Ligation sequencing gDNA V14 - Adeno-associated virus sequencing (SQK-NBD114.24)
Protocol
Ligation sequencing gDNA V14 - Adeno-associated virus sequencing (SQK-NBD114.24) VAAV_9194_v114_revC_20Sep2023
Sequencing of adeno-associated virus (AAV) vectors.
- Requires the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
- Includes no PCR steps
- Uses up to 24 barcodes
- Allows analysis of native DNA
- Compatible with R10.4.1 flow cells
For Research Use Only
This is an Early Access product. For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introduction to the protocol
Sample preparation
Library preparation
- 6. End-prep
- 7. Native barcode ligation
- 8. Adapter ligation and clean-up
- 9. Cebado y carga de la celda de flujo MinION/GridION
- 10. Washing and reloading a flow cell
Sequencing and data analysis
Troubleshooting
Overview
Sequencing of adeno-associated virus (AAV) vectors.
- Requires the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
- Includes no PCR steps
- Uses up to 24 barcodes
- Allows analysis of native DNA
- Compatible with R10.4.1 flow cells
For Research Use Only
This is an Early Access product. For more information about our Early Access programmes, please see this article on product release phases.
1. Overview of the protocol
IMPORTANTE
Este es un producto de acceso anticipado
Para tener más información sobre los programas de acceso anticipado, consulte este artículo sobre las fases de lanzamiento del producto.
Procure usar la versión más reciente del protocolo.
Introduction to the adeno-associated virus sequencing protocol
This end-to-end protocol describes how to extract recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors using the PureLink™ Viral RNA/DNA Mini extraction kit before sequencing using the Native Barcoding Sequencing Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24). We have also included an optional annealing step post-extraction, however, we have found higher amounts of full-length inverted terminal repeat (ITR) sequences when the annealing step has been skipped before library preparation. Flushing steps have also been included as we recommend washing the flow cell to restore pores and to load a fresh library to continue sequencing.
The Know-How document is available for further details about the protocol optimisations and best practices.
Note: This protocol is currently validated to barcode up to six AAV samples for sequencing on a single flow cell.
Sequencing of the rAAV vectors enables the validation of vectors to ensure the transgene and promoter of interest are present, as well as identifying truncated rAAV genomes and any contamination. Validation is crucial in gene therapy to ensure the correct rAAV genomes are packaged into cells before therapeutic use.
Steps in the sequencing workflow:
Prepare for your experiment You will need to:
- Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
- Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents.
- Download the software for acquiring and analysing your data.
- Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run.
Experiment workflow
| Protocol step | Process | Time | Stop option |
|---|---|---|---|
| DNAseI treatment | Perform DNAseI treatment of the rAAV lysates to remove any non-encapsidated DNA from the rAAV preparations | 35 minutes | - |
| DNA extraction from rAAV | Extract the rAAV vectors using the PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit | 45 minutes | –80°C for long-term storage |
| Annealing | (Optional) Self-anneal any remaining (+) and (-) single strands of rAAV vector | 80 minutes | - |
| End-prep | Prepare the DNA ends for adapter attachment | 20 minutes | 4°C overnight |
| Native barcode ligation | Ligate the native barcodes to the DNA ends | 60 minutes | 4°C overnight |
| Adapter ligation and clean-up | Ligate sequencing adapters to the DNA ends | 50 minutes | 4°C for short-term storage or for repeated use, such as for reloading your flow cell –80°C for long-term storage |
| Priming and loading the flow cell | Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell | 5 minutes |
Sequencing
You will need to:
- Start a sequencing run using the MinKNOW software which will collect raw data from the device and basecall reads in real-time. The reads will also be demultiplexed in MinKNOW.
- Start the EPI2ME software and use the wf-aav-qc workflow for analysis.
IMPORTANTE
Compatibility of this protocol
This protocol should only be used in combination with:
- Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
- Native Barcoding Kit 96 V14 (SQK-NBD114.96)
- R10.4.1 flow cells (FLO-MIN114)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
- Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003)
- Native Barcoding Expansion V14 (EXP-NBA114)
- MinION Mk1C device - MinION Mk1C IT requirements document
- MinION Mk1B device - MinION IT requirements document
2. Equipment and consumables
Material
- 2.6 x10^10 GC of rAAV per sample
- Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit (Thermo Fisher, 12280050)
- Qubit™ ssDNA Assay Kit (ThermoFisher, Q10212)
- Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
- NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (NEB E7546) (Módulo de reparación de extremos/Adición de dA)
- NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056) (Módulo de ligación rápida)
- NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
- DNase I (NEB, M0303)
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- 50X annealing buffer (2.5 M NaCl, 500 mM Tris-HCl, pH 7.5)
- Ethanol, 100% (e.g. Fisher, 16606002)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora para celdas de flujo MinION
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Microplate centrifuge, e.g. Fisherbrand™ Mini Plate Spinner Centrifuge (Fisher Scientific, 11766427)
- Microfuge
- Magnetic rack
- Mezclador vórtex
- Termociclador
- Multichannel pipette and tips
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
- Eppendorf 5424 centrifuge (or equivalent)
- Temporizador
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Cubeta con hielo
Equipo opcional
- Nanodrop spectrophotometer
This protocol requires 2.6 x10^10 GC of recombinant adeno-associate virus (rAAV) per sample.
