Rapid sequencing gDNA - barcoding (SQK-RBK004)
MinION: Protocol
Rapid sequencing gDNA - barcoding (SQK-RBK004) V RBK_9054_v2_revAF_14Aug2019
The fastest and simplest protocol for genomic DNA involving:
- 10 mins library prep
- high yield
- fragmentation
For Research Use Only
This is a Legacy product This kit has now been discontinued and we recommend all customers upgrade to the latest chemistry for their relevant kit which is available on the Store.
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introduction to the protocol
Library preparation
Secuenciación y análisis de datos
- 5. Adquisición de datos e identificación de bases
- 6. Reutilización y devolución de celdas de flujo
- 7. Análisis posterior
Troubleshooting
Descripción general
The fastest and simplest protocol for genomic DNA involving:
- 10 mins library prep
- high yield
- fragmentation
For Research Use Only
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1. Overview of the protocol
IMPORTANTE
This is a Legacy product
This kit has now been discontinued and we recommend all customers upgrade to the latest chemistry for their relevant kit which is available on the Store. For further information on please see the product update page.
Rapid Barcoding Kit features
This kit is recommended for users who:
- Wish to multiplex samples to reduce price per sample
- Need a PCR-free method of multiplexing to preserve additional information such as base modifications
- Require a short preparation time
- Have limited access to laboratory equipment
Introduction to the Rapid Barcoding Sequencing Kit
This protocol describes how to carry out rapid barcoding of genomic DNA using the Rapid Barcoding Sequencing Kit (SQK-RBK004).
Steps in the sequencing workflow:
Prepare for your experiment
You will need to:
- Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
- Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
- Download the software for acquiring and analysing your data
- Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run
Library preparation
You will need to:
- Tagment your DNA using the Fragmentation Mix RB in the kit; this simultaneously attaches a pair of barcodes to the fragments
- Pool the barcoded samples
- Attach sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
- Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell
Sequencing and analysis
You will need to:
- Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
- Start the EPI2ME software and select a workflow for barcoding
IMPORTANTE
Compatibility of this protocol
This protocol should only be used in combination with:
- Rapid Barcoding Sequencing Kit (SQK-RBK004)
- R9.4.1 (FLO-MIN106) flow cells
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
- RAP Top-Up Kit (EXP-RAP001)
- Sequencing Auxiliary Kit (EXP-AUX001)
2. Equipment and consumables
Material
- ~400 ng high molecular weight genomic DNA per sample
- Rapid Barcoding Sequencing Kit (SQK-RBK004)
- Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002)
Consumibles
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Agencourt AMPure XP beads (optional) (Beckman Coulter™ cat # A63881)
- Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water (optional)
- 10 mM Tris-HCl pH 8.0 with 50 mM NaCl (optional)
Instrumental
- Cubeta con hielo
- Microcentrífuga
- Temporizador
- Termociclador o termobloque
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P2
Equipo opcional
- Standard gel electrophoresis equipment
- Bioanalizador Agilent (o equivalente)
- Qubit fluorometer (or equivalent for QC check)
- Centrifuga Eppendorf 5424 (o equivalente)
- Gradilla magnética
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
For this protocol, you will need ~400 ng high molecular weight genomic DNA
Cantidad de muestra inicial de ADN
Cómo realizar un control de calidad del ADN de la muestra inicial
Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.
Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC
Contaminantes químicos
Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.
Rapid Barcoding Kit (SQK-RBK004) contents
| Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (μl) |
|---|---|---|---|---|
| Fragmentation Mix | RB01-RB12 | Clear | 12, each vial with a unique barcode | 20 |
| Rapid Adapter | RAP | Green | 1 | 10 |
| Loading Beads | LB | Pink | 1 | 360 |
| Sequencing Buffer | SQB | Red | 1 | 300 |
Rapid Barcoding Kit sequences
| Component | Sequence |
|---|---|
| RB01 | AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG |
| RB02 | TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT |
| RB03 | GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG |
| RB04 | TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA |
| RB05 | CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT |
| RB06 | TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC |
| RB07 | GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT |
| RB08 | TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT |
| RB09 | AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT |
| RB10 | AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC |
| RB11 | GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA |
| RB12 | CAGGTAGAAAGAAGCAGAATCGGA |
IMPORTANTE
Please note that the Sequencing Tether (SQT) tube will NOT be used in this protocol.
Flow Cell Priming Kit contents (EXP-FLP002)
| Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (μl) |
|---|---|---|---|---|
| Flush Buffer | FB | Blue | 6 | 1,170 |
| Flush Tether | FLT | Purple | 1 | 200 |
The RAP Top-Up Kit (EXP-RAP001) is available to provide enough reagents for another six reactions depending on how the barcodes are used.
