃至+40℃。
2. 包装盒内容物
PromethION 2 Integrated 包装
PromethION 2 Integrated 包装盒内容物
- 1x PromethION 2 Integrated
- 5x C13 电源线（1x 适用于美国、1x 适用于英国、1x 适用于欧盟、1x 适用于中国、1x 适用于澳大利亚）
- 2x 配置测试芯片（CTC）
状态指示灯
P2 Integrated 设备的显示屏上通过两枚彩色圆点（A和B）来指示测序芯片的状态：每个圆点对应一个测序芯片卡槽。指示灯的显示模式如下：
- 白色实心圆点：设备就绪，未插入测序芯片。
- 蓝色实心圆点：已插入测序芯片。
- 绿色闪烁圆点：正在执行脚本/采集数据（包括硬件检测和测序芯片质检）。
- 红色实心圆点：运行因错误而终止。如果您持续遇到此问题，请联系我们的技术支持人员。
- 蓝色实心圆点：脚本运行完成。
3. 安装并启动测序设备
推荐的实验室摆放位置
- 请将仪器至于一张稳固、清洁的实验台上。
- 请确保仪器四周留有至少30厘米的空间，以保持测序过程中温度的稳定，从而获得高质量数据。
- 请勿覆盖任何通风口。
- 测序应在+18℃至+22℃的室温下进行。
- 请确保将设备放置在靠近宽带网络接口（RJ45）和电源插座的地方。
- 请确保电源插头处在方便插拔的位置，以便在紧急情况下将测序仪断开。
安装前的准备
在安装测序仪之前，请配置好：
- 1x宽带网线（标准不低于Cat5e，支持最高2.5 Gbps网速）
- 网络接入标准：
- 可通过DHCP服务器获取IP地址
- 可对互联网上的443端口进行出站访问
- 防火墙权限需满足以下两个要求：
（1）可访问 此处列出的AWS eu-west-1 IP地址范围 （2）可访问178.79.175.200 及 96.126.99.215
请注意：如果您希望通过外接屏幕访问Ubuntu桌面或EPI2ME，请确保在启动P2i之前，先打开显示器并连接键盘和鼠标。若仅使用内置触屏，请不要连接键盘和鼠标，否则将导致设备启动错误。
- 1x 显示器（兼容 HDMI/DisplayPort）
- 1x 适配的显示器电线
- 1x 通过USB连接的键盘
- 1x 通过USB连接的鼠标
不间断电源（UPS）可在停电时提供临时电力支持，但并非必需。P2i设备尚未验证与任何型号UPS的兼容性。
打开PromethION 2 Integrated 测序设备包装，将仪器置于操作台上。
确保测序设备中未插入测序芯片或配置测试芯片（CTC）。
请按照以下步骤将电缆和外设连接到图示端口。
首次安装时，我们建议您使用兼容 HDMI/DisplayPort的外接显示器、键盘和鼠标。为确保外设正确识别，请在启动测序设备之前先连接外设。在后续使用中，设备将不再需要外接显示器、键盘和鼠标，您可按需将其断开。
将外接显示器连接到 HDMI 端口或 DisplayPort（DP）。设备仅支持一台外接显示器。
将鼠标和键盘插入设备上最靠内侧的 USB Type A 端口。
将宽带网线缆插入宽带网端口。
将P2i AC电源适配器插入墙壁插座，并将电源线与P2i连接。
按下电源开关以启动设备。
屏幕上将显示MinKNOW软件。
我们建议您使用纳米孔社区的账户信息登录MinKNOW软件。
您须连接到互联网方可登录。
用户可在此页面的右下角选择界面语言。
界面将提示您输入电邮地址和纳米孔密码：
如您在登录时遇到问题，请通过我们的纳米孔微信公众号（NanoporeSupport）或社区支持通道(https://community.nanoporetech.com/support) 联系我们的客服。与此同时，您可点击 Continue as guest ，以访客身份暂时使用MinKNOW。
在“Connection Manager”（连接管理器）下选择连接至计算机上的测序仪。
进入“Sequencing Overview”（测序概览）页面。
更新MinKNOW软件
所有Oxford Nanopore测序仪均使用MinKNOW™作为主要测序软件。MinKNOW软件负责执行多项核心任务，包括：数据采集、实时分析及反馈、碱基识别、数据流传输、仪器控制、以及为待测样本提供适配的测序脚本。MinKNOW捕获单链DNA通过纳米孔时引起的独特电流变化（即原始数据），并将其转换为序列。序列经MinKNOW进行碱基识别，所得数据写入 .POD5、.FAST5或.FASTQ文件。