A minimum of 2.6 x10^10 GC of rAAV per sample has been trialled across six barcodes.
We recommend estimating genome copy number per ml (GC/ml) and to standardise rAAV inputs prior to DNAseI treatment. Droplet digital PCR (ddPCR) or qPCR are commonly used to quantify AAV vector genome numbers in titres.
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Se recomienda preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en los primeros tres meses desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| Flongle | 50 |
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
IMPORTANTE
We do not recommend mixing barcoded libraries with non-barcoded libraries prior to sequencing.
Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) contents
Note: We are in the process of reformatting our kits with single-use tubes into a bottle format and reducing the concentration of EDTA.
Single-use tubes format with higher EDTA concentration:
Higher concentration of EDTA with a clear cap.
Bottle format with reduced EDTA concentration:
Reduced concentration of EDTA with a blue cap.
Note: This Product Contains AMPure XP Reagent Manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.
Note: The DNA Control Sample (DCS) is a 3.6 kb standard amplicon mapping the 3' end of the Lambda genome.
To maximise the use of the Native Barcoding Kits, the Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) and the Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) expansion packs are available.
These expansions provide extra library preparation and flow cell priming reagents to allow users to utilise any unused barcodes for those running in smaller subsets.
Both expansion packs used together will provide enough reagents for 12 reactions. For customers requiring extra EDTA to maximise the use of barcodes, we recommend using 0.25 M EDTA and adding 4 µl for library preps using the SQK-NBD114.24 kit and 2 µl for preps using the SQK-NBD114.96 kit.
Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) contents:
Note: This Product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.
Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) contents:
3. DNAseI treatment
Material
- 2.6 x10^10 GC of rAAV per sample
Consumibles
- DNase I (NEB, M0303)
- 0.5 M EDTA (Fisher Scientific, 11568896)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- Termociclador
- Extraction hood
- Microfuge
- Ice bucket with ice
- P1000 pipette and tips
- P200 pipette and tips
- P100 pipette and tips
- P20 pipette and tips
DNAseI treatment is carried out before extraction to remove any non-encapsidated DNA from the rAAV preparations.
Thaw the DNaseI reaction buffer and rAAV lysates (if they have been stored in the freezer) at room temperature and place on ice.
IMPORTANTE
The following steps with rAAV samples should be carried out in an extraction hood to avoid contamination.
Prepare each rAAV sample in nuclease-free water:
- Transfer ≥2.6 x10^10 GC of AAV sample into a 1.5 ml Eppendord DNA LoBind tube.
- Adjust the volume to 170 µl with nuclease-free water.
- Mix by pipetting up and down.
- Spin down briefly in a microfuge.
Combine the following reagents in the 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube for each sample.
| Reagent | Volume |
|---|---|
| rAAV sample (≥2.6 x10^10 GC per sample) | 170 µl |
| DNAseI reaction buffer | 20 µl |
| DNAseI | 10 µl |
| Total | 200 µl |
Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.
Using a thermal cycler, incubate at 37°C for 10 minutes.
Add 2 µl of 0.5 M EDTA to each sample and mix thoroughly by pipetting and spin down briefly.
Using a thermal cycler, incubate at 72°C for 10 minutes.
FIN DEL PROCESO
Take your treated rAAV lysate samples forward into the DNA extraction step.
4. DNA extraction from rAAV
Material
- DNAseI treated rAAV lysate samples
Consumibles
- PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit (Thermo Fisher, 12280050)
- Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
- Qubit™ ssDNA Assay Kit (ThermoFisher, Q10212)
- Ethanol, 100% (e.g. Fisher, 16606002)
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Microfuge
- Mezclador vórtex
- Termociclador
- Eppendorf 5424 centrifuge (or equivalent)
- P1000 pipette and tips
- P100 pipette and tips
- P200 pipette and tips
- P20 pipette and tips
- Pipeta y puntas P10
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
This extraction step is performed using the PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit and includes steps from the user guide for completeness.
The PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit user guide is available here.
Add 60 ml of 96-100% ethanol to 15 ml of Wash Buffer (WII) and store at room temperature.
Add 310 µl nuclease-free water directly to the tube of 310 µg lyophilised Carrier RNA to obtain 1 µg/µl Carrier RNA stock solution and mix thoroughly.
