Library recovery from flow cells
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MinION: Protocol
Library recovery from flow cells V LIR_9178_v1_revJ_11Jan2023
- This protocol is for recovering DNA libraries from flow cells for continued sequencing
- Compatible with both MinION and PromethION flow cells, and all DNA sequencing kits
For Research Use Only
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introduction to the protocol
Transfer a library between flow cells
Clean up and transfer a library between flow cells
Recover a library to replace on a washed flow cell
Troubleshooting
Descripción general
- This protocol is for recovering DNA libraries from flow cells for continued sequencing
- Compatible with both MinION and PromethION flow cells, and all DNA sequencing kits
For Research Use Only
1. Overview of the protocol
Introduction to the protocol
This protocol outlines three methods for recovering a library for either transfer to a new flow cell or to wash the original flow cell for further sequencing of the recovered library. We recommend using these protocols to maximise sequencing output per sample or to provide additional support where a flow cell has failed mid-run.
A DNA library generated using any of our sequencing kits can be recovered and transferred for both MinION and PromethION Flow Cells. We recommend that a library can be recovered up to 2-3 times for successful sequencing on either a washed or a new flow cell.
Steps in the workflow:
Prepare for your experiment
You will need to:
- If using a new flow cell, check to ensure it has enough pores for a good sequencing run
- Ensure you have enough flow cell priming reagents, the correct equipment and third-party reagents
Method 1 Transfer a library between flow cells
You will need to:
- Stop sequencing on MinKNOW
- Prime the second flow cell
- Recover the library from the original flow cell
- Transfer to the new flow cell within two hours
- Start a new sequencing run on MinKNOW
Method 2 Clean up and transfer a library between flow cells
You will need to:
- Stop sequencing on MinKNOW
- Recover the library from the original flow cell
- SPRI clean the recovered library
- Store the library
- Prime the second flow cell
- Transfer to the new flow cell
- Start a new sequencing run on MinKNOW
Method 3 Recover a library to replace on a washed flow cell
You will need to:
- Pause sequencing on MinKNOW
- Recover the library from the original flow cell
- Flush the flow cell with flow cell Wash Mix
- Reprime the washed flow cell
- Reload the library onto the washed flow cell
- Resume the sequencing run on MinKNOW
Use cases for each method
Method 1: Transfer a library between flow cells
- For users wanting to continue generating data from the same library after a sequencing run has completed.
- If a flow cell has failed within a few hours of sequencing, the library can be recovered and loaded onto a new flow cell to continue sequencing.
Method 2: Clean up and transfer a library between flow cells
- For users wanting to continue generating data from the same library at a later date after a sequencing run has completed or if a second flow cell is not immediately available for transfer.
- If the flow cell was not prepared with the compatible flow cell reagents for the library chemistry, the library can be cleaned up and transferred to a flow cell primed with the correct buffers.
- For example, if a Kit 14 DNA library is loaded onto an R10.4.1 flow cell primed with Kit 9 flow cell priming reagents, the DNA library should be recovered, SPRI cleaned and loaded onto a flow cell primed with Kit 14 compatible reagents.
- If a flow cell has failed within a few hours of sequencing, the library can be recovered and loaded onto a new flow cell to continue sequencing at a later date.
Method 3: Recover a library to replace on a washed flow cell
- For users wanting to continue generating data from the same library on the same flow cell.
- In cases where channels are mostly in the unavailable state and there is limited library, the flow cell can be washed to remove the blocks and reloaded with the same library.
Recommendations
We recommend a library can be transferred a maximum of 2-3 times as with each recovery, a small amount of library is lost which may impact sequencing output and pore occupancy.
Highly viscous libraries, typically generated using the Ultra-Long DNA Sequencing Kit V14 (SQK-ULK114) are difficult to recover from the flow cell, leading to variable results. We recommend only transferring between PromethION flow cells, if required.
For the "Transfer a library between flow cells" method, we recommend transferring your library between flow cells immediately. Long term storage is not recommended following this method. The library can remain on the original flow cell in the device or stored in an Eppendorf DNA LoBind tube on ice for up to two hours, if required.
Longer term storage of a cleaned up library is only recommended when following the "Clean up and transfer a library between flow cells" method. The library can be stored at 4°C for short term storage or repeated use, for example, re-loading flow cells between washes.
We recommend avoiding transferring short fragment libraries (<2 kb) where possible as they are less efficiently transferred between flow cells which may negatively affect sequencing results.
