El PromethION 2 Integrated (P2i) es un dispositivo de sobremesa pequeño, diseñado para secuenciar hasta 2 celdas de flujo PromethION. Cada celda de flujo funciona de manera independiente, por lo que los experimentos se pueden realizar simultánea o individualmente. El P2i es un producto independiente, con un sistema informático integrado de alta gama, que realiza la adquisición de datos e identificación de bases en el dispositivo.

Tiene una pantalla integrada que interactúa con el programa de secuenciación MinKNOW, lo que permite empezar, detener y supervisar experimentos de secuenciación así como acceder a otras funciones de análisis. El dispositivo también dispone de un puerto en la parte trasera para conectar un monitor externo, lo que permite acceder al sistema operativo o escritorio Ubuntu y al programa de análisis EPI2ME.

*Intervalo de funcionamento de aparatos electrónicos entre 5 °C y 40 °C

• 1 PromethION 2 Integrated
• 5 cables de alimentación C13 para uso internacional (EE. UU., UK, UE, CAN y AUS)
• 2 Celdas de prueba de configuración (CTC)

Indicadores de funcionamiento Hay dos luces en la pantalla integrada que indican el estado de las celdas de flujo: A y B, una para cada posición, que siguen el siguiente esquema:

• Luces de color blanco: el dispositivo está listo, no hay celdas de flujo insertadas.
• Luces de color azul: hay celdas de flujo insertadas.
• Luces de color verde: script en funcionamiento/adquisición de datos en curso (incluye la comprobación de la celda de flujo y del equipo).
• Luces de color rojo: se ha producido un error en la ejecución. Contacte con el servicio de asistencia técnica si observa este patrón.
• Luces de color azul: el script ha finalizado correctamente.

• Colocar el dispositivo en una superficie firme y limpia.
• Dejar al menos 30 cm de espacio libre alrededor del mismo, para garantizar que la temperatura se mantenga estable durante la secuenciación y proporcione datos de la mejor calidad.
• No cubrir ninguna rejilla de ventilación.
• Realizar la secuenciación a una temperatura ambiente de entre 18 °C y 22 °C.
• Procurar que los cables Ethernet (RJ45) y enchufes estén cerca.
• Intentar que se pueda acceder a los enchufes con facilidad, por si hay una emergencia y es necesario desconectar el aparato con urgencia.

Antes de instalar el dispositivo, se debe disponer de lo siguiente:

• 1 cable Ethernet (CAT 5e o superior con velocidad máxima de 2,5 Gb/s)
• Acceso a la red que proporciona:
  • Una dirección IP a través del protocolo DHCP
  • Acceso a internet solo de salida a través del puerto 443
  • Permisos de cortafuegos para acceder a los rangos de IP de AWS eu-west-1 enumerados aquí, además de: 178.79.175.200 y 96.126.99.215

Nota: Si utiliza un monitor externo para acceder al escritorio de Ubuntu o EPI2ME, conecte el monitor, el teclado y el ratón y encienda el monitor antes de encender el P2i. Si utiliza solo la pantalla integrada, no conecte el teclado ni el ratón, ya que provocaría un reinicio anómalo.

• 1 monitor (compatible con HDMI o DisplayPort)
• 1 cable compatible con el monitor
• 1 teclado con conexión USB
• 1 ratón con conexión USB

Opcional: Sistema de alimentación ininterrumpida (SAI) que proporcione energía si se producen cortes de suministro. No se ha comprobado la compatibilidad de ningún modelo SAI con el P2i.

Si se instala por primera vez, recomendamos utilizar un monitor externo (compatible con HDMI o DisplayPort), un teclado y un ratón. Para que el sistema los reconozca correctamente, conecte los periféricos antes de encender el dispositivo. El uso continuado del dispositivo no requiere de monitor, teclado o ratón y se pueden desconectar si no se necesitan.

Todos los dispositivos de Oxford Nanopore utilizan MinKNOW™ como programa principal. El programa MinKNOW lleva a cabo varias tareas centrales: adquisición de datos, análisis y retroalimentación en tiempo real, identificación de bases y transmisión de datos, entre otros. Además, gestiona el dispositivo y garantiza que la química de la plataforma funcione correctamente. MinKNOW toma los datos crudos y los convierte en lecturas mediante el reconocimiento del cambio que ocurre en la corriente cuando una cadena de ADN entra y sale del poro. Entonces, MinKNOW identifica las lecturas y escribe los datos en archivos POD5, FAST5 o FASTQ.

