DNA 超长片段测序试剂盒 V14（SQK-ULK114） (ULK_9177_v114_revP_11Dec2024)
MinION: Protocol
DNA 超长片段测序试剂盒 V14（SQK-ULK114） V ULK_9177_v114_revP_11Dec2024
- 提取超高分子量 (uHMW) 基因组 DNA
- 稳定产出 N50 大于 50 kb 的超长读长
- 高产出
- 兼容 R10.4.1 测序芯片
仅供研究使用
本品为早期试用产品 如需有关早期试用计划的更多信息，请参阅本文了解产品的不同发布阶段。
FOR RESEARCH USE ONLY
概览
- 提取超高分子量 (uHMW) 基因组 DNA
- 稳定产出 N50 大于 50 kb 的超长读长
- 高产出
- 兼容 R10.4.1 测序芯片
仅供研究使用
本品为早期试用产品 如需有关早期试用计划的更多信息，请参阅本文了解产品的不同发布阶段。
1. 实验方案概览
本品为早期试用产品
如需有关早期试用计划的更多信息，请参阅本文了解产品的不同发布阶段。
因此，请确保您始终使用本方案的最新版本。
DNA 超长片段测序试剂盒（SQK-ULK114）简介
本实验指南详细描述了超高分子量（uHMW）基因组DNA（gDNA）测序的完整工作流程：从提取冷冻组织内、或由全血纯化的细胞中的基因组DNA开始，到使用DNA超长片段测序试剂盒(SQK-ULK001)对超高分子量 gDNA 进行测序。该指南亦包含从全血中分离白细胞（WBC）的操作流程及由Paul A ‘Giron’ Koetsier 和 Eric J Cantor于2021年开发的 gDNA 的定量方法。
在本实验指南的开发过程中，我们使用了NEB Monarch® 高分子量组织 DNA 提取试剂盒（目录号 T3060）提取上述两种起始材料中的超高分子量基因组 DNA。此外，用户还可选择其他适用于血液或细胞 gDNA 提取的 NEB 试剂盒，但需注意，Oxford Nanopore Technologies 未对其进行验证。
为提高数据产出，一次反应所制备的文库量可满足在一张测序芯片上进行多次连续上样测序，但每两次测序间，须清洗 MinION/GridION 芯片以恢复通道状态。
测序工作流程： 准备您的实验
您将需要：
- 如使用全血，则需分离白细胞；如使用冷冻组织，则需从组织中分离细胞
- 提取超高分子量基因组DNA
- 为样本定量
- 确保您已准备好测序试剂盒、正确的仪器以及第三方试剂
- 下载数据采集和分析软件
- 检查您的测序芯片上有足够多的活性纳米孔，以确保测序良好运行
文库制备
您将需要：
- 使用稀释后的片段化反应试剂酶切DNA样本
- 将快速文库接头连接到DNA的5'端
- 通过 DNA 沉淀纯化样本，并洗脱过夜
- 对测序芯片进行预处理，并将DNA文库加载至芯片
测序和分析
您将需要：
- 使用 MinKNOW 软件开始测序。该软件会通过测序仪收集原始数据，并将其识别成碱基序列。
- 使用 EPI2ME 软件，并选择所需工作流程以便进一步分析（此步骤非必须）。
测序芯片上样及冲洗
使用 DNA 超长片段测序试剂盒（SQK-ULK114）所得 DNA 黏度较高，可能会影响芯片加样。为此，我们改进了上样步骤。请按照后文中的步骤仔细操作，以免损坏测序芯片。
为提高数据产量，我们建议每个超长DNA文库在同一张芯片上测序三次。在每两次测序间，请务必使用测序芯片清洗试剂盒（EXP-WSH004）清洗芯片，以恢复通道状态。如在清洗芯片后需立即上样，请按照本实验指南中的改进方法操作：将超长 DNA 文库再次上样至 MinION / GridION 测序芯片.