Calculate the volume of Lysis Buffer/Carrier RNA mix required to process the desired number of samples simultaneously using the following formula:
N x 0.21 ml (volume of Lysis Buffer/reaction) = A ml A ml x 28 µl/ml = B µl
N = number of samples A = calculated volume of Lysis Buffer B = calculated volume of 1 µg/µl Carrier RNA stock solution to add to Lysis Buffer
Worked example for 6 samples:
6 x 0.21 ml = 1.26 ml 1.26 ml x 28 µl/ml = 35.28 µl
1.26 ml of Lysis Buffer 35.28 µl of Carrier RNA stock solution
Aliquot the Carrier RNA stock solution and take forward the required volume into the next step. Store any excess aliquots at -20°C and avoid repeated freezing and thawing.
IMPORTANTE
Do NOT vortex the Lysis Buffer as this will generate a foam.
In a sterile 2 ml Eppendorf DNA LoBind tube, add the calculated volume of Carrier RNA stock solution to the calculated volume of Lysis Buffer and mix gently by pipetting.
For 6 samples, add 35.28 µl of Carrier RNA stock solution to 1.26 ml of Lysis Buffer.
Store the buffer at 4°C until use.
IMPORTANTE
The Lysis Buffer must be used within an hour.
Add 25 µl Proteinase K into a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube for each sample.
Spin down the DNAseI treated rAAV samples.
Transfer 200 µl of an rAAV lysate sample to a tube containing Proteinase K and repeat for each sample into separate tubes.
Note: Ensure the rAAV samples are at room temperature and not combined.
Add 200 µl Lysis Buffer to each tube. Close the tube lids and mix by vortexing for 15 seconds.
Incubate at 56°C for 15 minutes.
Briefly centrifuge the tubes to remove any drops from the inside of the lids.
Add 250 µl 96-100% ethanol to each tube to obtain a final concentration of 37% and mix by vortexing for 15 seconds.
Incubate the tubes with ethanol for 5 minutes at room temperature and spin down.
Spin down the tubes to remove any drops from the lids.
Transfer each lysate with ethanol (~675 µl) into a new Viral Spin Column.
Centrifuge the columns at ~6,800 x g for 1 minute. Discard the collection tubes with the flow-through.
Place the Viral Spin Columns in clean Wash Tubes and add 500 µl Wash Buffer (WII) with ethanol to the Viral Spin Columns.
Centrifuge the columns at ~6,800 x g for 1 minute. Discard the flow-through and place the spin columns back into the Wash Tubes.
Add 500 µl Wash Buffer (WII) with ethanol into the spin columns.
Centrifuge the columns at ~6,800 x g for 1 minute. Discard the Wash Tubes containing the flow-through.
Place the spin columns into clean Wash Tubes.
Centrifuge the columns at maximum speed in the microcentrifuge for 1 minute to dry the membranes completely. Discard the Wash Tubes with the flow-through.
Place the Viral Spin Columns in clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes.
Add 50 µl of nuclease-free water into the centre of each of the spin columns and close the lids.
Incubate at room temperature for 1 minute.
Centrifuge the spin columns at maximum speed for 1 minute. The Eppendorf DNA LoBind tubes will contain the extracted rAAV DNA for each sample. Remove and discard the spin columns.
CHECKPOINT
Quantify 1 µl of eluted sample using the ssDNA and dsDNA HS Qubit Assay kit and Qubit fluorometer.
Note: The carrier RNA in PureLink™ kit may affect the ssDNA Qubit measurements.
FIN DEL PROCESO
Take the extracted rAAV DNA samples into the optional annealing step or the library preparation step. Samples can be stored at -80°C for later use.
5. (Optional) Annealing
Material
- Extracted rAAV samples
Consumibles
- 50X annealing buffer (2.5 M NaCl, 500 mM Tris-HCl, pH 7.5)
- Qubit™ ssDNA Assay Kit (ThermoFisher, Q10212)
- Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q33230)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
- 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
Instrumental
- Termociclador
- P200 pipette and tips
- P100 pipette and tips
- P20 pipette and tips
Equipo opcional
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
This optional self-hybridisation step can be used to self-anneal any remaining (+) and (-) single strands of rAAV vector together before library preparation.
This step can be skipped and the library preparation started immediately as we have found higher amounts of full-length inverted terminal repeat (ITR) sequences without the annealing step.
Prepare the 50X annealing buffer (2.5 M NaCl, 500 mM Tris-HCl, pH 7.5).
Add 1 µl of 50X annealing buffer (2.5 M NaCl, 500 mM Tris-HCl, pH 7.5) to each rAAV sample, to reach a total volume of 50 µl.
Transfer each sample to a clean 0.2 ml PCR tube or a PCR plate.