Cuando configure el P2i por primera vez, actualice MinKNOW con las instrucciones que encontrará en la sección Actualizar el programa a través de la interfaz de usuario.

El P2i admite una velocidad de transferencia máxima de 2,5 Gb/s mediante el puerto Ethernet trasero. Esta conexión se utiliza para conectar el dispositivo a la infraestructura local. El dispositivo no es compatible con Wi-Fi.

La conexión Ethernet se utilizará para:

• Enviar información de telemetría* a Oxford Nanopore Technologies.
• Recibir actualizaciones del programa y de firmware en el dispositivo.
• Transmitir datos de secuencia biológica a su infraestructura de almacenamiento local.

El usuario deberá proporcionar el cableado necesario para conectar el P2i a la infraestructura local.

*La telemetría contiene metadatos sobre la configuración y las condiciones de los experimentos de secuenciación. No se incluye nada específico sobre el contenido genómico de lecturas individuales; solo se registra información genérica, como la longitud de la secuencia y el índice Q score.

Si desea conectar el P2i a una única red, utilice la interfaz de usuario de MinKNOW.

Nota: necesitará un monitor externo para configurar la red mediante el Terminal. Conectar y encender el monitor antes de encender el P2i. Si se conecta el monitor mientras el P2i se está encendiendo, el dispositivo no reconocerá el monitor.

Para configurar el P2i de manera que se conecte a varias redes, abra una ventana del Terminal e introduzca:

/opt/ont/mooneye/bin/ont-mooneye-configure-lan

Si desea ver las opciones de ayuda, ejecute:

sudo /opt/ont/mooneye/bin/ont-mooneye-configure-lan -h

Es posible utilizar el comando:

sudo /opt/ont/mooneye/bin/ont-mooneye-configure-lan -v -s

para comprobar que la dirección IP utilizada —dirección estática o DHCP— se haya configurado correctamente.

Nota: necesitará un monitor externo para configurar la red mediante el Terminal. Conectar y encender el monitor antes de encender el P2i. Si conecta el monitor antes que el P2i, el dispositivo no reconocerá el monitor.

Para actualizar el nombre del servidor en el dispositivo, ejecute el siguiente comando y reemplace la parte <new_hostname> por el nombre de servidor deseado (omitiendo los corchetes angulares <>):

sudo -S hostnamectl set-hostname <new_hostname>

Apagar el dispositivo con el siguiente comando y a continuación, pulsar el botón de encendido:

sudo shutdown -h now

Configurar el servidor NTP en, por ejemplo, "ntp.ubuntu.com", introduciendo el siguiente comando:

sudo /opt/ont/mooneye/bin/ont-mooneye-time-source -a -v --ntp-server=ntp.ubuntu.com

Comprobar que el servidor horario esté configurado:

sudo /opt/ont/mooneye/bin/ont-mooneye-time-source -v -s

Para más información sobre la sincronización, introducir:

sudo timedatectl timesync-status

Durante la comprobación, se mostrará una barra de estado debajo de la celda de prueba de configuración.

Recomendamos examinar la celda de flujo y verificar el número de poros disponible, antes de cargar una biblioteca de ADN o ARN en ella.

Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros activos inferior al indicado por la garantía —en un plazo de 12 semanas desde la compra— siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la verificación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento.

La calidad de la celda de flujo se mostrará con uno de estos tres valores:

1. Signo de exclamación amarillo (celda de flujo Flongle - izquierda): El número de poros disponibles está por debajo del nivel cubierto por la garantía. Saque la celda de flujo del dispositivo, vuelva a insertarla e inicie el recuento de nuevo. Si el número sigue siendo inferior al número cubierto por la garantía, póngase en contacto con support@nanoporetech.com.

2. Marca de verificación verde (celdas de flujo MinION - centro): El número de poros disponibles está por encima de la cantidad cubierta por la garantía.

3. Signo de interrogación (celdas de flujo PromethION - derecha): Durante esta sesión en MinKNOW, la celda de flujo no se ha verificado.

Nota: El indicador de estado permanecerá visible solo durante la sesión en MinKNOW. Una vez cerrada, el estado de la celda de flujo desaparecerá.

Antes de realizar un experimento de secuenciación, es necesario purificar la muestra de ADN o ARN y preparar una biblioteca de secuenciación. Encontrará más información sobre la preparación de muestras, en la sección Prepare —en la pestaña Documentación— de la comunidad Nanopore.