IMPORTANTE
Compatibility of this protocol
This protocol is compatible with the following:
- All DNA sequencing kits
- All Flow Cell Priming Kit expansions
- All Sequencing Auxiliary Vials expansions
- SFB Expansion (EXP-SFB001)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004 and EXP-WSH004-XL)
- R9.4.1 and R10.4.1 flow cells (FLO-MIN106 and FLO-MIN114)
2. Equipment and consumables
Material
- Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP004)
- Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) or Flow Cell Wash Kit XL (EXP-WSH004-XL)
- SFB Expansion (EXP-SFB001)
Consumibles
- MinION Flow Cell (FLO-MIN106 or FLO-MIN114)
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
- Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pipeta y puntas P1000
- P200 pipette and tips
- Pipeta y puntas P20
- Cubeta con hielo
- Mezclador vórtex
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Microfuge
- Gradilla magnética
- Heating block
- Qubit fluorometer (or equivalent)
Check your MinION flow cell
We highly recommend that you check the number of pores in your flow cell prior to starting a sequencing experiment. This should be done within 12 weeks of purchasing for MinION flow cells. Oxford Nanopore Technologies will replace any flow cell with fewer than 800 pores when the result is reported within two days of performing the flow cell check, and when the storage recommendations have been followed. To do the flow cell check, please follow the instructions in the Flow Cell Check document.
IMPORTANTE
We recommend having the suitable DNA sequencing kit protocol available when completing this procedure to ensure the correct flow cell priming reagents and volumes are used.
Flow cell priming reagents
Ensure the compatible flow cell priming reagents are used for your libraries. These are required for all methods and are available with our sequencing kits. If extra reagents are required, they can be found in the following expansion kits.
For libraries prepared using Kit 14 chemistry, please ensure you are using the following reagents:
- Flow Cell Tether (FCT)
- Flow Cell Flush (FCF)
- For MinION flow cells only, we recommend using Bovine Serum Albumin (BSA)
Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP004) contents:
Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (μl) |
---|---|---|---|---|
Flow Cell Flush | FCF | 6 | Clear cap, light blue lable | 8,000 |
Flow Cell Tether | FCT | 1 | Purple | 200 |
For libraries prepared using Kit 9, 10 or 11 chemistry, please ensure you are using the following reagents:
- Flush Buffer (FB)
- Flush Tether (FLT)
Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002) contents:
Name | Acronym | Cap colour | No. of vial | Fill volume per vial (μl) |
---|---|---|---|---|
Flush Buffer | FB | Blue | 6 | 1,170 |
Flush Tether | FLT | Purple | 1 | 200 |
Short Fragment Buffer (SFB) and Elution Buffer (EB)
Short Fragment Buffer (SFB) and Elution Buffer (EB) are both required for the "Clean up and transfer a library between flow cells" method. Both reagents are found in our sequencing kits but extra reagents can be found in the below kits.
Short Fragment Buffer (SFB) is available in the SFB Expansion (EXP-SFB001).
SFB Expansion (EXP-SFB001) contents:
Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (μl) |
---|---|---|---|---|
Short Fragment Buffer | SFB | Grey | 4 | 1,800 |
Elution Buffer (EB) is available in the Sequencing Auxiliary Kit.
For libraries prepared using Kit 14 chemistry, please ensure you are using the following kit which also includes the flow cell priming reagents:
Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) contents:
Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (μl) |
---|---|---|---|---|
Elution Buffer | EB | Black | 2 | 500 |
Sequencing Buffer | SB | Red | 2 | 700 |
Library Solution | LIS | White cap, pink label | 2 | 600 |
Library Beads | LIB | Pink | 2 | 600 |
Flow Cell Flush | FCF | Light blue label | 2 | 8,000 |
Flow Cell Tether | FCT | Purple | 2 | 200 |
For libraries prepared using the Kit 10 or 11 chemistry, please use the following kit:
Sequencing Auxiliary Vials (EXP-AUX002) contents:
Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (μl) |
---|---|---|---|---|
Sequencing Buffer | SBII | Red | 4 | 500 |
Loading Solution | LS | Pink sticker on cap | 2 | 360 |
Elution Buffer | EB | Black | 2 | 200 |
Loading Beads | LBII | Pink | 2 | 360 |
For libraries prepared using Kit 9 chemistry, please use the following kit:
Sequencing Auxiliary Vials (EXP-AUX001) contents:
Name | Acronym | Cap colour | No. of vials | Fill volume per vial (μl) |
---|---|---|---|---|
Sequencing Buffer | SQB | Red | 6 | 300 |
Elution Buffer | EB | Black | 2 | 200 |
Loading Beads | LB | Pink | 2 | 360 |
AMPure XP Beads (AXP)
For the "Clean up and transfer a library between flow cells" method, AMPure XP Beads (AXP) are required. These are available in many of our kits where the DNA library undergoes a clean up step. However, if extra beads are required, we recommend purchasing more from Beckman Coulter, Inc. (A63880).