In a thermal cycler, incubate the tubes at 95°C for 5 minutes before ramping down to 25°C (1 minute per 1°C).
MEDIDA OPCIONAL
Quantify 1 µl of recovered rAAV using the dsDNA and ssDNA HS Qubit assay with a Qubit fluorometer.
FIN DEL PROCESO
Take the remaining samples forward into the library preparation step.
6. End-prep
Material
- Extracted rAAV DNA in 50 µl per sample
- AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
Consumibles
- NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB E7546)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Multichannel pipette and tips
- Thermal cycler
- Microfuge
- Cubeta con hielo
- Magnetic rack
- Mezclador vórtex
- Hula mixer (rotator mixer)
- Qubit fluorometer (or equivalent)
- Pipeta y puntas P1000
- P200 pipette and tips
- Pipeta y puntas P100
- P20 pipette and tips
- Pipeta y puntas P10
- P2 pipette and tips
CHECKPOINT
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos se verifique la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.
Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.
Thaw the AMPure XP Beads (AXP) at room temperature and mix by vortexing. Keep the beads at room temperature until use.
Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:
For optimal performance, NEB recommend the following:
Thaw all reagents on ice.
Ensure the reagents are well mixed.
Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.Always spin down tubes before opening for the first time each day.
The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.
If the optional annealing step was skipped, make up each AAV sample to 50 µl with nuclease-free water.
For each rAAV sample, combine the following reagents in a 0.2 ml PCR tube.
Between each addition, pipette mix 10-20 times.
| Reagent | Volume |
|---|---|
| rAAV DNA | 50 µl |
| NEBNext Ultra II End-prep Reaction Buffer | 7 µl |
| NEBNext Ultra II End-prep Enzyme Mix | 3 µl |
| Total | 60 µl |
Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting and spin down briefly.
Incubar en el termociclador, primero a 20 ºC durante 5 minutos y después a 65 ºC durante 5 minutos más.
Transfer each sample into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Resuspend the AMPure XP beads (AXP) by vortexing.
Añadir 60 µl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción de preparación de extremos y mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo.
Incubate the samples on a Hula Mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.
Prepare sufficient fresh 80% ethanol in nuclease-free water for all of your samples. Allow enough for 400 µl per sample, with some excess.
Spin down the samples and pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless. Keep the tubes on the magnet and pipette off the supernatant.
Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.
If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.
Repetir el paso anterior.
Briefly spin down and place the tubes back on the magnet for the beads to pellet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for 30 seconds, but do not dry the pellets to the point of cracking.
Remove the tubes from the magnetic rack and resuspend the pellet in 10 µl nuclease-free water.
Incubate the samples on a Hula Mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.
Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.
Remove and retain 10 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
CHECKPOINT
Quantify 1 µl of each eluted sample using a Qubit fluorometer.
FIN DEL PROCESO
Take forward an equimolar mass of each sample to be barcoded forward into the native barcode ligation step. However, you may store the samples at 4°C overnight.
7. Native barcode ligation
Material
- Native Barcodes (NB01-24)
- AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
- EDTA (EDTA)
Consumibles
- NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q32851)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
- 0.2 ml PCR tubes
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Gradilla magnética
- Mezclador vórtex
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Microfuge
- Termociclador
- Cubeta con hielo
- Multichannel pipette and tips
- Pipeta y puntas P1000
- P200 pipette and tips
- Pipeta y puntas P100
- P20 pipette and tips
- Pipeta y puntas P10
- P2 pipette and tips
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Prepare the NEB Blunt/TA Ligase Master Mix according to the manufacturer's instructions, and place on ice:
Thaw the reagents at room temperature.
Spin down the reagent tubes for 5 seconds.
Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes.
Thaw the EDTA at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.
Thaw the Native Barcodes (NB01-24) required for your number of samples at room temperature. Individually mix the barcodes by pipetting, spin down, and place them on ice.
Select a unique barcode for each sample to be run together on the same flow cell.
Note: Only use one barcode per sample.
In clean 0.2 ml PCR-tubes, add the reagents in the following order per well:
Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.
| Reagent | Volume |
|---|---|
| End-prepped rAAV DNA | 7.5 µl |
| Native Barcode (NB01-24) | 2.5 µl |
| Blunt/TA Ligase Master Mix | 10 µl |
| Total | 20 µl |
Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.
Incubate for 20 minutes at room temperature.
Add the following volume of EDTA to each well and mix thoroughly by pipetting and spin down briefly.
Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.
| EDTA cap colour | Volume per well |
|---|---|
| For clear cap EDTA | 2 µl |
| For blue cap EDTA | 4 µl |
CONSEJO
EDTA is added at this step to stop the reaction.
Pool all the barcoded samples in a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.
| Volume per sample | For 6 samples | |
|---|---|---|
| Total volume for preps using clear cap EDTA | 22 µl | 132 µl |
| Total volume for preps using blue cap EDTA | 24 µl | 144 µl |
Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.