超高分子量基因组 DNA 的最佳操作方法
为确保样本充分混匀，并最大限度避免打断长序列片段，我们建议用户使用宽口枪头吹打全部体积的样本。
混匀手法越轻柔缓慢，越不会破坏长片段 DNA。用户也可选择低速涡旋混匀，但会打断长片段 DNA。
请勿以混合不充分为代价，保全 DNA 片段长度。试剂与 DNA 混合不充分将导致读长和产出降低。
更多相关信息，请参阅疑难解答部分。
实验方案适用性
本实验方案只适用于与以下产品搭配使用：
- DNA 超长片段测序试剂盒（SQK-ULK114）
- 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）
- R10.4.1 测序芯片（FLO-MIN114）
- EEB 扩展包（EXP-EEB001）
- 超长片段辅助扩展包（EXP-ULA001）
- MinION Mk1B - MinION Mk1B IT 配置要求文档
- MinION Mk1C - MinION Mk1C IT 配置要求文档
- MinION Mk1D - MinION Mk1D IT 配置要求文档
- GridION - GridION IT 配置要求文档
2. 实验器材及耗材
材料
- DNA 超长片段测序试剂盒（SQK-ULK114）
- Monarch® 高分子量组织 DNA 提取试剂盒（New England Biolabs，T3060）
- 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）
耗材
- MinION及GridION测序芯片
- 异丙醇，100%（Fisher, 10723124）
- 乙醇，100%（例如 Fisher, 16606002）
- Qubit dsDNA BR Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher ，Q32850）
- Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
- （非必需）牛血清白蛋白（BSA）（50 mg/mL）（例如 Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/mL， AM2616）
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- 2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- 5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- 15 ml Falcon离心管
仪器
- MinION 或 GridION 测序仪
- MinION 及GridION 测序芯片遮光片
- 热循环仪或恒温加热仪
- 设定为 56°C，适配 1.5 ml、2 ml 和 5 ml 离心管的恒温混匀仪
- 涡旋混匀仪
- 迷你离心机
- 宽口移液枪头
- P1000 移液枪和枪头
- P200 移液枪和枪头
- Qubit荧光计 （或用于质控检测的等效仪器）
- 盛有冰的冰桶
- 计时器
上述所列材料、耗材和设备适用于本指南中的文库制备步骤。根据样本类型的不同，样本处理及 DNA 提取步骤需要额外试剂，详情请见本指南中的“样本制备”部分。
在使用本指南制备文库前，您需备好从六百万个细胞中提取的、溶于40 μl PBS 的基因组DNA。
本实验指南基于NEB Monarch® 高分子量组织DNA提取试剂盒（目录号 T3060）编写。此外，用户还可选择其他适用于血液或细胞 gDNA 提取的 NEB 试剂盒，但需注意，Oxford Nanopore Technologies 未对其进行验证。
本指南所述实验方法已在下述起始材料上获得验证：
- 使用红细胞裂解液（QIAGEN，目录号158904）从1.6 ml（牛）血液中分离出的六百万个白细胞；
- 使用 pluriSelect 细胞过滤装置从 1 g 冷冻组织中分离出的六百万个细胞。
测序芯片质检
我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到 MinION/GridION/PremethION 测序芯片12周内进行，或者在您收到 Flongle 测序芯片四周内进行。Oxford Nanopore Technologies 会对活性孔数量少于以下标准的芯片进行替换*：请您按照测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。
| 测序芯片 | 芯片上的活性孔数确保不少于 |
|---|---|
| Flongle 测序芯片 | 50 |
