Ligation sequencing gDNA V14 — whole genome amplification (SQK-LSK114)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Ligation sequencing gDNA V14 — whole genome amplification (SQK-LSK114) V WAL_9192_v114_revE_26Jul2023

  • This protocol uses genomic DNA
  • Very low input requirements (e.g. single cells)
  • Multiple displacement amplification (MDA)
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

  • This protocol uses genomic DNA
  • Very low input requirements (e.g. single cells)
  • Multiple displacement amplification (MDA)
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: WAL_9192_v114_revE_26Jul2023

1. Overview of the protocol

Introduction to the whole genome amplification protocol

This protocol describes how to carry out whole genome amplification (WGA) of genomic DNA using the Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK114) and the QIAGEN REPLI-g Midi kit.

Please note, the whole genome amplification step described in this protocol is based off the methods described in the REPLI-g® Mini/Midi Handbook. Please refer to the QIAGEN documentation for additional information.

This protocol uses the multiple displacement amplification (MDA) method with the QIAGEN kit to amplify as little as 50 pg of bacterial DNA to yield up to 40 ug DNA. T7 Endonuclease I treatment is performed to resolve the hyperbranched structure of the WGA product and to improve read quality (Qscore) and flow cell output. It is important to note, however, that by using this method some amplification bias can be introduced in the MDA reaction.

Please note, using this protocol will result in shorter fragment lengths and lower flow cell output than preparing a DNA library using the standard Ligation Sequencing DNA V14 protocol.

Please refer to our Sequencing products of multiple displacement amplification (MDA) know-how document for more information on the available methods.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

You will need to:

  • Amplify the genomic DNA using random hexamer primers
  • Digest the amplified DNA with T7 Endonuclease I to remove branching, and size-select for longer fragments using AMPure XP beads
  • Prepare the DNA ends for adapter attachment
  • Attach sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
  • Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell

WGA LSK114 workflow

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
  • Start the EPI2ME software and select a workflow for further analysis (this step is optional)

Increasing flow cell output with PCR amplification

In instances where flow cell output is reduced when sequencing the products of MDA using the ligation-based protocol (<10 Gb from a MinION flow cell), we have found that performing a PCR amplification using the Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24) can recover flow cell output.

We recommend taking 5 ng of the MDA amplified sample from the whole genome amplification step described in this protocol and using it as input for the Rapid sequencing DNA - PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24) protocol to perform additional PCR amplification.

Please note, amplification bias could potentially be exacerbated with additional PCR, and some GC-bias can be introduced, leading to a slight reduction in coverage at the extremes of GC-content.

For more information refer to the info sheet: Sequencing products of multiple displacement amplification (MDA).

IMPORTANTE

This protocol was developed using E. coli gDNA. If using a different type of sample, please refer to the QIAGEN protocol for advice on how to modify the sample prep accordingly.

IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

Material
  • 50 pg high molecular weight genomic DNA
  • Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) (kit de secuenciación por ligación V14)
  • REPLI-g® Single Cell Kit (QIAGEN, cat # 150343)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • NEBNext® Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7672S o E7672L)
  • Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
  • Covaris g-TUBE
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • T7 Endonuclease I (NEB, cat # M0302)
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8.0), 0.1 mM EDTA
  • PEG 8000, 50% w/v (Rigaku Reagents, 25322-68-3)
  • 0.5 M EDTA, pH 8 (Thermo Scientific, R1021)
  • 5 M NaCl (Sigma, 71386)
  • 1 M Tris-HCl pH 8.0 (Thermo Scientific, 15893661)
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Heating block at 37°C capable of taking 1.5 ml tubes
  • Termociclador
  • Cubeta con hielo
  • Temporizador
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Equipo opcional
  • Standard gel electrophoresis equipment
  • Bioanalizador Agilent (o equivalente)
  • Centrifuga Eppendorf 5424 (o equivalente)

For this protocol, you will need 50 pg high molecular weight genomic DNA.

Cantidad de muestra inicial de ADN

Cómo realizar un control de calidad del ADN de la muestra inicial

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

NEBNext® Companion Module v2 para secuenciación por ligación, de Oxford Nanopore Technologies®

Recomendamos el módulo de acompañamiento NEBNext® Companion Module v2 for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (catalogue number E7672S or E7672L), que contiene todos los reactivos NEB necesarios para usar con el kit Ligation Sequencing Kit.