Flow Cell Wash Kit
The Flow Cell Wash Kit is required for the "Recover a library to replace on a washed flow cell" method.
Flow Cell Wash Kit contents (EXP-WSH004):
Contents | Volume (µl) | No. of tubes | No. of uses |
---|---|---|---|
Wash Mix (WMX) | 15 | 1 | 6 |
Wash Diluent (DIL) | 1,300 | 2 | 6 |
Storage Buffer (S) | 1,600 | 2 | 6 |
3. Transfer a library between MinION flow cells
Material
- For Kit 14 libraries, Flow Cell Flush (FCF) and Flow Cell Tether (FCT)
- For Kit 9, 10 and 11 libraries, Flush Buffer (FB) and Flush Tether (FLT)
Consumibles
- MinION Flow Cell (FLO-MIN106 or FLO-MIN114)
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
Preparation to transfer a library to a second flow cell
- This protocol assumes that the original flow cell has been loaded with a DNA library prepared in accordance with the suitable protocol.
- The aim is to prepare the second flow cell and recover the library from the original flow cell for immediate transfer.
- Data acquisition in MinKNOW should be stopped during the recovery and transfer procedure.
- After the second flow cell has been primed, the library can be recovered and immediately transferred to the second flow cell.
IMPORTANTE
We recommend keeping the light shield on the original flow cell when recovering the library.
The light shield should be installed on the second flow cell as soon as the library has been loaded for optimal sequencing output.
Stop the sequencing run for the original flow cell on MinKNOW by clicking 'Stop'.
Thaw and prepare the flow cell priming mix according to the "Priming and loading the SpotON flow cell" section of the suitable protocol.
Open the MinION or GridION device lid and slide the second flow cell under the clip. Press down firmly on the flow cell to ensure correct thermal and electrical contact.
Note: We recommend leaving the original flow cell in the device and inserting the second flow cell in a free position, where possible. If a free position is not available on the device:
- Remove the original flow cell and place in the tray the flow cell was delivered in. Ensure the flow cell remains as level as possible to prevent waste fluid leaking out of the waste port.
- Insert the second flow cell in the device for priming.
- Library recovery can be completed from the original flow cell in the plastic tray.
To prime the second flow cell, slide the priming port cover clockwise to open the priming port.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Load 800 µl of the priming mix into the second flow cell via the priming port, avoiding the introduction of air bubbles. Wait for five minutes.
Complete the flow cell priming for the second flow cell:
- Gently lift the SpotON sample port cover to make the SpotON sample port accessible.
- Load 200 µl of the priming mix into the flow cell via the priming port (not the SpotON sample port), avoiding the introduction of air bubbles.
To prepare the original flow cell for library recovery, slide open the priming port cover and lift open the SpotON sample port cover.
Set a pipette to 75 µl and fully depress the pipette before inserting the tip into the SpotON port of the original flow cell. Slowly aspirate to recover the DNA library from the flow cell.
Note: Insert the pipette tip to the point where it is touching the liquid in the flow cell. Do not insert the tip too far into the port as this will impact removal.
The recovered library may appear slightly yellow and not all the library loading beads (LB, LBII, LIB) will be fully recovered but this will not impact library recovery and transfer.
Add the recovered DNA library to the second flow cell via the SpotON sample port in a dropwise fashion. Ensure each drop flows into the port before adding the next.
Gently replace the SpotON sample port cover of the second flow cell, making sure the bung enters the SpotON port and close the priming port.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
The original flow cell can be flushed with deionised water and returned to Oxford Nanopore.
Instructions for returning flow cells can be found here.
Start a new sequencing run on MinKNOW for the second flow cell.
FIN DEL PROCESO
Using the suitable protocol for your DNA library, continue with the "Sequencing and data analysis" section to complete the experiment.