首次设置 P2i 设备时，请根据 通过用户界面更新软件中的说明将 MinKNOW 更新到最新版本。
4. 网络设置和连接
网络要求
P2i设备通过后方的宽带网端口与本地网络连接，支持最高2.5 Gbps的传输速度。请注意，P2i不支持无线网络。
宽带连接将用于：
- 向 Oxford Nanopore Technologies 发送遥测* 信息。
- 接收设备的软件和固件更新。
- 将生物测序数据传输至您本地的存储基础设施。
用户须自备网线进行配置。
* 遥测包含有关测序运行条件和设置的元数据，只记录一般信息（如序列长度和Q值），不包括具体基因组信息。
配置您的网络
您可通过MinKNOW用户界面设置P2i与单层网络的连接。
请注意：请使用外接显示器通过终端配置网络。请确保在启动P2i前先连接并打开显示器。如果在设备启动后连接显示器，显示器将无法识别。
如需将P2i配置为连接多层网络，请打开终端窗口并输入以下命令：
/opt/ont/mooneye/bin/ont-mooneye-configure-lan
如需查看帮助选项，请运行以下命令：
sudo /opt/ont/mooneye/bin/ont-mooneye-configure-lan -h
验证 IP 地址
如需验证静态或动态（DHCP）IP地址的配置是否正确，请使用命令：
sudo /opt/ont/mooneye/bin/ont-mooneye-configure-lan -v -s
5. 更改默认密码和主机名
导航至“Host Settings”（测序设备设置）下的“Device Settings”（仪器设置）板块。
点击 System（系统）版面的 Reset password（重置密码）。
在“Change Password”（更改密码）对话框中，输入您当前使用的密码，然后输入新密码。
点击“Reset Password”（重置密码），确认密码变更。
（进阶）变更默认的主机名
请注意：请使用外接显示器通过终端更新主机名。请确保在启动P2i前先连接并打开显示器。如果在设备启动后连接显示器，显示器将无法识别。
如您需要更新设备的主机名，请运行以下命令并将
sudo -S hostnamectl set-hostname <new_hostname>
使用以下命令关闭设备，然后按下设备上的电源按钮重新启动设备：
sudo shutdown -h now
6. （进阶）更新时区并设置本地NTP服务器
更新时区：
（进阶）如您无法通过界面更新时间及日期，请连接外接显示器和键盘，并输入以下命令：
/opt/ont/mooneye/bin/ont-mooneye-time-source
设置本地网络时间协议（NTP）服务器：
如果您希望将NTP服务器设为特定地址，如“ntp.ubuntu.com”，请键入以下命令：
sudo /opt/ont/mooneye/bin/ont-mooneye-time-source -a -v --ntp-server=ntp.ubuntu.com
确认时间服务器是否设置成功：
sudo /opt/ont/mooneye/bin/ont-mooneye-time-source -v -s
如需查看同步详情，请输入：
sudo timedatectl timesync-status
7. 硬件检测
重要
硬件检测
如您使用的是新设备或刚刚更新过软件，请务必进行硬件检测。
将两张配置测试芯片（CTC）分别插入两个测序芯片槽中。
正确插入并成功识别后，P2i显示屏上的两枚状态指示圆点将变为蓝色。
插入配置测试芯片后，盖上设备上盖。
重要
正确插入PromethION测序芯片
将测序芯片平放在金属板上。
将测序芯片推入对接端口，直至金色引脚或绿色电路板不可见，且您听到咔哒声。
打开主页（Start），选择“Hardware Check”（硬件检测）。
选择一个或多个PromethION芯片位置,然后点击“Start”（开始）启动检测。
随即进入“Sequencing Overview”（测序概览）页面。
配置测试芯片下方将有进度栏显示检测进度。
步骤结束
硬件检测约1分钟。
如果检测 通过 ，将出现 绿色勾号图标 并弹出提示“Hardware check passed”（通过硬件检测）。
如检测 未通过 ，将出现 橙色勾号图标.