La versión previa, NEBNext® Companion Module de Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L) es compatible, pero el módulo recomendado v2 ofrece una ligación y adición de dA más efectiva, resultado del reactivo FFPEv2 DNA Repair Buffer y la ligasa Salt-T4 DNA Ligase, recpectivamente.
Con el módulo v2 también se consigue un notable ahorro de costes por preparación de muestra.

Nótese que, en los protocolos con amplicones no es necesario utilizar la mezcla de reparación de ADN, NEBNext FFPE DNA Repair Mix y es más rentable comprar los reactivos necesarios por separado.

Reactivos de otros fabricantes

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000
IMPORTANTE

AMPure XP Beads

Within the Ligation Sequencing Kit 24 V14 (SQK-LSK114), AMPure XP Beads (AXP) are supplied at the volume needed to complete the "DNA repair and end-prep" and "adapter ligation and clean-up" steps of the protocol.

However, extra AMPure XP Beads are required for the "whole genome amplification" step of the protocol.

IMPORTANTE

A fin de garantizar un elevado rendimiento de ligación del adaptador Ligation Adapter (LA), recomendamos el uso del tampón Ligation Buffer (LNB) incluido en el kit Ligation Sequencing Kit V14, en lugar del tampón de ligasa de otros fabricantes.

IMPORTANTE

El adaptador incluido en este kit, Ligation Adapter (LA), no es intercambiable con otros adaptadores de secuenciación.

Contenido del kit Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)

Nota: Hemos cambiando el formato de nuestros kits; hemos sustituido algunos de los viales de un solo uso por botellas de mayor contenido.

Formato de tubos monouso SQK-LSK114 v2 ES

Formato en botella SQK-LSK114 v3 ES

Nota: este producto contiene un reactivo, AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter Inc., que puede conservarse con el kit a -20 °C sin perjudicar su estabilidad.

Nota: la muestra de control de ADN (DCS) es un amplicón estándar de 3,6 kb, que mapea el extremo 3' del genoma Lambda.

3. Whole genome amplification

Material
  • 50 pg high molecular weight genomic DNA
  • REPLI-g® Single Cell Kit (QIAGEN, cat # 150343)
Consumibles
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • T7 Endonuclease I (NEB, cat # M0302)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8.0), 0.1 mM EDTA
  • PEG 8000, 50% w/v (Rigaku Reagents, 25322-68-3)
  • 0.5 M EDTA, pH 8 (Thermo Scientific, R1021)
  • 5 M NaCl (Sigma, 71386)
  • 1 M Tris-HCl pH 8.0 (Thermo Scientific, 15893661)
Instrumental
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P10
  • P2 pipette and tips
  • Termociclador
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Cubeta con hielo
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Thaw the REPLI-g sc DNA Polymerase on ice, mix well by pipetting and spin down. Store on ice until ready to use.

Prepare the DNA in nuclease-free water.

  • Transfer 50 pg genomic DNA into a clean 0.2 ml thin-walled PCR tube.
  • Adjust the volume to 4 μl with nuclease-free water.
  • Mix thoroughly by inversion and gently flicking to avoiding unwanted shearing.
  • Spin down briefly in a microfuge.

Reconstitute the Buffer DLB from the QIAGEN REPLI-g Single Cell kit as follows:

  • Add 500 µl of nuclease-free water to the Buffer DLB tube.
  • Thoroughly mix by vortexing and briefly spin down.

Note: According to the manufacturers, the reconstituted Buffer DLB can be stored for up to 6 months at -20°C.

In a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare sufficient Buffer D2 for the total number of reactions required as follows:

Reagent Volume for 4 samples Volume for 12 samples Volume for 24 samples
DTT, 1M 1 µl 3 µl 6 µl
Reconstituted Buffer DLB 11 µl 33 µl 66 µl
Total 12 µl 36 µl 72 µl

Note: The REPLI-g® Mini/Midi Handbook recommends preparing a stock of Buffer D2 minimise risk of error when pipetting small volumes. According to the manufacturers, the prepared Buffer D2 can be stored for up to 3 months at -20°C.

Add 3 µl of prepared Buffer D2 to the gDNA input sample in the 0.2 ml thin-walled PCR tube.