Add AMPure XP Beads (AXP) to the pooled reaction, and mix by pipetting for a 0.4X clean.
Note: Ensure you follow the instructions for the cap colour of your EDTA tube.
| / | Volume per sample | For 6 samples |
|---|---|---|
| Volume of AXP for preps using clear cap EDTA | 9 µl | 53 µl |
| Volume of AXP for preps using blue cap EDTA | 10 µl | 58 µl |
Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.
Prepare 2 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water.
Spin down the sample and pellet on a magnet for 5 minutes. Keep the tube on the magnetic rack until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.
Keep the tube on the magnetic rack and wash the beads with 700 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.
If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.
Repetir el paso anterior.
Spin down and place the tube back on the magnetic rack. Pipette off any residual ethanol. Allow the pellet to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 35 µl nuclease-free water by gently flicking.
Incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.
Pellet the beads on a magnetic rack until the eluate is clear and colourless.
Remove and retain 35 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Dispose of the pelleted beads
CHECKPOINT
Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.
FIN DEL PROCESO
Take forward the barcoded DNA library to the adapter ligation and clean-up step. However, you may store the sample at 4°C overnight.
8. Adapter ligation and clean-up
Material
- Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
- Elution Buffer (EB)
- Native Adapter (NA)
- AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
Consumibles
- NEBNext® Quick Ligation Module (NEB, E6056)
- NEBNext® Quick Ligation Reaction Buffer (NEB, B6058)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q32851)
Instrumental
- Microcentrífuga
- Gradilla magnética
- Mezclador vórtex
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Termociclador
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Ice bucket with ice
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
IMPORTANTE
The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.
Prepare the NEBNext Quick Ligation Reaction Module according to the manufacturer's instructions, and place on ice:
Thaw the reagents at room temperature.
Spin down the reagent tubes for 5 seconds.
Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes. Note: Do NOT vortex the Quick T4 DNA Ligase.
The NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5x) may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for several seconds to ensure the reagent is thoroughly mixed.
Spin down the Native Adapter (NA) and Quick T4 DNA Ligase, pipette mix and place on ice.
Thaw the Elution Buffer (EB) and Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature, before mixing by vortexing. Then spin down and place on ice.
In a 1.5 ml Eppendorf LoBind tube, mix in the following order:
Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.
| Reagent | Volume |
|---|---|
| Pooled barcoded sample | 30 µl |
| Native Adapter (NA) | 5 µl |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5X) | 10 µl |
| Quick T4 DNA Ligase | 5 µl |
| Total | 50 µl |
Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.
Incubate the reaction for 20 minutes at room temperature.
IMPORTANTE
The next clean-up step uses Short Fragment Buffer (SFB) rather than 80% ethanol to wash the beads. The use of ethanol will be detrimental to the sequencing reaction.
Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.
Add 20 µl of resuspended AMPure XP Beads (AXP) to the reaction and mix by pipetting.
Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.
Spin down the sample and pellet on the magnetic rack. Keep the tube on the magnet and pipette off the supernatant.
Wash the beads by adding either 125 μl Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.
Repetir el paso anterior.
Spin down and place the tube back on the magnet. Pipette off any residual supernatant.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 15 µl Elution Buffer (EB).
Spin down and incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Extraer 15 μl del eluido que contiene la biblioteca de ADN y conservar en un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.
Deshechar las microesferas precipitadas.
CHECKPOINT
Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.
IMPORTANTE
We recommend loading 12 µl of the final prepared library onto the R10.4.1 flow cell.
This protocol has been written to maximise the output from the flow cells with the limited starting input.
FIN DEL PROCESO
The prepared library is used for loading onto the flow cell. Store the library on ice or at 4°C until ready to load.
CONSEJO
Recomendaciones de guardado de la biblioteca
Se recomienda guardar las bibliotecas en tubos Eppendorf DNA LoBind a 4 ⁰C, durante periodos de tiempo cortos o en caso de uso repetido, por ejemplo, para recargar celdas de flujo entre lavados. Para uso individual y para conservar a largo plazo por periodos de más de 3 meses, se recomienda guardar las bibliotecas a -80 ⁰C en tubos Eppendorf DNA LoBind.
9. Cebado y carga de la celda de flujo MinION/GridION
Material
- Flow Cell Flush (FCF) (enjuague de celda de flujo)
- Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
- Library Solution (LIS)
- Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
- Sequencing Buffer (SB) (tampón de secuenciación)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora para celdas de flujo MinION
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE
Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).
CONSEJO
Cebado y carga de la celda de flujo
Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
IMPORTANTE
Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.
Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).
Para preparar la mezcla de cebado con seroalbúmina bovina, mezclar Flow Cell Flush (FCF) y Flow Cell Tether (FCT) como se indica a continuación. Mezclar con la pipeta a temperatura ambiente.