Siga este enlace para acceder al protocolo de MinKNOW.

Los datos se administran y transfieren desde la pestaña Gestor de archivos de la Configuración del servidor.

Los datos almacenados se encuentran en las pestañas situadas en la parte superior:

• Interno: datos almacenados en el dispositivo de secuenciación conectado (MinION Mk1C, GridION, PromethION).
• Extraíble: datos almacenados en un dispositivo de almacenamiento extraíble conectado, por ejemplo, una unidad USB.
• Red: datos almacenados en una unidad de red conectada. La unidad de red debe montarse antes.

Hacer clic en el icono —Crear un nuevo directorio— situado en la esquina inferior derecha y asignarle un nombre. A continuación, pulsar Crear.

Si el P2i se queda sin memoria durante un experimento de secuenciación, el experimento se detendrá antes de tiempo. Por ello, antes de empezar un experimento, asegúrese de que tiene al menos 2 TB de memoria por celda de flujo.

Para transferir y almacenar datos a largo plazo, recomendamos usar un servidor remoto o almacenamiento conectado a la red (NAS). Suelen ofrecer la posibilidad de elegir entre recursos compartidos NFS, SMB o CIFS. Recomendamos utilizar montajes NFS, debido a los permisos de usuario y grupo de Linux compatibles. En ordenadores Windows, utilizar SMB. En ordenadores Mac OS, utilizar SMB o NFS. Para transmitir datos de almacenamiento en tiempo real, es necesario utilizar SSD ya que tiene una elevada velocidad de escritura, comparado con HDD. Tras la escritura inicial en unidades SSD conectadas, es posible trasladar los datos con una velocidad de escritura más lenta para almacenarlos a largo plazo.

La forma y el volumen de los datos que se almacenen dependerá de sus necesidades y de si desea volver a identificar bases de los datos en el futuro, cuando haya algoritmos más avanzados:

Almacenar archivos .pod5 con datos de lecturas brutas permitirá volver a identificar las bases de esos datos cuando Oxford Nanopore Technologies lance nuevos algoritmos. En algunos casos, nuevas versiones de identificadores de bases han permitido mejorar significativamente la precisión en conjuntos de datos existentes gracias a la reidentificación de bases. Además, tanto las herramientas de terceros como las de Oxford Nanopore usan la información de la señal sin procesar, contenida en el archivo .pod5, para extraer información adicional, por ejemplo la identificación de bases modificadas, la identificación de polimorfismos de un solo nucleótido guiados por la referencia o la limpieza de datos.

Conservar solo los archivos FASTQ permitirá utilizar las herramientas estándar de análisis posterior, utilizando la secuencia de ADN/ARN, pero no se podrán generar más datos cuando aparezcan nuevas versiones de identificador de bases.

Oxford Nanopore no facilita recomendaciones específicas para su almacenamiento, ya que ellas dependerán de cada lugar.

La sección de Preguntas frecuentes sobre dispositivos, se encuentra aquí.

• En la sección Exportar registros, pulsar en Exportar.

Una vez exportados los registros, debajo del botón aparecerá indicado dónde se encuentran. Los registros se descargarán como un archivo TGZ en el directorio de registros.

Es posible cambiar la ubicación de los registros utilizando el administrador de archivos, donde pueden recuperarse fácilmente sin necesidad de SSH:

• En el panel Exportar registros —situado en la pestaña "Ayuda" de la Configuración del servidor— bajo el botón Exportar dice "Registros exportados a:". Pulsar en la ubicación que sigue a ese enunciado. Esta acción abrirá la ubicación de los registros en el Gestor de archivos de MinKNOW.
• Utilice los botones que aparecerán en la esquina inferior derecha al seleccionar un archivo, para copiar, mover, borrar o cambiar el nombre del mismo.

En la pestaña "Ayuda", en la sección 'Eliminar archivos', pulsar Eliminar y confirmar en la ventana emergente.

Nota: los datos de ejecución no se eliminarán. Se eliminarán los registros y datos temporales.

En la página "Ayuda", sección "Resolución de problemas", pulsar en "Reparar problemas" y confirmar en la ventana emergente. MinKNOW intentará reparar los siguientes problemas:

• Comprobar que los directorios requeridos en "/data" existan y tengan la propiedad y los permisos necesarios.
• Comprobar que los archivos necesarios en "/data" tengan la propiedad y los permisos necesarios.
• Comprobar que la GPU funcione al máximo rendimiento.
• Comprobar que el Bluetooth esté desactivado.