如硬件未通过检测，请拔出并重新插入CTC，再次运行硬件检测。如果仍未通过检测，请通过电子邮件（Support@nanoporetech.com）或纳米孔社区的在线支持联系我们的技术服务团队。
重要
当不使用测序设备时，请从测序芯片槽取出配置测试芯片。
当测序设备处于关闭状态时，请勿将配置测试芯片滞留在PromethION测序芯片槽中。请仅在测序设备处于开启状态且需要进行 硬件检测 时插入配置测试芯片。
测序配置芯片应在室温干燥条件下储存。
8. 测序芯片质检
耗材
- PromethION 测序芯片
仪器
- PromethION 2 Integrated
测序芯片质检
在DNA/RNA文库上样前，请务必对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到测序芯片12周之内进行。Oxford Nanopore Technologies会对活性孔数量少于以下标准的芯片进行替换** ：
| 测序芯片 | 芯片上的活性孔数确保不少于 |
|---|---|
| Flongle 测序芯片 (FLO-FLG001) | 50 |
| MinION/GridION 测序芯片 | 800 |
| PromethION 测序芯片 | 5000 |
** 请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于Oxford Nanopore Technologies推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两天内递交给我们。
重要
将芯片从冰箱中取出后，请将其置于室温环境孵育20分钟再插入PromethION测序仪。潮湿环境下的测序芯片上可能会形成冷凝水。因此，请检查测序芯片顶部和底部的金色连接器引脚处是否有水凝结。如有，请使用无纤维布擦干。请确保测序芯片底部有热垫（黑色）覆盖。
将待运行的测序芯片插入PromethION上相应卡槽的对接端口。
重要
正确插入PromethION测序芯片
将两张 PromethION 测序芯片滑入设备的测序芯片槽，并小心确保芯片底部的深灰色加热垫不被撕裂或变形。用力下压芯片，直到听到咔哒声。
导航至“Start”（开始）页面，点击“Flow Cell Check”，打开测序芯片质检页面。
待质检测序芯片的类型和ID被识别后，点击“Start”（开始）启动芯片质检。
随即进入“Sequencing Overview”（测序概览）页面。
测序芯片健康状况指示框
测序概览（Sequencing Overview）页面会显示测序芯片的质量。质量分为三个等级：
黄色!（图中Flongle测序芯片）: 活性测序孔数量低于质保范围。将芯片从测序设备中取出后重新插入，并运行测序芯片质检。如果测序芯片活性孔数仍然低于质保范围，请您发邮件至support@nanoporetech.com。
绿色√（图中MinION 测序芯片）： 活性测序孔数量在质保范围之上。
?（图中PromethION 测序芯片）： 测序芯片在本次MinKNOW使用期间还未经过质检。
请注意： 芯片质量指示框仅在当次MinKNOW使用期间可见。一旦该次使用结束，测序芯片的状态将被清除。
9. 测序并监测实验
请参阅纳米孔社区中的MinKNOW实验指南，查看如何设置测序实验及监测实验进度。
10. 数据管理
文件管理器（File Manager）
用户可通过测序设备设置（Host Settings）下的文件管理器页面管理和传输数据。
浏览选项卡，查看储存的数据：
- Internal （内置存储）标签页：数据存储于MinKNOW所连接的测序仪中（MinIONMk1C、GridION、PromethION）
- Removable （可移动存储）标签页：数据存储于MinKNOW所连接的可移动存储设备中，如USB移动硬盘
- Network （网络存储）标签页：数据存储于MinKNOW所连接的预挂载的网络驱动器上。
如需在内置存储、可移动存储和网络存储选项间移动数据：
将页面底部的“Select”（选择）选项切换至“On”（开启），即可使用右下角的“Copy”（复制）、“Move”（移动）、“Delete”（删除）和“Rename”（重命名）选项。
选择一个文件或文件夹，然后使用右下角的选项。
提示
请先选定待移动或删除的文件，再点击 “Move”（移动）或“Delete”（删除）。
点击“Copy”（复制）或“Move”（移动），以打开新的对话框，其中列出了设备可访问的全部硬盘。
请注意：插入的USB硬盘或SD卡会显示在“Device”（设备）文件夹下。
点击要打开的硬盘，浏览文件目录以选择目标路径。然后点击“Copy”（复制）或“Move”（移动）以确认操作。
查看可用的存储空间：
测序生成的数据存储在P2i系统约14TB的"/data"分区内。
如需查看可用存储空间，请点击“测序设备设置”（Host Settings），然后选择“设备设置”（Device Settings）。下图示例中，“磁盘管理”（Disk Management）面板显示P2i系统的剩余可用存储空间为3.1TB。
将设备作为共享/网络硬盘远程访问：
导航至“Device settings”（仪器设置），将“Share”（共享）切换至开。
请在弹出的新窗口填写您为此创建的安全密码。
点击“Set Password”（设置密码）。几秒钟后，共享切换按钮即被激活。
用户即可在不同的网络上访问并共享数据。