Nota: Hemos cambiando el formato de algunos de los viales de nuestros kits, de tubos monouso a botellas de mayor cantidad.
Formato en tubos monouso En el tubo de Flow Cell Flush (FCF), añadir directamente 5 µl de seroalbúmina bovina (BSA), a una concentración de 50 mg/ml y 30 µl de Flow Cell Tether (FCT).
Formato en botella: En un tubo proporcionado a la cantidad de celdas de flujo que se vayan a utilizar, mezclar los siguientes reactivos:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Flow Cell Flush (FCF) | 1 170 µl |
| Bovine Serum Albumin (BSA) a una concentración de 50 mg/ml | 5 µl |
| Flow Cell Tether (FCT) | 30 µl |
| Volumen total | 1 205 µl |
Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.
MEDIDA OPCIONAL
Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.
Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.
Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.
Para abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizar la tapa en el sentido de las agujas del reloj.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Cargar 800 μl de mezcla de cebado en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.
Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).
IMPORTANTE
Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.
En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.
En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 37,5 µl |
| Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere | 25,5 µl |
| Biblioteca de ADN | 12 µl |
| Total | 75 µl |
Completar el cebado de la celda de flujo:
- Levantar suavemente la tapa del puerto de muestra SpotON.
- Cargar 200 µl de mezcla de cebado en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.
Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, instale la pantalla protectora justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos poner la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
FIN DEL PROCESO
Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.
10. Washing and reloading a flow cell
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
- Sequencing Buffer (SB)
- Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
- Library Solution (LIS)
- Flow Cell Tether (FCT)
- Flow Cell Flush (FCF)
Consumibles
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- Vortex mixer
- Cubeta con hielo
- P1000 pipette and tips
- P200 pipette and tips
- Pipeta y puntas P10
Flow cell washing and reloading
Due to the low input material for the library preparation, low pore occupancy (<25% of active pore) can occur before enough data is generated for data analysis. Therefore, we recommend washing and reloading your flow cell with fresh library to maintain high data acquisition when approximately ~25% of active pores remain.
The Flow Cell Wash Kit removes most of the initial library as well as unblocking pores to prepare the flow cell for loading a new library for further sequencing. Pore availability can be viewed on the Pore Activity or the Pore Scan plot on MinKNOW.
CONSEJO
We recommend keeping the light shield on the flow cell during washing if a second library will be loaded straight away.
If the flow cell is to be washed and stored, the light shield can be removed.
IMPORTANTE
A P1000 pipette must be used for all flushing steps to create a seal with the flow cell ports.
Place the tube of Wash Mix (WMX) on ice. Do not vortex the tube.
Thaw one tube of Wash Diluent (DIL) at room temperature.
Mix the contents of Wash Diluent (DIL) thoroughly by vortexing, then spin down briefly and place on ice.
In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare the following Flow Cell Wash Mix:
| Reagent | Volume per flow cell |
|---|---|
| Wash Mix (WMX) | 2 μl |
| Wash Diluent (DIL) | 398 μl |
| Total | 400 μl |
Mix well by pipetting, and place on ice. Do not vortex the tube.
Pause the sequencing experiment in MinKNOW, and leave the flow cell in the device.
IMPORTANTE
It is vital that the flow cell priming port and SpotON sample port are closed before removing the waste buffer to prevent air from being drawn across the sensor array area, which would lead to a significant loss of sequencing channels.
Remove the waste buffer, as follows:
- Close the priming port and SpotON sample port cover, as indicated in the figure below.
- Insert a P1000 pipette into waste port 1 and remove the waste buffer.
Note: As both the priming port and SpotON sample port are closed, no fluid should leave the sensor array area.
Slide the flow cell priming port cover clockwise to open.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
After opening the priming port, check for a small air bubble under the cover. Draw back a small volume to remove any bubbles:
- Set a P1000 pipette to 200 µl.
- Insert the tip into the flow cell priming port.
- Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, or until you can see a small volume of buffer/liquid entering the pipette tip.
- Visually check that there is continuous buffer from the flow cell priming port across the sensor array.
Slowly load 200 µl of the prepared flow cell wash mix into the priming port, as follows:
- Using a P1000 pipette, take 200 µl of the flow cell wash mix
- Insert the pipette tip into the priming port, ensuring there are no bubbles in the tip
- Slowly twist the pipette wheel down to load the flow cell (if possible with your pipette) or push down the plunger very slowly, leaving a small volume of buffer in the pipette tip.
- Set a timer for a 5 minute incubation.