| MinION/GridION 测序芯片 | 800 |
| PromethION 测序芯片 | 5000 |
*（请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于 Oxford Nanopore Technologies 推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两日内递交给我们。）
DNA 超长片段测序试剂盒（SQK-ULK114）内容物
我们此前发现 SQK-ULK114 试剂盒中的沉淀星（PS）存在问题，并已将其从操作方法中移除，以规避潜在风险。
经过生产工艺优化和内部验证，沉淀星（PS）现已改进，并重新纳入 SQK-ULK114 试剂盒中。
包含改进版可用沉淀星的试剂盒形式：
ULK114.30.0001 及更高批次
| 名称 | 缩写 | 管盖颜色 | 管数 | 溶液体积（μl） |
|---|---|---|---|---|
| 快速测序文库接头 | RA | 绿色 | 1 | 40 |
| 片段化反应试剂 | FRA | 琥珀色 | 1 | 50 |
| FRA 稀释缓冲液 | FDB | 透明 | 1 | 1,600 |
| 洗脱缓冲液 | EB | 黑色 | 2 | 1,500 |
| 提取洗脱缓冲液 | EEB | 橙色 | 3 | 1,700 |
| 测序缓冲液 UL | SBU | 红色 | 2 | 1,000 |
| 上样溶液 UL | LSU | 白色管盖，粉色标签 | 1 | 200 |
| 冲洗系绳 UL | FTU | 紫色 | 1 | 600 |
| 测序芯片冲洗液 | FCF | 蓝色 | 2 | 15,500 |
| 沉淀缓冲液 | PTB | 蓝色 | 2 | 1,700 |
| 沉淀星 | PS | 黄色 | 6 | 1 颗 |
不应使用沉淀星的试剂盒形式：
ULK114.20.xxxx 或更早批次:
| 名称 | 缩写 | 管盖颜色 | 管数 | 溶液体积（μl） |
|---|---|---|---|---|
| 快速测序文库接头 | RA | 绿色 | 1 | 40 |
| 片段化反应试剂 | FRA | 琥珀色 | 1 | 50 |
| FRA 稀释缓冲液 | FDB | 透明 | 1 | 1,600 |
| 洗脱缓冲液 | EB | 黑色 | 2 | 1,500 |
| 提取洗脱缓冲液 | EEB | 橙色 | 3 | 1,700 |
| 测序缓冲液 UL | SBU | 红色 | 2 | 1,000 |
| 上样溶液 UL | LSU | 白色管盖，粉色标签 | 1 | 200 |
| 冲洗系绳 UL | FTU | 紫色 | 1 | 600 |
| 测序芯片冲洗液 | FCF | 蓝色 | 2 | 15,500 |
| 沉淀缓冲液 | PTB | 蓝色 | 2 | 1,700 |
| 沉淀星 | PS | 黄色 | 6 | 1 颗 |
测序芯片清洗试剂盒(EXP-WSH004)内容物
| 名称 | 体积（µl） | 管数 | 可使用次数 |
|---|---|---|---|
| 清洗混合液（WMX） | 15 | 1 | 6 |
| 清洗稀释液（DIL）) | 1,300 | 2 | 6 |
| 储存缓冲液（S） | 1,600 | 2 | 6 |
- 清洗混合液（WMX）中含有核酸酶I；
- 清洗稀释液（DIL）中的核酸外切酶缓冲液可维持核酸酶I的最大活性；
- 储存缓冲液可用于测序芯片的长期保存。
为充分利用 DNA 超长片段测序试剂盒 V14，我们推出了 EEB 扩展包（EXP-EEB001）和超长片段辅助扩展包（EXP-ULA001）。
两款扩展包提供额外的建库和测序芯片预处理试剂，帮助用户最大限度使用 DNA 超长片段测序试剂盒 V14。
EEB 扩展包（EXP-EEB001）可支持不少于 6 次的标准提取洗脱操作。
超长片段辅助扩展包（EXP-ULA001）可支持在 MinION 或 PromethION 测序芯片上额外进行多达 12 次文库上样。
EEB 扩展包（EXP-EEB001）内容物：
| 名称 | 缩写 | 管盖颜色 | 管数 | 溶液体积（μl） |
|---|---|---|---|---|
| 提取洗脱缓冲液 | EEB | 白色 | 1 | 6,000 |
超长片段辅助扩展包（EXP-ULA001）内容物：
| 名称 | 缩写 | 管盖颜色 | 管数 | 溶液体积（μl） |
|---|---|---|---|---|
| 洗脱缓冲液 | EB | 黑色 | 1 | 1,500 |
| 测序缓冲液 UL | SBU | 红色 | 2 | 1,000 |
| 上样溶液 UL | LSU | 白色管盖，粉色标签 | 1 | 200 |