请注意 上图是在GridION上共享数据的示例。如在MinION或PromethION测序仪上共享数据，则按钮上的文本会相应替换为“Min”或“Prom”。
提示
如需取消共享，请将共享按钮切换至关。
请注意： 如再次打开共享，用户之前所设密码会被删除，须要重置。
点击界面上的“New Directory”（新的目录）图标即可创建新目录。
如下图所示，点击标签页右下方红框内的图标，打开“Create New Directory”（新建目录）对话框并键入目录名称。然后点击 Create （创建）。
数据传输及长期存储
如果P2i在测序过程中存储空间不足，实验将提前终止。因此，在开始实验之前，请确保为每个测序芯片预留至少2TB的存储空间。
我们建议您使用远程服务器或网络附加存储（NAS）进行数据传输和长期存储，此类设备通常支持NFS、SMB和CIFS等多种文件系统。因Linux用户（组）权限缘故，我们建议您挂载NFS。对Windows工作站，请使用SMB协议；对Mac OS，您可选用SMB或NFS协议。实时传输的数据应存储于固态硬盘（SSD），而非机械硬盘（HDD）中；因前者与后者相比写入速度更快。当数据写入SSD驱动器后，用户可再将其转移至写入速度较慢的硬盘，以便长期储存。
数据的存储和传输形式（及数量）取决于您的需求，以及您是否有计划在未来出现更高级的碱基识别算法时，对测序数据再次进行碱基识别：
如将原始序列数据以.pod5或.fast5格式储存，用户可在Oxford Nanopore有算法更新时重新对该数据进行碱基识别。更新的算法会进一步提升现有数据碱基识别的准确性。同时，一些由Oxford Nanopore和第三方开发的工具可以从.fast5文件所包含的原始信号信息中提取出更多信息，例如修饰碱基识别、有参SNP（单核苷酸多态性）识别或数据优化。
如仅保留FASTQ文件，用户将无法使用其中的信息再次进行碱基识别，但可将文件中的DNA/RNA序列用于下游分析。
由于数据存储方式多样，Oxford Nanopore无法提供具体的存储建议。
挂载网络硬盘：
点击“Host settings”（测序设备设置），然后点击“Device Settings”（仪器设置）。
在磁盘管理（Disk Management）板块下，点击“Add network drive ”添加网络硬盘。
选择SMB或NFS，输入网络配置信息，然后点击“Mount SMB/Mount NFS”（挂载SMB或挂载NFS）。
如需卸载网络硬盘，点击“Unmount”（卸载）。
11. 关闭设备
重要
我们不建议您通过终端关闭设备。
使用以下命令可能会导致设备重启后出现连接问题。
sudo shutdown -r
通过MinKNOW用户界面停止运行测序并等待测序终止。
请确保设备未在执行任何操作，并从设备中取出所有测序芯片或配置测试芯片（如有）。
如您使用外接显示器：请点击右上角的电源图标，然后在弹出窗口中选择“Shut down”（关闭）。
如使用内置触屏：请在左侧导航面板中点击“Host Settings”（测序设备设置），然后选择“Device Settings”（仪器设置）。在“System”（系统）框内，点击“Shut down”（关闭）。
等待约20秒，直到设备关闭，前后风扇停止转动。
如果无法正常关机，请按住设备后方的开关约八秒，以强制关闭设备。
12. 通过终端更新软件
重要
您需要使用外接显示器通过终端更新软件。请确保在启动P2i前先连接并打开显示器。如果在设备启动后连接显示器，显示器将无法识别。
搜索“terminal”（终端）并按回车键以打开终端窗口。
在终端中输入或粘贴以下命令，然后按回车键：
sudo apt clean
sudo apt update
sudo apt install ont-p2-release
在Ubuntu桌面的用户界面中关闭设备。当设备关闭且风扇停止转动（大约20秒后），请使用设备后方的开关重新启动设备。
13. 故障排查
“Troubleshooting”（故障排查）选项位于”Host settings”（测序设备设置）下的“Help”（帮助）页面：
请点击 此处，查阅我们的常见问题解答。
导出日志：
- 在“Export Logs”（导出日志）栏目下点击 Export（导出）。
日志成功导出后，“Export”按钮下方将显示导出路径。日志将以TGZ压缩文件格式下载至“logs”（日志）目录中。
您可通过“File Manager”（文件管理器）更改日志文件路径，无需 SSH 连接即可访问日志：
- 在“Export Logs”（导出日志）栏目下，点击 Logs exported to: （日志导出至：）右侧的文件名，即可在MinKNOW的文件管理器中打开日志所在路径。
- 使用文件管理器右下角的控制面板移动日志文件。
清除日志和临时数据：
在“帮助”（Help）页面的“清除文件”（Clean up files）部分选择清除（Clean up），并在弹出的对话框内确认。
请注意： 将清除日志及临时数据，实验数据不会被删除。
修复仪器故障：
在“帮助”（Help）页面的“Troubleshooting”（故障排查）部分点击 Run repair（修复问题），并在弹出的对话框内确认。MinKNOW将尝试修复以下问题：
- 确保“/data”下所需路径存在，且具有正确的所有权和权限。
- 确保“/data”下所需文件的所有权和权限正确。
- 确保GPU正以最高性能运行
- 确保已禁用蓝牙