Once the 5 minute incubation is complete, carefully load the remaining 200 µl of the prepared flow cell wash mix into the priming port, as follows:
- Using a P1000 pipette, take the remaining 200 µl of the flow cell wash mix
- Insert the pipette tip into the priming port, ensuring there are no bubbles in the tip
- Slowly twist the pipette wheel down to load the flow cell (if possible with your pipette) or push down the plunger very slowly, leaving a small volume of buffer in the pipette tip.
Close the priming port and wait for 1 hour.
IMPORTANTE
It is vital that the flow cell priming port and SpotON sample port are closed before removing the waste buffer to prevent air from being drawn across the sensor array area, which would lead to a significant loss of sequencing channels.
Remove the waste buffer, as follows:
- Ensure the priming port and SpotON sample port covers are closed, as indicated in the figure below.
- Insert a P1000 pipette into waste port 1 and remove the waste buffer.
Note: As both the priming port and SpotON sample port are closed, no fluid should leave the sensor array area.
IMPORTANTE
The buffers used in this process are incompatible with conducting a Flow Cell Check step prior to loading the subsequent library. However, number of available pores will be reported after the next pore scan.
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
IMPORTANTE
Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.
Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).
Para preparar la mezcla de cebado con seroalbúmina bovina, mezclar Flow Cell Flush (FCF) y Flow Cell Tether (FCT) como se indica a continuación. Mezclar con la pipeta a temperatura ambiente.
Nota: Hemos cambiando el formato de algunos de los viales de nuestros kits, de tubos monouso a botellas de mayor cantidad.
Formato en tubos monouso En el tubo de Flow Cell Flush (FCF), añadir directamente 5 µl de seroalbúmina bovina (BSA), a una concentración de 50 mg/ml y 30 µl de Flow Cell Tether (FCT).
Formato en botella: En un tubo proporcionado a la cantidad de celdas de flujo que se vayan a utilizar, mezclar los siguientes reactivos:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Flow Cell Flush (FCF) | 1 170 µl |
| Bovine Serum Albumin (BSA) a una concentración de 50 mg/ml | 5 µl |
| Flow Cell Tether (FCT) | 30 µl |
| Volumen total | 1 205 µl |
Para abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizar la tapa en el sentido de las agujas del reloj.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
After opening the priming port, check for a small air bubble under the cover. Draw back a small volume to remove any bubbles:
- Set a P1000 pipette to 200 µl.
- Insert the tip into the flow cell priming port.
- Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, or until you can see a small volume of buffer/liquid entering the pipette tip.
- Visually check that there is continuous buffer from the flow cell priming port across the sensor array.
Cargar 800 μl de mezcla de cebado en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación. (1)
IMPORTANTE
It is vital to wait five minutes between the priming mix flushes to ensure effective removal of the nuclease.
Close the priming port and wait five minutes.
During this time, prepare the library for loading by following the steps below.
Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).
IMPORTANTE
Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.
En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.
En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 37,5 µl |
| Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere | 25,5 µl |
| Biblioteca de ADN | 12 µl |
| Total | 75 µl |
IMPORTANTE
It is vital that the flow cell priming port and SpotON sample port are closed before removing the waste buffer to prevent air from being drawn across the sensor array area, which would lead to a significant loss of sequencing channels.
Remove the waste buffer, as follows:
- Ensure the priming port and SpotON sample port covers are closed, as indicated in the figure below.
- Insert a P1000 pipette into waste port 1 and remove the waste buffer.
Note: As both the priming port and SpotON sample port are closed, no fluid should leave the sensor array area.
Slide the flow cell priming port cover clockwise to open.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Slowly load 200 µl of the priming mix into the flow cell priming port, as follows:
- Ensure the priming port is open and gently lift open the SpotON sample port.
- Using a P1000 pipette, take 200 µl of the priming mix
- Insert the pipette tip into the priming port, ensuring there are no bubbles in the tip
- Slowly twist the pipette wheel down to load the flow cell (if possible with your pipette) or push down the plunger very slowly, as illustrated in the video above, leaving a small volume of buffer in the pipette tip.
IMPORTANTE
It is vital that the flow cell priming port and SpotON sample port are closed before removing the waste buffer to prevent air from being drawn across the sensor array area, which would lead to a significant loss of sequencing channels.
Remove the waste buffer, as follows:
- Close the priming port and SpotON sample port cover, as indicated in the figure below.
- Insert a P1000 pipette into waste port 1 and remove the waste buffer.
Note: As both the priming port and SpotON sample port are closed, no fluid should leave the sensor array area.
Slide open the priming port cover and gently lift open the SpotON sample port cover.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.
Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, instale la pantalla protectora justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos poner la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
FIN DEL PROCESO
Resume the sequencing run in MinKNOW to continue data acquisition.
11. Data acquisition and basecalling
How to start sequencing
Once you have loaded your flow cell, the sequencing run can be started on MinKNOW, our sequencing software that controls the device, data acquisition and real-time basecalling. For more detailed information on setting up and using MinKNOW, please see the MinKNOW protocol.