Mix gently by flicking the tube and spin down.

Incubate the reaction at 65°C for 10 minutes.

Add 3 µl of of Stop Solution to the denatured DNA sample tube. Mix by flicking the tube, briefly spin down and place on ice.

In a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube placed on ice, prepare the master mix as follows:

Pipette mix 10-20 times between each addition.

| Reagent | Volume | | --- | --- | --- | --- | | Nuclease-free water | 9 µl | | REPLI-g sc Reaction Buffer | 29 µl | | REPLI-g sc DNA Polymerase | 2 µl | | Total | 40 µl |

Mix thoroughly by pipetting and briefly spin down before storing the master mix on ice.

Combine the following reagents in the same 0.2 ml thin-walled PCR tube containing the sample:

Reagent Volume
Denatured DNA sample (from previous step) 10 µl
Prepared master mix 40 µl
Total 50 µl

Mix gently by flicking the tube and spin down.

Incubate the reaction for 2 hours at 30°C and 3 minutes at 65°C using a thermal cycler.

Transfer the sample to a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 90 µl of resuspended AMPure XP beads to the amplification reaction and mix by pipetting.

Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Prepare 500 μl of 80% ethanol in nuclease-free water.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Dejar el tubo en el imán y lavar el agregado de microesferas, con cuidado de no desplazarlo, con 200 µl de etanol al 80 %. Retirar el etanol con una pipeta y desechar.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 100 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Remove and retain 100 µl of eluate in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of the eluted sample using a Qubit fluorometer.

Prepare your amplified DNA sample as follows:

  • Transfer 1.5 µg of amplified DNA into a clean 0.2 ml thin-walled PCR tube.
  • Adjust the volume to 24 μl with nuclease-free water.
  • Mix thoroughly by inversion and gently flicking to avoiding unwanted shearing.
  • Spin down briefly in a microfuge.

Prepare the following reaction in the 0.2 ml thin-walled PCR tube containing the sample by adding the reagents in the following order:

Reagent Volume
1.5 µg of amplified DNA (from previous step) 24 µl
NEBuffer 2 3 µl
T7 Endonuclease I 3 µl
Total 30 µl

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.

Incubate the reaction for 60 minutes at 37°C.

Prepare the Custom buffer with beads as follows:

  • Prepare the Custom buffer mix in a clean 2 ml Eppendorf DNA LoBind tube:
Reagent Volume
1 M Tris-HCl 20 μl
0.5 M EDTA pH 8 4 μl
5 M NaCl 640 μl
PEG 8000 440 μl
Nuclease-free water 888 μl
Total 1992 μl
  • Mix the Custom buffer thoroughly by pipetting.
  • Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.
  • Prepare two 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes to contain 1 ml of resuspended AMPure XP beads each.
  • Pellet the beads in both tubes on a magnet. Keeping the tubes on the magnet, pipette off the supernatants.
  • Remove both tubes from the magnet and resuspend the beads in each tube with 1 ml of nuclease-free water. Return the tubes to the magnet and allow the beads to pellet. Pipette off the water and discard.
  • Repeat the previous step.
  • Spin down and place the tubes back on the magnet. Pipette off any residual water.
  • Resuspend both pellets in 200 ul of Custom Buffer. Transfer the full volume of both tubes of resuspended beads to the remaining Custom buffer in the 2 ml Eppendorf LoBind DNA tube.
  • Mix the Custom buffer with beads thoroughly by pipetting.

Prepare the amplified DNA sample as follows:

  • Transfer the 30 µl of amplified DNA sample into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
  • Adjust the volume to 50 μl with TE buffer, pH 8.
  • Mix thoroughly by inversion and gently flicking to avoiding unwanted shearing.
  • Spin down briefly in a microfuge.

Add 35 µl of the Custom buffer with beads to the DNA sample, and mix by flicking the tube.

Note: Thoroughly mix the Custom buffer by pipetting prior to use to ensure the beads are fully resuspended.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature. This step may be extended to 20 minutes if a slightly higher DNA recovery yield is desired.