4. Clean up and transfer a library between MinION Flow Cells
Material
- For Kit 14 libraries, Flow Cell Flush (FCF), Flow Cell Tether (FCT), Library Solution (LIS), Library Beads (LIB), and Sequencing Beads (SB)
- For Kit 9, 10 and 11 libraries, Flush Buffer (FB), Flush Tether (FLT) Loading Beads/II (LB/LBII), Loading Solution (LS), and Sequencing Buffer/II (SQB/SBII),
- AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
- Elution Buffer (EB)
- Short Fragment Buffer (SFB)
Consumibles
- MinION Flow Cell (FLO-MIN106 or FLO-MIN114)
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
- Pipeta y puntas P1000
- P200 pipette and tips
- Mezclador vórtex
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Microfuge
- Gradilla magnética
- Heating block
- Qubit fluorometer (or equivalent)
Preparation to clean up a library before transfer to a second flow cell
- The aim is to recover and clean up your library before priming the second flow cell for loading the recovered library at a later date.
- The cleaned up library can be stored at 4°C for short term storage or repeated use, for example, re-loading flow cells between washes.
- Data acquisition in MinKNOW should be stopped during the recovery and transfer procedure.
IMPORTANTE
We recommend keeping the light shield on the original flow cell when recovering the library.
The light shield should be installed on the second flow cell as soon as the library has been loaded for optimal sequencing output.
Thaw the kit components at room temperature and prepare as indicated by the table below:
Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Mix well by vortexing | 3. Briefly spin down | 4. Keep on ice |
---|---|---|---|---|
AMPure XP Beads (AXP) | ✓ | ✓ | X | X Keep at room temperature |
Short Fragment Buffer (SFB) | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ |
Elution Buffer (EB) | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ |
AMPure XP Beads from an Oxford Nanopore sequencing kit require thawing as they are stored with the kit at -20°C.
Stop the sequencing run for the original flow cell on MinKNOW by clicking 'Stop'.
To prepare the original flow cell for library recovery, slide open the priming port cover and lift open the SpotON sample port cover.
Set a pipette to 75 µl and fully depress the pipette before inserting the tip into the SpotON port of the original flow cell. Slowly aspirate to recover the DNA library from the flow cell.
Note: Insert the pipette tip to the point where it is touching the liquid in the flow cell. Do not insert the tip too far into the port as this will impact removal.
The recovered library may appear slightly yellow and not all the library loading beads (LB, LBII, LIB) will be fully recovered but this will not impact library recovery and transfer.
Transfer the recovered library to a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube and store on ice.
The original flow cell can be removed from the MinION or GridION device by sliding the flow cell from under the clip.
The original flow cell can be flushed with deionised water and returned to Oxford Nanopore.
Instructions for returning flow cells can be found here.
Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.
Add 300 µl of resuspended AMPure XP Beads (AXP) to the recovered library and mix by flicking.
Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.
Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.
Wash the beads by adding 150 µl of Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.
Spin down and place the tube back on the magnet. Pipette off any residual supernatant.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 13 µl of Elution Buffer (EB).
Spin down and incubate for 10 minutes at room temperature. For high molecular weight DNA, incubating at 37°C can improve recovery of long fragments.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Remove and retain 13 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Dispose of the pelleted beads
CHECKPOINT
Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer. If the recovered library is below the detection level of the Qubit dsDNA HS Assay, we do not recommend continuing to load the flow cell.
Note: Library concentration of a recovered library will not be as high as the initial library, but the best results will be achieved by loading as close to the requirements as possible.
The library can be stored at 4°C.
Thaw and prepare the flow cell priming mix according to the "Priming and loading the SpotON flow cell" section of the suitable protocol.
Open the MinION or GridION device lid and slide the second flow cell under the clip. Press down firmly on the flow cell to ensure correct thermal and electrical contact.
To prime the second flow cell, slide the priming port cover clockwise to open the priming port.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Load 800 µl of the priming mix into the second flow cell via the priming port, avoiding the introduction of air bubbles. Wait for five minutes.
Thoroughly mix the contents of the Library Beads/Loading Beads by pipetting.
IMPORTANTE
The Library Beads/Loading Beads tube contains a suspension of beads. These beads settle very quickly. It is vital that they are mixed immediately before use.
In a new tube, prepare the recovered library for loading according to the "Priming and loading the SpotON flow cell" section of the suitable protocol to ensure you are using the correct reagents and volumes.