| 冲洗系绳 UL | FTU | 紫色 | 1 | 600 |
| 测序芯片冲洗液 | FCF | 透明管盖，浅蓝色标签 | 1 | 15,500 |
3. 从全血中分离白细胞（WBC）
材料
- 1.6 ml 全血
耗材
- 红细胞裂解液（QIAGEN，158904）
- 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS），pH 7.4（ThermoFisher，10010023）
- 15 ml Falcon离心管
仪器
- 迷你离心机
- P1000 移液枪和枪头
- P200 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
用于超长片段 DNA 测序的白细胞样本制备
在超长片段 DNA 测序实验中，需从 1.6 ml 全血中分离约 600 万个白细胞作为起始材料。
您可根据所用全血样本的具体情况，选用任何适宜的方法分离白细胞。 如已成功分离出 600 万个细胞，用户可直接从“提取超高分子量gDNA”一节开始。
在15ml Falcon 离心管中，向 1.6ml 全血中加入 4.8ml 红细胞裂解液。
轻轻颠倒离心管 10 次以混匀。
室温下孵育 5 分钟，并在孵育期间轻轻颠倒离心管两次。
于4℃下以 2000 x g 离心两分钟以沉淀白细胞。
倒出上清液并丢弃。离心管中将残留约 200 μl 上清液。
轻弹离心管以重悬细胞于残留的上清液中。
使用1X PBS 将体积补足至1.6 ml。
重复步骤 1-7 两次，总共完成 3 次洗涤。
如仍有红色残留，请重复上述清洗步骤，直至细胞沉淀呈白色。
在最后一次离心结束后，倒出所有上清液，并吸掉任何残余液体。
将细胞沉淀重悬于40μl 1X PBS 中，所得悬液中应含约 600 万个细胞。
重悬的细胞沉淀将用于“提取超高分子量gDNA”步骤。
4. 制备用于gDNA 提取的组织样本
材料
- 细胞悬浮缓冲液 (CSB)：0.35 M 蔗糖、100 mM EDTA、50 mM Tris.HCl pH 8
- 冷冻组织样本
耗材
- 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS），pH 7.4（ThermoFisher，10010023）
- 1 M Tris-HCl pH 8.0（Thermo Scientific, 15893661）
- 0.5 M EDTA，pH 8（Thermo Scientific, R1021）
- 2.5 M 蔗糖溶液
- 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
- 50 ml Falcon 离心管
- 5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
- 适用于 5 ml Eppendorf 管的离心机（Eppendorf 离心机 5804/5804 R 或等效设备）
- 适用于5ml Eppendorf 离心管的 Eppendorf 管架
- 解剖刀
- TissueRuptor II 手持式匀浆器（QIAGEN，9002755）
- TissueRuptor 一次性研磨杵（QIAGEN，990890）
- 可用于细胞核定量的荧光显微镜（Logos CELENA S 数码成像系统或等效仪器）
- 恒温加热仪，并配备有适合 5 ml Eppendorf 管的加热模块
- 200 μm PluriStrainer® 细胞过滤器（pluriSelect, 43-50200-03）
- 100 μm PluriStrainer® 细胞过滤器（pluriSelect, 43-50100-51）
- 50 μm PluriStrainer® 细胞过滤器（pluriSelect, 43-50050-03）
- 30 μm PluriStrainer® 细胞过滤器（pluriSelect, 43-50030-03）
- PluriStrainer® 连接环 （pluriSelect, 41-50000-03）
- PluriStrainer® 漏斗 （pluriSelect, 42-50000）
- P1000 移液枪和枪头
- 10 ml 注射器
依照下表制备细胞悬浮缓冲液（CSB）：
| 试剂 | 储备液浓度 | 终浓度 | 体积 |
|---|---|---|---|
| Tris.HCl, pH 8 | 1 M | 0.05 M | 50 ml |
| EDTA | 0.5 M | 0.1 M | 200 ml |
| 蔗糖溶液 | 2.5 M | 0.35 M | 140 ml |
| 无核酸酶水 | - | - | 610 ml |