Prepare 500 μl of 80% ethanol in nuclease-free water.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Dejar el tubo en el imán y lavar el agregado de microesferas, con cuidado de no desplazarlo, con 200 µl de etanol al 80 %. Retirar el etanol con una pipeta y desechar.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 49 µl nuclease-free water. Incubate for 1 minute at 50°C, and then for 5 minutes at room temperature.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Remove and retain 49 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of DNA using a Qubit fluorometer - recovery aim ~700 ng.

FIN DEL PROCESO

Take forward approximately 700 ng of DNA in 48 µl into the DNA repair and end-prep step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

CONSEJO

Increasing flow cell output with PCR amplification using the Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24)

If you have obtained low DNA recovery following the whole genome amplification step, or have previously performed the experiment and observed low flow cell output, please consider performing a PCR amplification of your MDA products using the Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24).

We recommend taking 5 ng of the MDA amplified sample from this step of the protocol and using it as the input for the Rapid sequencing DNA - PCR Barcoding Kit 24 V14 (SQK-RPB114.24) protocol.

4. Reparación del ADN y preparación de los extremos (1)

Material
  • Amplified DNA in 48 µl nuclease-free water
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
Consumibles
  • NEBNext® FFPE DNA Repair Mix (M6630), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
  • NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix (E7646), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
  • NEBNext® FFPE DNA Repair Buffer v2 (E7363), del Companion Module v2 (NEB, E7672S o E7672L) de NEBNext®
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P10
  • Microcentrífuga
  • Termociclador
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Gradilla magnética
  • Cubeta con hielo
Equipo opcional
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
CONSEJO

Recomendamos utilizar el módulo de acompañamiento Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (ref. E7672S or E7672L) de NEBNext®, que contiene los reactivos necesarios para utilizar junto al Ligation Sequencing Kit.

La versión anterior, NEBNext® Companion Module para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S o E7180L) también es compatible, pero el modelo recomendado v2, ofrece una ligadura y adición de dA más eficaces.

CHECKPOINT

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos se verifique la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.

Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.

Preparar los reactivos NEB siguiendo las instrucciones del fabricante y poner en hielo.

Para obtener un rendimiento óptimo, NEB recomienda lo siguiente:

  1. Descongelar todos los reactivos en hielo.

  2. Golpear suavemente los tubos de los reactivos con el índice o invertirlos, a fin de mezclarlos bien.
    Nota: No mezclar en vórtex las mezclas FFPE DNA Repair Mix, ni Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Centrifugar los tubos antes de abrirlos.

  4. Mezclar en vórtex los tampones FFPE DNA Repair Buffer v2 o FFPE DNA Repair Buffer y Ultra II End Prep Reaction Buffer, a fin de mezclarlos bien.

    Nota: Es posible que los tampones tengan un precipitado blanco. Si ello ocurre, dejar que la mezcla se ponga a temperatura ambiente y mezclar el tampón con la pipeta varias veces para romper el precipitado; a continuación, mezclar rápido en vórtex.

  5. El tampón FFPE DNA Repair Buffer puede tener un matiz amarillo; no importa si está así; se puede utilizar.

En un tubo de PCR de pared fina (0,2 ml), mezclar lo siguiente: (1)

Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.

Reactivo Volumen
ADN del paso anterior 47 µl
(opcional) DNA Control Sample (CS) 1 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer v2 7 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix 2 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
Total 60 µl

Si se utiliza la versión anterior del NEBNext® Companion Module para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S o E7180L):

Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.

Reactivo Volumen
ADN del paso anterior 47 µl
(opcional) DNA Control Sample (CS) 1 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer 3,5 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix 2 µl
Ultra II End-prep Reaction Buffer 3,5 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
Total 60 µl

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.

Incubar en el termociclador, primero a 20 ºC durante 5 minutos y después a 65 ºC durante 5 minutos más.

Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.

Transferir la muestra de ADN a un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

Añadir 60 µl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción de preparación de extremos y mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Preparar 500 µl de etanol al 80 %, con agua sin nucleasas.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Dejar el tubo en el imán y lavar el agregado de microesferas, con cuidado de no desplazarlo, con 200 µl de etanol al 80 %. Retirar el etanol con una pipeta y desechar.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 61 µl de agua sin nucleasas. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 61 µl de eluido y guardar en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

FIN DEL PROCESO

Una vez el ADN está reparado y con los extremos preparados, se puede proceder a la ligación del adaptador. En este punto, también se puede guardar la muestra a 4 ⁰C hasta el día siguiente.

