This application allows the sequencing of full-length 3' cDNA transcripts, which provides a complete view of the expressed isoforms and allows detection of alternative splicing and fusion events in individual cells. Additionally, it enables the detection of SNPs anywhere in the transcript, as well as identification of cell sub-types in a population based on isoform expression levels.

This protocol describes how to carry out sequencing of cDNA from single cells using the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) and the PCR Expansion (EXP-PCA001). You will need to have reverse-transcribed single-cell mRNA into cDNA using the 10X Genomics Next GEM Single Cell 3' Kit (V3.1) to then biotin tag your cDNA before PCR amplification with custom-ordered oligos. Next, pull-down of the amplicons on streptavidin beads is performed before a second PCR using the PCR Primers (PRM). Finally, a standard Ligation Sequencing Kit V14 library preparation is completed to prepare the cDNA ends for sequencing on a PromethION device.

This is an optimised protocol adapted from Lebrigand, K., Magnone, V., Barbry, P. et al. High throughput error corrected Nanopore single cell transcriptome sequencing. Nat Commun 11, 4025 (2020) to sequence full-length transcripts, deplete cDNA synthesis artifacts and to correct for strand bias.

Note: This protocol is compatible and fully supported with the 10X Genomics Next GEM Single Cell 3' Kit (V3.1) and the Visium Spatial Gene Expression Kit (V1). Other versions of the kits are not supported.
For the 10X Genomics Next GEM Single Cell 5' Kit (V2), please visit our Ligation sequencing V14 - Single-cell transcriptomics with 5' cDNA prepared using 10X Genomics on PromethION (SQK-LSK114) protocol.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

• Have previously prepared single-cell barcoded cDNA using the 10X Genomics Next GEM Single Cell 3' Kit (V3.1). The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
• Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents.
• Download the MinKNOW software for acquiring and analysing your data.
• Perform a flow cell check to ensure it has enough pores for a good sequencing run.

Library preparation

Sequencing and analysis

You will need to:

• Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and basecall the reads.
• Analyse the data using the EPI2ME wf-single-cell pipeline.

Order the following HPLC-purified oligos at 100 μM, and dilute to 10 μM in TE buffer for use in the Pre-pull-down step of the library prep.

Extra AMPure XP Beads will be required for the first steps when preparing the cDNA amplicons. From the end-prep step, the AMPure XP Beads (AXP) from the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) can be used.

インプットDNAのQC方法

インプットDNAの量と品質の要件を満たすことが重要です。DNAの使用量が少なすぎたり多すぎたり、あるいは品質の低いDNA（例としてDNAが非常に断片化されていたり、RNAや化学汚染物質が含まれている場合など）を使用すると、ライブラリーの調製に影響を及ぼす可能性があります。

DNAサンプルの品質管理の方法については、Input DNA/RNA QC protocolのプロトコルをご覧ください。

コンタミネーション

DNAの抽出する方法によっては、精製DNAに特定の化学汚染物質が残留する可能性があり、ライブラリ調製の効率やシークエンシングの品質に影響を及ぼす可能性があります。コンタミネーションについての詳細は、コミュニティーの Contaminants page をご覧ください。

このプロトコールで使用されているすべてのサードパーティー試薬は、当社が検証し、使用を推奨しているものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以外の試薬を用いたテストは行っていません。

すべてのサードパーティ製試薬については、製造元の指示に従って使用の準備をすることをお勧めします。

シークエンシング実験を開始する前に、フローセルのポアの数を確認することを強くお勧めします。このフローセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの場合は代理店への到着から１２週間以内に行ってください。またはFlongle Flow Cellの場合は代理店への到着から4週間以内に行う必要があります。Oxford Nanopore Technologiesは、フローセルチェックの実施から2日以内に結果が報告され、推奨される保管方法に従っていた場合に、以下の表に記載されているナノポアの有効数に満たさない場合には、フローセルを交換します。 フローセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指示に従ってください。

Note: For this protocol, only PCR Primers (PRM) are required.

（注： 現在のキットの容器を変更しています。今までは実験毎に使い捨てのシングルユーズチューブを使用していましたが、バッファー単位のボトル容器に変更しています。

シングルユースチューブの場合:

ボトル容器の場合:

（注： 本製品には、Beckman Coulter、Inc.製のAMPure XP試薬が含まれており、試薬の安定性を損なうことなくキットと共に-20 ° Cで保存することができます。

（注： DNA Control Sample（DCS）は3.6kbのアンプリコンで、Lambda genomeの3'末端をマッピングしたプレップコントロールです。

Once you have loaded your flow cell, the sequencing run can be started on MinKNOW, our sequencing software that controls the device, data acquisition and real-time basecalling. For more detailed information on setting up and using MinKNOW, please see the MinKNOW protocol.

MinKNOW can be used and set up to sequence in multiple ways:

• On a computer either direcly or remotely connected to a sequencing device.
• Directly on a PromethION 24/48 sequencing device.

For more information on using MinKNOW on a sequencing device, please see the device user manuals:

• PromethION user manual
• PromethION 2 Solo user manual

After sequencing has completed on MinKNOW, the flow cell can be reused or returned, as outlined in the Flow cell reuse and returns section.

After sequencing and basecalling, the data can be analysed, as outlined in the Downstream analysis section.

The workflow, wf-single-cell, processes the FASTQ format sequence data prepared by the MinKNOW software. The workflow screens each sequence read for 10X cell barcode information and assigns reads to a cell of origin. A subset of sequences from “true” cells are dynamically filtered on the basis of the number of assigned sequence reads. These sequences are mapped to the reference genome, and tables of both gene and transcript abundance are prepared for each cell. These "cell barcode x gene" or transcript abundance information are used to prepare the familiar UMAP plots that may show the stratification of the cell types present within the sample.

For more information on this workflow, follow the link to the GitHub documentation.

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

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