MinKNOW can be used and set up to sequence in multiple ways:
- On a computer either direcly or remotely connected to a sequencing device.
- Directly on a GridION, MinION Mk1C or PromethION 24/48 sequencing device.
For more information on using MinKNOW on a sequencing device, please see the device user manuals:
Open the MinKNOW software using the desktop shortcut and log into the MinKNOW software using your Community credentials.
Click on your connected device.
Set up a sequencing run by clicking Start sequencing.
Type in the experiment name, select the flow cell postition and enter sample ID. Choose FLO-MIN114 flow cell type from the drop-down menu.
Click Continue to kit selection.
Click the Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24).
Click Continue to Run Options to continue.
Keep the run options to their default settings of 72 hour run length and 200 bp minimum read length.
Minimum read length can be reduced down to 20 bp to increase output by sequencing more short reads, such as contaminanting reads including ITR tetramers. During development of this protocol, it was noted that despite the increase in short reads, a higher proportion of short reads were of lower Qscore (≤9).
Click Continue to basecalling to continue.
Set up basecalling and barcoding using the following parameters:
Ensure basecalling is ON.
Next to Models, click Edit options and choose the High accuracy basecaller (HAC) from the drop-down menu.
Ensure barcoding is ON and use the default settings.
A reference sequence may be uploaded to perform live alignment but this may slow down system processing.
Click Continue to output and continue.
Set up the output format and filtering as follows:
Raw reads is on and select .POD5 as the output format.
Ensure .FASTQ is selected for basecalled reads.
Filtering is on and use the default settings.
Click Continue to final review to continue.
Click Start to start sequencing.
You will be automatically navigated to the Sequencing Overview page to monitor the sequencing run.
Data analysis after sequencing
After sequencing has completed on MinKNOW, the flow cell can be reused or returned, as outlined in the Flow cell reuse and returns section.
After sequencing and basecalling, the data can be analysed, as outlined in the Downstream analysis section.
12. Flow cell reuse and returns
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.
Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.
IMPORTANTE
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
13. Downstream analysis
Post-basecalling analysis
We recommend performing downstream analysis using EPI2ME Labs which facilitates bioinformatic analyses by allowing users to run Nextflow workflows in a desktop application. EPI2ME Labs maintains a collection of bioinformatic workflows which are curated and actively maintained by experts in long-read sequence analysis.
Further information about the available EPI2ME Labs workflows are available here, along with the Quick Start Guide to start your first bioinformatic workflow.
For the mapping of AAV sequences for quality control and validation, we recommend using the wf-aav-qc workflow which requires Nextflow, Java, and Docker to be installed before running the workflow.
A run report will be produced and includes multiple plots to enable easy assessment of an AAV vector, including a contamination graph, truncations graph, transgene expression read coverage and genome type frequency graph.
Open the EPI2ME app using the desktop shortcut.
Navigate to the available workflows tab and click on the wf-aav-qc workflow to download and click install.
Navigate to the installed tab and click on wf-aav-qc.
Click "Run this workflow" to open the launch wizard.
Set up your run by uploading your data files including the FASTQ input and host reference in the "Input Options". Fill in the basecaller configuration used to basecall your data and the other parameters can be kept to their default settings.
Click "Launch workflow" in the top right corner.
Ensure all parameters options have green ticks.
Once the workflow finishes, a report will be produced.
14. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation for Kit 14
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) | El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI. |
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas. |
Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Escasa recuperación | Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. | 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza. |
| Escasa recuperación | Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado | Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar.  |
| Escasa recuperación tras la preparación de extremos | El paso de lavado utilizó etanol a <70 % | Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto. |
15. Issues during the sequencing run for Kit 14
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales. |
Pore occupancy below 40%
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Pore occupancy <40% | Not enough library was loaded on the flow cell | 10–20 fmol of good quality library can be loaded on to a MinION/GridION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol" |
| Pore occupancy close to 0 | The Native Barcoding Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation | Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters. |
| Pore occupancy close to 0 | No tether on the flow cell | Tethers are adding during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.  En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
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Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)  Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles. | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Reduction in sequencing speed and q-score later into the run
| Observation | Possible cause | Comments and actions |
|---|---|---|
| Reduction in sequencing speed and q-score later into the run | Fast fuel consumption is typically seen in Kit 9 chemistry (e.g. SQK-LSK109) when the flow cell is overloaded with library. Please see the appropriate protocol for your DNA library to find the recommendation. | Add more fuel to the flow cell by following the instructions in the MinKNOW protocol. In future experiments, load lower amounts of library to the flow cell. |
Fluctuación de la temperatura
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
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| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector están bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
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| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo de secuenciación para asegurarse de que se encuentra a temperatura ambiente y con buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ. |
Last updated: 4/23/2024
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