| 总体积 | - | - | 1000 ml |
将 1 g 冷冻组织样本放入称重皿内。
用解剖刀将组织样本先切成细条，然后切成小块。
转移切块的组织样本至一洁净的 50 ml Falcon 管中。
向 50ml Falcon 管内再加入 10 ml 细胞悬浮缓冲液（CSB）。
使用 QIAGEN TissueRuptor 轻轻研磨组织样本。
1.插入研磨杵，以最低脉冲速度研磨一秒钟，在每次脉冲之间搅拌匀浆。
2.重复上述步骤五次。
研磨力度以能轻柔地打碎组织为宜。力量过大会损伤细胞核，并加大定量难度。完成上述步骤后，如管内仍残留有完整组织块，将于后续步骤中对其进行处理。
根据制造商的说明，将 200 μm 过滤器、连接环、漏斗和 50 ml Falcon 管组装成 pluriStrainer 过滤装置。
使用上一步骤中组装的 200 μm pluriStrainer® 过滤装置过滤全部组织样本匀浆。
过滤过程中，可轻搅匀浆，并使用注射器向过滤装置施加少量负压，以帮助匀浆通过。
根据制造商的说明拆卸 pluriStrainer® 装置，将盛有经过滤匀浆的 50 ml Falcon 管放置一边备用。
对未能通过 pluriStrainer® 滤网的完整组织再次进行研磨：
1.倒转过滤器，轻敲滤网，以将未通过 200 µm pluriStrainer® 滤网的完整组织转移至一支洁净的 50 ml Falcon 管中。
小贴士： 您可借助刮勺移除附着在滤网上的完整组织。
2.向 50 ml Falcon 管内加入 10ml 细胞悬浮缓冲液（CSB）。
另重复步骤 6–10 两次，即共进行三轮组织匀浆。
将 50 ml Falcon 管内的研磨物与步骤 10 中获得的原始过滤匀浆合并。
对合并后、经 200 μm 滤网过滤的研磨物做如下处理：
使用 100 μm pluriStrainer® 过滤已经过 200 μm 滤网过滤的匀浆：
1.根据制造商的说明，将 100 μm 过滤器、连接环、漏斗和 50 ml Falcon 管组装成 pluriStrainer 过滤装置。
2.使用上一步骤中组装的 100 μm pluriStrainer® 过滤装置过滤已经过 200 μm 滤网过滤的匀浆。 小贴士： 过滤过程中，可轻搅匀浆，并使用注射器向过滤装置施加少量负压，以帮助匀浆通过。
3.根据制造商的说明拆卸 pluriStrainer® 装置，将装有经 100 μm 滤网过滤后匀浆的 50 ml Falcon 管放置一边备用。
使用 50 μm pluriStrainer® 过滤已经过 100 μm 滤网过滤的匀浆：
1.根据制造商的说明，将 50 μm 过滤器、连接环、漏斗和 50 ml Falcon 管组装成 pluriStrainer 过滤装置。
2.使用上一步骤中组装的 50 μm pluriStrainer® 过滤装置过滤已经过 100 μm 滤网过滤的匀浆。 小贴士： 过滤过程中，可轻搅匀浆，并使用注射器向过滤装置施加少量负压，以帮助匀浆通过。
3.根据制造商的说明拆卸 pluriStrainer® 装置，将装有经 50 μm 滤网过滤后匀浆的 50 ml Falcon 管放置一边备用。
使用 30 μm pluriStrainer® 过滤已经过 50 μm 滤网过滤的匀浆：
1.根据制造商的说明，将30 μm 过滤器、连接环、漏斗和 50 ml Falcon 管组装成 pluriStrainer 过滤装置。
2.使用上一步骤中组装的 30 μm pluriStrainer® 过滤装置过滤已经过 50 μm 滤网过滤的匀浆。 小贴士： 过滤过程中，可轻搅匀浆，并使用注射器向过滤装置施加少量负压，以帮助匀浆通过。
3.根据制造商的说明拆卸 pluriStrainer® 装置，将装有经 30 μm 滤网过滤后匀浆的 50 ml Falcon 管放置一边备用。
使用荧光显微镜和适合的细胞核染色试剂测定纯化后匀浆中的细胞核浓度。
取出与 600 万个细胞核等体积的匀浆，将其加入 5 ml Eppendorf DNA LoBind 管中。
将 5 ml Eppendorf 管以 16,000 x g 离心 5 分钟以沉淀细胞核/细胞。
吸出并丢弃所有上清液，注意不要扰动沉淀。
将 40 μl PBS 加入此 5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管中。
反复弹动离心管以充分混匀。请确保细胞核/细胞悬浮液中的沉淀已重悬散开，没有结块。
请注意：为确保沉淀彻底重悬且无结块残留，您可能需要用力充分弹动离心管。
所得细胞核/细胞悬浮液将用于“提取超高分子量gDNA”一节。
5. 提取超高分子量 gDNA
材料
- 六百万个从冷冻组织中分离出的细胞/细胞核 或从全血中分离出的白细胞