This kit contains reagents to be used with any remaining barcodes to load another six sequencing libraries.
| Reagent | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (µl) |
|---|---|---|---|---|
| Rapid Adapter | RAP | Green | 1 | 10 |
| Sequencing Tether | SQT | Purple | 1 | 10 |
| Loading Beads | LB | Pink | 1 | 360 |
| Sequencing Buffer | SQB | Red | 1 | 300 |
3. Library preparation
Material
- 400 ng high molecular weight plasmid DNA
- Fragmentation Mix RB01-12
- Rapid Adapter (RAP)
Consumibles
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Agencourt AMPure XP beads (optional) (Beckman Coulter™ cat # A63881)
- Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water (optional)
- 10 mM Tris-HCl pH 8.0 with 50 mM NaCl (optional)
Instrumental
- Termociclador o termobloque
- Microfuge
- Pipeta y puntas P10
Equipo opcional
- Gradilla magnética
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
Thaw kit components at room temperature, spin down briefly using a microfuge and mix by pipetting as indicated by the table below:
| Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Briefly spin down | 3. Mix well by pipetting |
|---|---|---|---|
| Fragmentation Mix RB01-12 | Not frozen | ✓ | ✓ |
| Rapid Adapter (RAP) | Not frozen | ✓ | ✓ |
| Sequencing Buffer (SQB) | ✓ | ✓ | ✓* |
| Loading Beads (LB) | ✓ | ✓ | Mix by pipetting or vortexing immediately before use |
| Flush Buffer (FLB) - 1 tube | ✓ | ✓ | ✓* |
| Flush Tether (FLT) | ✓ | ✓ | ✓ |
*Vortexing, followed by a brief spin in a microfuge, is recommended for Sequencing Buffer (SQB) and Flush Buffer (FLB).
Please note that the Sequencing Tether (SQT) tube will NOT be used in this protocol. It is provided in the kit for potential future product compatibility.
Prepare the DNA in nuclease-free water.
- Transfer ~400 ng genomic DNA into a DNA LoBind tube
- Adjust the volume to 7.5 μl with nuclease-free water
- Mix by flicking the tube to avoid unwanted shearing
- Spin down briefly in a microfuge
In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:
| Reagent | Volume |
|---|---|
| 400 ng template DNA | 7.5 μl |
| Fragmentation Mix RB01-12 (one for each sample) | 2.5 μl |
| Total | 10 μl |
Mix gently by flicking the tube, and spin down.
Incubate the tube at 30°C for 1 minute and then at 80°C for 1 minute. Briefly put the tube on ice to cool it down.
Pool the barcoded samples in a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
We expect to have about ~10 µl per sample.
IMPORTANTE
If barcoding four or more samples, increased throughput can be achieved through cleaning up and concentrating the pooled material using AMPure XP beads as outlined in Steps 6-17. Otherwise, for a more rapid sample preparation, transfer 10 μl of pooled sample from Step 6 into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, and proceed directly to Step 18.
Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.
To the entire pooled barcoded sample from Step 6, add an equal volume of resuspended AMPure XP beads, and mix by flicking the tube.
Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Prepare 500 μl of fresh 70% ethanol in nuclease-free water.
Spin down the sample and pellet on a magnet. Keep the tube on the magnet, and pipette off the supernatant.
Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 70% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.
Repetir el paso anterior.
Spin down and place the tube back on the magnet. Pipette off any residual 70% ethanol. Briefly allow to dry.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 10 µl of 10 mM Tris-HCl pH 8.0 with 50 mM NaCl. Incubate for 2 minutes at room temperature.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Remove and retain 10 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
- Dispose of the pelleted beads
End of optional steps.
Add 1 µl of RAP to 10 µl of barcoded DNA.
Mix gently by flicking the tube, and spin down.
Incubate the reaction for 5 minutes at room temperature.
FIN DEL PROCESO
The prepared library is used for loading into the flow cell. Store the library on ice until ready to load.
4. Priming and loading the SpotON Flow Cell
Material
- Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002)
- Sequencing Buffer (SQB)
- Loading Beads (LB)
Consumibles
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
Instrumental
- MinION device
- SpotON Flow Cell
- Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
CONSEJO
Cebado y carga de la celda de flujo
Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.
Thaw the Sequencing Buffer (SQB), Loading Beads (LB), Flush Tether (FLT) and one tube of Flush Buffer (FB) at room temperature before mixing the reagents by vortexing, and spin down at room temperature.
To prepare the flow cell priming mix, add 30 µl of thawed and mixed Flush Tether (FLT) directly to the tube of thawed and mixed Flush Buffer (FB), and mix by vortexing at room temperature.
Open the MinION device lid and slide the flow cell under the clip.
Press down firmly on the flow cell to ensure correct thermal and electrical contact.
MEDIDA OPCIONAL
Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.
Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.
Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.
Slide the priming port cover clockwise to open the priming port.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.
Thoroughly mix the contents of the Loading Beads (LB) tubes by vortexing.