5. Adapter ligation and clean-up

Material
  • Ligation Adapter (LA) (adaptador de ligación)
  • Ligation Buffer (LNB) (tampón de ligación) del kit Ligation Sequencing Kit
  • Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
  • Elution Buffer (EB) (tampón de elución) del kit de Oxford Nanopore
Consumibles
  • Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
  • Gradilla magnética
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
CONSEJO

Recomendamos utilizar Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467).

La ligasa Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467) puede adquirirse por separado o como parte del NEBNext® Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (ref. E7672S or E7672L).

La ligasa Quick T4 DNA Ligase (NEB, E6057), disponible en la versión anterior —NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L)— también es compatible, pero los nuevos reactivos recomendados ofrecen mayor eficacia y ligación.

IMPORTANTE

Aunque la ligasa recomendada de otros fabricantes se suministra con su propio tampón, la eficiencia del adaptador, Ligation Adapter (LA), es mayor cuando se usa el tampón Ligation Buffer (LNB) suministrado en el kit Ligation Sequencing Kit.

Centrifugar los viales Ligation Adapter (LA) y Salt-T4® DNA Ligase y poner en hielo.

Descongelar el vial Ligation Buffer (LNB) a temperatura ambiente, centrifugar y mezclar con la pipeta. Debido a su viscosidad, la agitación en vórtex de este tampón es ineficaz. Tras descongelar y mezclar, colocar en hielo inmediatamente.

Descongelar el vial Elution Buffer (EB) a temperatura ambiente, agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

Thaw the Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

En un tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml mezclar en el siguiente orden:

Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.

Reactivo Volumen
Muestra de ADN del paso anterior 60 µl
Ligation Adapter (LA) 5 µl
Ligation Buffer (LNB) 25 µl
Salt-T4® DNA Ligase 10 µl
Total 100 µl

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.

Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Resuspend the AMPure XP beads (AXP) by vortexing.

Añadir 40 μl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción y mezclar dando suaves golpes al tubo con el dedo.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Wash the beads by adding 250 μl of Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.

Note: Take care when removing the supernatant, the viscosity of the buffer can contribute to loss of beads from the pellet.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 15 µl de Elution Buffer (EB). Centrifugar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tratándose de ADN de alto peso molecular, incubar a 37 ⁰C puede mejorar la recuperación de fragmentos largos.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 15 μl del eluido que contiene la biblioteca de ADN y conservar en un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.

Deshechar las microesferas precipitadas.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

Depending on your DNA library fragment size, prepare your final library in 12 µl of Elution Buffer (EB).

Fragment library length Flow cell loading amount
Very short (<1 kb) 100 fmol
Short (1-10 kb) 35–50 fmol
Long (>10 kb) 300 ng

Note: If the library yields are below the input recommendations, load the entire library.

If required, we recommend using a mass to mol calculator such as the NEB calculator.

FIN DEL PROCESO

La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo o a 4 °C hasta el momento de cargar.

CONSEJO

Recomendaciones de guardado de la biblioteca

Se recomienda guardar las bibliotecas en tubos Eppendorf DNA LoBind a 4 ⁰C, durante periodos de tiempo cortos o en caso de uso repetido, por ejemplo, para recargar celdas de flujo entre lavados. Para uso individual y para conservar a largo plazo por periodos de más de 3 meses, se recomienda guardar las bibliotecas a -80 ⁰C en tubos Eppendorf DNA LoBind.

6. Cebado y carga de la celda de flujo MinION/GridION

Material
  • Flow Cell Flush (FCF)
  • Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
  • Sequencing Buffer (SB)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE

Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).

CONSEJO

Cebado y carga de la celda de flujo

Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

IMPORTANTE

Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.

Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).

Para preparar la mezcla de cebado con seroalbúmina bovina, mezclar Flow Cell Flush (FCF) y Flow Cell Tether (FCT) como se indica a continuación. Mezclar con la pipeta a temperatura ambiente.

Nota: Hemos cambiando el formato de algunos de los viales de nuestros kits, de tubos monouso a botellas de mayor cantidad.

Formato en tubos monouso En el tubo de Flow Cell Flush (FCF), añadir directamente 5 µl de seroalbúmina bovina (BSA), a una concentración de 50 mg/ml y 30 µl de Flow Cell Tether (FCT).