- 提取洗脱缓冲液（EEB）
- Monarch® 高分子量组织 DNA 提取试剂盒（New England Biolabs，T3060）
耗材
- 5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS），pH 7.4（ThermoFisher，10010023）
- 异丙醇，100%（Fisher, 10723124）
- 乙醇，100%（例如 Fisher, 16606002）
- 2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
- 温度设定为56℃的恒温加热仪
- 设定为 56°C，适配 1.5 ml、2 ml 和 5 ml 离心管的恒温混匀仪
- Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
- 迷你离心机
- P1000 移液枪和宽口枪头
- P1000 移液枪和枪头
- P200 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
- Eppendorf 5424 离心机（或等效器材）
本方法不使用 Monarch® 高分子量组织 DNA 提取试剂盒中提供的 Monarch 洗脱缓冲液 II。
本方法采用 Oxford Nanopore 测序试剂盒提供的提取洗脱缓冲液（EEB）。
请按照试剂盒说明向 Monarch gDNA 洗涤缓冲液中加入乙醇。
将提取洗脱缓冲液（EEB）于室温下解冻，涡旋振荡混匀后置于冰上。
向一支新的 5 ml 离心管内加入六百万个重悬于 40 μl PBS 的细胞。细胞可根据上述方法分离获得，来源包括血液中的白细胞、细胞培养物或组织。
轻柔地充分重悬细胞，以确保细胞裂解完全并避免后续步骤中样本不均一。
另取一支 2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管内，混合以下试剂：
| 试剂 | 体积 |
|---|---|
| Monarch 高分子量 gDNA 组织裂解缓冲液 | 1,800 µl |
| 蛋白酶 K | 60 µl |
| 总体积 | 1860 µl |
向重悬的细胞中加入 1.8 ml Monarch 高分子量 gDNA 组织裂解缓冲液与蛋白酶 K 的预混液。
使用 1 ml 宽口移液枪缓慢吹打五次混匀。
使用细胞系时，可省略以下孵育步骤。
56℃ 下孵育 10 分钟。
使用常规枪头加入 15 µl Monarch RNase A。
使用 1 ml 宽口移液枪头缓慢吹打五次，轻柔混匀。
将反应体系置于恒温混匀仪中，以 650 rpm 在 56°C 下孵育 10 分钟。
我们发现，当起始材料是体外培养的细胞系时，蛋白分离步骤可省略。如使用细胞系，请直接跳至第 13 步。
使用常规移液枪头，向反应中加入 900 μl Monarch 蛋白质分离溶液（Protein Separation Solution）并使用 Hula 混匀仪（低速旋转式混匀仪）以 3 rpm 的速度旋转混合10分钟。
在 4℃ 下以 16,000 x g 离心 10 分钟，分离 DNA 与蛋白质。
DNA 将存在于上层水相中，而蛋白质和其它污染物将存在于下层有机相中。
使用宽口移液枪头，小心吸出含有 DNA 的上层水相，不要扰动下层有机相，并将其转移至一支新的 5 ml 离心管中。
上层水相中的 DNA 应该非常粘稠，应该只能由宽口枪头吸出。
如果含有蛋白的下层有机相被搅动，您可在 4℃ 下以 16,000 x g 再次离心 10 分钟。
将三颗用于 DNA 捕获的 Monarch DNA 捕获珠加入含 DNA 的液相中（如直接从步骤 9 开始，则加入至裂解反应体系中）。
请注意： ：加入的第一颗 DNA 捕获珠在后续步骤中会被舍弃，一直滞留在管底。
向离心管中加入 2.5 ml 异丙醇，使用 Hula 混匀仪（低速旋转式混匀仪）以 3 rpm 的速度旋转混合 20 分钟。确保 DNA 已充分沉淀并缠绕在玻璃珠周围。
您可通过查看 DNA 捕获珠周围是否有黏性物质缠绕判定 DNA 是否已与捕获珠结合。如 DNA 并未在捕获珠周围大量聚集，您可延长混合时间。
于室温下静置离心管 1 分钟，不要旋转。
小心吸走离心管中的清液，注意不要吸出与捕获珠结合的 DNA。检查并去除管盖上残留的清液。
请注意： 如离心管中的异丙醇残留量不超过 ~100 μl，则不会影响后续实验。
向含有已结合 DNA 的捕获珠的离心管内加入 2 ml Monarch gDNA 洗涤缓冲液，并倒转混匀。
请确保您已按试剂盒说明，将乙醇添加至 Monarch gDNA 洗涤缓冲液中。