In a new tube, prepare the library for loading as follows:
| Reagent | Volume per flow cell |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SQB) | 34 µl |
| Loading Beads (LB), mixed immediately before use | 25.5 µl |
| Nuclease-free water | 4.5 µl |
| DNA library | 11 µl |
| Total | 75 µl |
Note: Load the library onto the flow cell immediately after adding the Sequencing Buffer (SQB) and Loading Beads (LB) because the fuel in the buffer will start to be consumed by the adapter.
IMPORTANTE
The Loading Beads (LB) tube contains a suspension of beads. These beads settle very quickly. It is vital that they are mixed immediately before use.
Completar el cebado de la celda de flujo:
- Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
- Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.
Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
FIN DEL PROCESO
Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.
5. Adquisición de datos e identificación de bases
Cómo empezar a secuenciar
Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.
Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:
- En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o en remoto.
- Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.
Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:
- Manual de usuario MinION Mk1B
- Manual de usuario MinION Mk1C (EN)
- Manual de usuario MinION Mk1D (EN)
- Manual de usuario GridION
Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:
1. Ir a la página de inicio y pulsar "Iniciar secuenciación".
2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de muestra.
3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.
4. Configurar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o dejar la configuración por defecto en la pestaña Configuración del experimento.
Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, se puede activar en MinKNOW en la fase posejecución. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.
5. En la página de Inicio, pulsar Iniciar la secuenciación.
Análisis de datos
Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.
Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y de análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.
En la sección Análisis posterior, se describen otras opciones para analizar los datos.
6. Reutilización y devolución de celdas de flujo
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a entre 2 °C y 8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
CONSEJO
Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.
IMPORTANTE
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
7. Análisis posterior
Análisis posterior a la identificación de bases
Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:
1. Flujos de trabajo de EPI2ME
A fin de realizar un análisis en profundidad de los datos, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales sobre bioinformática y flujos de trabajo, que están disponibles en EPI2ME. La plataforma proporciona un espacio donde los flujos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
2. Herramientas de análisis para la investigación
Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y flujos de trabajo bioinformáticos, disponibles en EPI2ME Labs, que encontrará en la sección del mismo nombre de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los proyectos que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad
Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte el centro de recursos Resource Centre y busque herramientas bioinformáticas para su aplicación. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/programas informáticos.
8. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) | El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI. |
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas. |
Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Escasa recuperación | Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. | 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza. |
| Escasa recuperación | Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado | Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar.  |
| Escasa recuperación tras la preparación de extremos | El paso de lavado utilizó etanol a <70 % | Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto. |
9. Issues during the sequencing run
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales. |
Pore occupancy below 40%
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Pore occupancy <40% | Not enough library was loaded on the flow cell | Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol" |
| Pore occupancy close to 0 | The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA | Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the sequencing kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents. |
| Pore occupancy close to 0 | The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation | Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters. |
| Pore occupancy close to 0 | No tether on the flow cell | Tethers are adding during flow cell priming (FLT/FCT tube). Make sure FLT/FCT was added to FB/FCF before priming. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.  En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)  Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles. | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Reducción de la velocidad de secuenciación y del índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Reducción de la velocidad de secuenciación y el índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación | En la química del kit 9 (p. ej., SQK-LSK109), cuando la celda de flujo está sobrecargada con la biblioteca se observa un consumo rápido de combustible (consulte el protocolo correspondiente a su biblioteca de ADN para ver las recomendaciones) | Añadir más combustible a la celda de flujo, siguiendo las instrucciones en el protocolo de MinKNOW. En futuros experimentos, cargar cantidades menores de biblioteca en la celda de flujo. |
Fluctuación de la temperatura
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace. |
Guppy – no input .fast5 was found or basecalled
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| No input .fast5 was found or basecalled | input_path did not point to the .fast5 file location | The --input_path has to be followed by the full file path to the .fast5 files to be basecalled, and the location has to be accessible either locally or remotely through SSH. |
| No input .fast5 was found or basecalled | The .fast5 files were in a subfolder at the input_path location | To allow Guppy to look into subfolders, add the --recursive flag to the command |
Guppy – no Pass or Fail folders were generated after basecalling
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| No Pass or Fail folders were generated after basecalling | The --qscore_filtering flag was not included in the command | The --qscore_filtering flag enables filtering of reads into Pass and Fail folders inside the output folder, based on their strand q-score. When performing live basecalling in MinKNOW, a q-score of 7 (corresponding to a basecall accuracy of ~80%) is used to separate reads into Pass and Fail folders. |
Guppy – unusually slow processing on a GPU computer
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Unusually slow processing on a GPU computer | The --device flag wasn't included in the command | The --device flag specifies a GPU device to use for accelerate basecalling. If not included in the command, GPU will not be used. GPUs are counted from zero. An example is --device cuda:0 cuda:1, when 2 GPUs are specified to use by the Guppy command. |
Last updated: 9/7/2023
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