For Kit 14 chemistry:
Reagent | Volume per flow cell |
---|---|
Sequencing Buffer (SB) | 37.5 µl |
Library Beads (LIB) mixed immediately before use, or Library Solution (LIS), if using | 25.5 µl |
Recovered DNA library | 12 µl |
Total | 75 µl |
Complete the flow cell priming for the second flow cell:
- Gently lift the SpotON sample port cover to make the SpotON sample port accessible.
- Load 200 µl of the priming mix into the flow cell via the priming port (not the SpotON sample port), avoiding the introduction of air bubbles.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Add the recovered DNA library to the second flow cell via the SpotON sample port in a dropwise fashion. Ensure each drop flows into the port before adding the next.
Gently replace the SpotON sample port cover of the second flow cell, making sure the bung enters the SpotON port and close the priming port.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
Start a new sequencing run on MinKNOW for the second flow cell.
FIN DEL PROCESO
Using the suitable protocol for your DNA library, continue with the "Sequencing and data analysis" section to complete the experiment.
5. Recover a library to replace on a washed MinION flow cell
Material
- For Kit 14 libraries, Flow Cell Flush (FCF) and Flow Cell Tether (FCT)
- For Kit 9, 10 and 11 libraries, Flush Buffer (FB) and Flush Tether (FLT)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
Consumibles
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- P1000 pipette and tips
- Pipeta y puntas P200
- Mezclador vórtex
- Microfuge
- Cubeta con hielo
Preparation to recover and wash a library to replace on the same flow cell
- This protocol assumes that the original flow cell has been loaded with a DNA library prepared in accordance with the suitable protocol.
- The aim is to recover the library and wash the flow cell to reload the recovered library.
- Data acquisition in MinKNOW can be paused during the procedure.
IMPORTANTE
We recommend keeping the light shield on the flow cell during library recovery, washing and reloading for optimal sequencing output.
Pause the sequencing run for the original flow cell on MinKNOW by clicking 'Pause'.
Place the tube of Wash Mix (WMX) on ice. Do not vortex the tube.
Thaw one tube of Wash Diluent (DIL) at room temperature and mix the contents of Wash Diluent (DIL) thoroughly by vortexing. Then spin down briefly and place on ice.
To prepare the original flow cell for library recovery, slide open the priming port cover.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
After opening the priming port, check for a small air bubble under the cover. Draw back a small volume to remove any bubbles:
- Set a P1000 pipette to 200 µl.
- Insert the tip into the flow cell priming port.
- Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, or until you can see a small volume of buffer/liquid entering the pipette tip.
- Visually check that there is continuous buffer from the flow cell priming port across the sensor array.
IMPORTANTE
Be aware that the library is removed from the priming port as a larger volume and expect to see the fluid in the waste channel to move back.
Set a pipette to 150 µl and fully depress the pipette before inserting the tip into the priming port of the original flow cell. Slowly aspirate to recover the DNA library from the flow cell.
Note: The recovered library may appear slightly yellow and not all the library loading beads (LB, LBII, LIB) will be fully recovered but this will not impact library recovery and transfer.
Transfer the recovered library to a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube and store on ice.
In a fresh 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare the following Flow Cell Wash Mix:
Reagent | Volume per flow cell |
---|---|
Wash Mix (WMX) | 2 μl |
Wash Diluent (DIL) | 398 μl |
Total | 400 μl |
Mix well by pipetting, and place on ice. Do not vortex the tube.
IMPORTANTE
It is vital that the flow cell priming port and SpotON sample port are closed before removing the waste buffer to prevent air from being drawn across the sensor array area, which would lead to a significant loss of sequencing channels.
Remove the waste buffer, as follows:
- Close the priming port and SpotON sample port cover, as indicated in the figure below.
- Insert a P1000 pipette into waste port 1 and remove the waste buffer.
Note: As both the priming port and SpotON sample port are closed, no fluid should leave the sensor array area.
Rotate the flow cell priming port cover clockwise so that the priming port is visible.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
After opening the priming port, check for a small air bubble under the cover. Draw back a small volume to remove any bubbles:
- Set a P1000 pipette to 200 µl.
- Insert the tip into the flow cell priming port.
- Turn the wheel until the dial shows 220-230 µl, or until you can see a small volume of buffer/liquid entering the pipette tip.
- Visually check that there is continuous buffer from the flow cell priming port across the sensor array.