Formato en botella: En un tubo proporcionado a la cantidad de celdas de flujo que se vayan a utilizar, mezclar los siguientes reactivos:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Flow Cell Flush (FCF) 1 170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) a una concentración de 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Volumen total 1 205 µl

Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:

  1. Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
  2. Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
  3. Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5 SPANISH

Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).

IMPORTANTE

Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.

En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.

En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Sequencing Buffer (SB) 37,5 µl
Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere 25,5 µl
Biblioteca de ADN 12 µl
Total 75 µl

Completar el cebado de la celda de flujo:

  1. Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
  2. Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

Flow Cell Loading Diagrams Step 5

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5 SPANISH 2

Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.

Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.

Flow Cell Loading Diagram Step 07 V5 SPANISH

Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.

Step 8 update - SPANISH

Flow Cell Loading Diagrams Step 9 SPANISH

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:

  1. Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.

  2. Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised. SPANISH

ATENCIÓN

La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.

FIN DEL PROCESO

Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.

7. Adquisición de datos e identificación de bases

Cómo empezar a secuenciar

Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.

Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:

  • En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o en remoto.
  • Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.

Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:

Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:

1. Ir a la página de inicio y pulsar "Iniciar secuenciación".

2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de muestra.

3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.

4. Configurar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o dejar la configuración por defecto en la pestaña Configuración del experimento.

Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, se puede activar en MinKNOW en la fase posejecución. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.

5. En la página de Inicio, pulsar Iniciar la secuenciación.

Análisis de datos

Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.

Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y de análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.

En la sección Análisis posterior, se describen otras opciones para analizar los datos.

8. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

9. Análisis posterior

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:

1. Flujos de trabajo de EPI2ME

A fin de realizar un análisis en profundidad de los datos, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales sobre bioinformática y flujos de trabajo, que están disponibles en EPI2ME. La plataforma proporciona un espacio donde los flujos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis para la investigación

Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y flujos de trabajo bioinformáticos, disponibles en EPI2ME Labs, que encontrará en la sección del mismo nombre de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los proyectos que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte el centro de recursos Resource Centre y busque herramientas bioinformáticas para su aplicación. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/programas informáticos.

10. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <70 % Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

11. Issues during the sequencing run

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the sequencing kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents.
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FLT/FCT tube). Make sure FLT/FCT was added to FB/FCF before priming.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones:

1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Reducción de la velocidad de secuenciación y del índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Reducción de la velocidad de secuenciación y el índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación En la química del kit 9 (p. ej., SQK-LSK109), cuando la celda de flujo está sobrecargada con la biblioteca se observa un consumo rápido de combustible (consulte el protocolo correspondiente a su biblioteca de ADN para ver las recomendaciones) Añadir más combustible a la celda de flujo, siguiendo las instrucciones en el protocolo de MinKNOW. En futuros experimentos, cargar cantidades menores de biblioteca en la celda de flujo.

Fluctuación de la temperatura

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ.

Guppy – no input .fast5 was found or basecalled

Observation Possible cause Comments and actions
No input .fast5 was found or basecalled input_path did not point to the .fast5 file location The --input_path has to be followed by the full file path to the .fast5 files to be basecalled, and the location has to be accessible either locally or remotely through SSH.
No input .fast5 was found or basecalled The .fast5 files were in a subfolder at the input_path location To allow Guppy to look into subfolders, add the --recursive flag to the command

Guppy – no Pass or Fail folders were generated after basecalling

Observation Possible cause Comments and actions
No Pass or Fail folders were generated after basecalling The --qscore_filtering flag was not included in the command The --qscore_filtering flag enables filtering of reads into Pass and Fail folders inside the output folder, based on their strand q-score. When performing live basecalling in MinKNOW, a q-score of 7 (corresponding to a basecall accuracy of ~80%) is used to separate reads into Pass and Fail folders.

Guppy – unusually slow processing on a GPU computer

Observation Possible cause Comments and actions
Unusually slow processing on a GPU computer The --device flag wasn't included in the command The --device flag specifies a GPU device to use for accelerate basecalling. If not included in the command, GPU will not be used. GPUs are counted from zero. An example is --device cuda:0 cuda:1, when 2 GPUs are specified to use by the Guppy command.

Last updated: 8/21/2024

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