吸掉洗涤缓冲液，小心不要吸出与捕获珠结合的 DNA。检查并去除管盖上残留的洗涤缓冲液。
向含有已结合 DNA 的捕获珠的离心管内加入 2 ml Monarch gDNA 洗涤缓冲液。
向一只洁净的 2 ml Eppendorf 离心管内，加入 560 µl 提取洗脱缓冲液（EEB）。
吸掉洗涤缓冲液，小心不要吸出与捕获珠结合的 DNA。检查并去除管盖上残留的洗涤缓冲液。
将 Monarch 捕获珠分离管套入 Monarch 收集管 II，并将捕获珠转移至分离管中。
瞬时离心，以去除捕获珠上残留的洗涤缓冲液。弃置含有残余洗涤缓冲液的收集管。
切勿使用 Monarch® 高分子量组织 DNA 提取试剂盒中提供的 Monarch 洗脱缓冲液 II。
立即将捕获珠从分离管转移至含有 560 µl 提取洗脱缓冲液（EEB）的 2 ml 离心管中。
应尽快完成转移，以防捕获珠过度干燥，从而延长 DNA 的溶解时间。
将离心管在 56℃ 下孵育 10 分钟 。
另备一支套有收集管的捕获珠分离管，将捕获珠与提取洗脱缓冲液（EEB）一并倒入分离管中，并以 1000 x g 离心 1 分钟，使捕获珠和洗脱液分离。丢弃捕获珠及分离管。
向液体收集管中另添加 200 μl 提取洗脱缓冲液（EEB），使总洗脱体积增至 760 μl。
将洗脱液转移至一支新的 2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管中。
56℃ 下孵育10 分钟。
使用 1 ml 宽口吸头缓慢吹打十次洗脱液，轻柔混匀。
轻柔地充分重悬 DNA，以避免样本中 DNA 分布不均。
重悬的 DNA 将用于稍后的定量步骤。如需要，您也可以此时将样品置于室温储存过夜。
6. gDNA 定量（非必需）
材料
- Monarch® DNA 捕获珠
- Monarch® 捕获珠分离管
- Monarch® 收集管 II
耗材
- 2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- Qubit dsDNA BR Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher ，Q32850）
仪器
- 涡旋混匀仪
- 离心机
- Qubit荧光计 （或用于质控检测的等效仪器）
- P200 移液枪和枪头
超高分子量基因组DNA定量
超高分子量 gDNA 定量方法由Paul A ‘Giron’ Koetsier 和 Eric J Cantor 于 2021 年开发，其中建议使用常规 P200 移液枪和枪头。
此定量步骤为可选项，主要用于质量控制（QC）。如无定量需求，可跳过此步骤，直接取 750 µl 溶于提取洗脱缓冲液（EEB）中的 DNA，用于后续的酶切法片段化步骤。
使用常规 P200 移液枪枪头吸取 10 μl gDNA。
如 DNA 极为黏稠，可将枪头抵住离心管内壁，借助管壁阻力将吸取的 DNA 与样本主体分离。请确保 DNA 混合均匀，取出的 10 μl 样本具有代表性。
将吸取的 gDNA 转移至一支新的 2 ml 离心管中。
向此 10 μl 的 gDNA 中加入一颗 Monarch DNA 捕获珠，大力涡旋振荡一分钟，以打断 gDNA。
将 Monarch 捕获珠分离管套入 Monarch 收集管 II，并将 gDNA 及捕获珠一同转移至分离管中。1000 x g 离心 1 分钟，使捕获珠和洗脱液分离。丢弃捕获珠及分离管。
使用宽口移液枪头，将 gDNA 转移至一只新的 Eppendorf DNA LoBind 离心管中。
LoBind 离心管的规格选择取决于后续纯化步骤中是否使用沉淀星（PS）。
使用沉淀星（PS）纯化
- 将 gDNA 转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind 管中。
不使用沉淀星（PS）纯化:
- 将 gDNA 转至一干净的 2 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管中。
用 Qubit 为样本定量。DNA 预期产量在 30-40 μg。
750 μl 的 DNA 将用于稍后的“酶切法片段化”步骤。
7. 酶切法片段化
材料
- 750 μl 溶解于提取洗脱缓冲液（EEB）的超高分子量 gDNA
- 快速测序文库接头（RA）
- 片段化反应试剂（FRA）
- FRA 稀释缓冲液（FDB）
耗材
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
- 热循环仪或恒温加热仪
- 迷你离心机
- P1000 移液枪和宽口枪头
- P1000 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