Slowly load 200 µl of the prepared flow cell wash mix into the priming port, as follows:
- Using a P1000 pipette, take 200 µl of the flow cell wash mix
- Insert the pipette tip into the priming port, ensuring there are no bubbles in the tip
- Slowly twist the pipette wheel down to load the flow cell (if possible with your pipette) or push down the plunger very slowly, leaving a small volume of buffer in the pipette tip.
- Set a timer for a 5 minute incubation.
Once the 5 minute incubation is complete, carefully load the remaining 200 µl of the prepared flow cell wash mix into the priming port, as follows:
- Using a P1000 pipette, take the remaining 200 µl of the flow cell wash mix
- Insert the pipette tip into the priming port, ensuring there are no bubbles in the tip
- Slowly twist the pipette wheel down to load the flow cell (if possible with your pipette) or push down the plunger very slowly, leaving a small volume of buffer in the pipette tip.
Close the priming port and wait for 1 hour.
IMPORTANTE
It is vital that the flow cell priming port and SpotON sample port are closed before removing the waste buffer to prevent air from being drawn across the sensor array area, which would lead to a significant loss of sequencing channels.
Remove the waste buffer, as follows:
- Close the priming port and SpotON sample port cover, as indicated in the figure below.
- Insert a P1000 pipette into waste port 1 and remove the waste buffer.
Note: As both the priming port and SpotON sample port are closed, no fluid should leave the sensor array area.
Thaw and prepare the flow cell priming mix according to the "Priming and loading the SpotON flow cell" section of the suitable protocol.
Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Load 800 µl of the priming mix into the flow cell via the priming port, avoiding the introduction of air bubbles. Wait for five minutes.
Complete the flow cell priming:
- Gently lift the SpotON sample port cover to make the SpotON sample port accessible.
- Load 200 µl of the priming mix into the flow cell via the priming port (not the SpotON sample port), avoiding the introduction of air bubbles.
Bring the recovered library up to room temperature and load 150 µl to the flow cell via the SpotON port in a dropwise fashion. Ensure each drop flows into the port before adding the next.
Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.
IMPORTANTE
If the light shield was removed during the washing step, the light shield should be replaced on the flow cell as soon as library is loaded for optimal sequencing output.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
Restart the sequencing run on MinKNOW.
FIN DEL PROCESO
Using the suitable protocol for your DNA library, continue with the "Sequencing and data analysis" section to complete the experiment.
6. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
---|---|---|
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) | El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI. |
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. |
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas. |
Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure
Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
---|---|---|
Escasa recuperación | Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. | 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza. |
Escasa recuperación | Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado | Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. |
Escasa recuperación tras la preparación de extremos | El paso de lavado utilizó etanol a <70 % | Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto. |
7. Problemas durante el experimento de secuenciación
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo
Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
---|---|---|
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
---|---|---|
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales. |
Ocupación de poro por debajo del 40 %
Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
---|---|---|
Ocupación de poro <40 % | No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo | Procure cargar la biblioteca al volumen y la concentración adecuados, tal como se indica en el protocolo correspondiente. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular fmoles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, (opción "dsDNA: μg to fmol"). |
Ocupación de poro próxima a 0 | Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN | En la fase de ligación del adaptador, utilice NEBNext Quick Ligation Module (E6056) y el tampón Ligation Buffer (LNB) de Oxford Nanopore Technologies, suministrado en el kit de secuenciación. Recuerde añadir la cantidad correcta de cada reactivo. Prepare una biblioteca de control con lambda para valorar la integridad de los reactivos de otros fabricantes. |
Ocupación de poro próxima a 0 | Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y en la fase de lavado, después de la ligación del adaptador, se utilizó etanol en lugar de Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB). | El etanol puede desnaturalizar la proteína motor en los adaptadores de secuenciación. Usar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) después de la ligación de los adaptadores. |
Ocupación de poro próxima a 0 | No hay anclaje en la celda de flujo | Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (Flush Tether (FLT) para los kits 9, 10 y 11, y Flow Cell Tether (FCT) para el kit 14). Asegurarse de añadir un anclaje —Flush Tether (FLT) o Flow Cell Tether (FCT)— al tampón antes del cebado; el tampón utilizado es Flush Buffer (FB) para los kits 9, 10 y 11 y Flow cell Flush (FCF) para el Kit 14. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
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Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado. 3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
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Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros) Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles. | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos
Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
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Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Fluctuación de la temperatura
Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
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Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
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MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace. |