- 盛有冰的冰桶
超高分子量基因组 DNA 的最佳操作方法
为确保样本充分混匀，并最大限度避免打断长序列片段，我们建议用户使用宽口枪头吹打全部体积的样本。
混匀手法越轻柔缓慢，越不会破坏长片段DNA。用户也可选择低速涡旋混匀，但会打断长片段 DNA。
请勿以混合不充分为代价，保全 DNA 片段长度。试剂与 DNA 混合不充分会导致读长和产出降低。
更多相关信息，请参阅疑难解答部分。
将下表所列试剂置于室温解冻，经迷你离心机瞬时离心后，吹打混匀：
试剂解冻后，请始终置于冰上保存。
| 试剂 | 室温下解冻 | 瞬时离心 | 吹打混匀 |
|---|---|---|---|
| 片段化反应试剂（FRA） | 未冻结 | ✓ | ✓ |
| FRA稀释缓冲液（FDB） | 未冻结 | ✓ | ✓ |
| 快速测序文库接头 （RA） | 未冻结 | ✓ | ✓ |
在一支1.5ml Eppendorf DNA LoBind 离心管内，按下表使用 FRA 稀释缓冲液（FDB）稀释片段化反应试剂（FRA）：
| 试剂 | 体积 |
|---|---|
| 片段化反应试剂（FRA） | 6 µl |
| FRA稀释缓冲液（FDB） | 244 µl |
| 总体积 | 250 µl |
吹打混匀经过稀释的片段化反应试剂（FRA）。
使用常规移液枪头，向提取的 750 μl DNA 溶液中加入 250 μl 稀释后的片段化反应试剂（FRA），边加边用枪头搅动，以确保均匀混合。
立即使用宽口枪头吹打十次。
肉眼检查，确保试剂充分混匀。在向 DNA 中加入稀释过的片段化反应试剂（FRA）后，请务必立即混匀。
按以下条件孵育反应：
| 温度 | 时间 |
|---|---|
| 室温 | 10 分钟 |
| 75°C | 10 分钟 |
| 冰上 | 于冰上冷却 不少于 10 分钟 |
请注意： 加入快速测序文库接头（RA）前，请务必将反应液于冰上冷却至室温，以防止酶变性。
使用常规枪头加入 5 μl 快速测序文库接头（RA），
再使用 1 ml 宽口移液枪头缓慢吹打五次，轻柔混匀。
注意： 肉眼检查，确保反应彻底混匀。
室温下孵育 30 分钟。
8. 纯化（使用沉淀星）
材料
- Oxford Nanopore 试剂盒中的洗脱缓冲液（EB）
- 沉淀缓冲液（PTB）
- 沉淀星（PS）
耗材
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
- 离心机
- 迷你离心机
- Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
- P200 移液枪和枪头
- P1000 移液枪和枪头
- P1000 移液枪和宽口枪头
请根据所使用的 DNA超长片段测序试剂盒（SQK-ULK114）的批次，选择对应的操作方法。
我们此前发现 SQK-ULK114 试剂盒中的沉淀星（PS）存在问题，并已将其从操作方法中移除，以规避潜在风险。
经过生产工艺优化和内部验证，沉淀星（PS）现已改进，并重新纳入 SQK-ULK114 试剂盒中。
| 不应使用沉淀星的试剂盒形式： | 包含改进版可用沉淀星的试剂盒形式： |
|---|---|
ULK114.20.xxxx 或更早批次  | ULK114.30.0001 及更高批次  |
将下表所列试剂置于室温解冻，经迷你离心机瞬时离心后，涡旋振荡混匀：
| 试剂 | 室温下解冻 | 瞬时离心 | 吹打混匀 |
|---|---|---|---|
| 沉淀缓冲液（PTB） | ✓ | ✓ | ✓ |
| 洗脱缓冲液（EB） | ✓ | ✓ | ✓ |
解冻后，请将各试剂置于冰上。
我们强烈建议您在进行沉淀星（PS）纯化操作时使用 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管。
向样本中加入一颗沉淀星（PS）。
使用常规移液枪头，向样本中加入 500 μl 沉淀缓冲液（PTB）。
将样品置于 Hula 混匀仪（低速旋转式混匀仪） 上以 3 rpm 的速度旋转混合20分钟。
观察确认 DNA 是否已在沉淀星（PS）周围形成沉淀。
使用常规枪头小心移除清液，注意避免吸出 DNA。
此时沉淀星（PS）应悬浮于 1.5 ml Eppendorf LoBind DNA 管中部，便于其下方清液的移除。
将离心管瞬时离心，使用常规枪头吸尽残余清液，注意避免吸出 DNA。
使用常规移液枪头，向含有沉淀星（PS）和 DNA 的离心管中加入 300 µl 的洗脱缓冲液（EB）。室温下孵育过夜（至少12小时）。
使用宽口枪头，将含有 DNA 文库的洗脱液转移至一只新的 1.5 ml Eppendorf LoBind DNA 离心管中。
随后对含沉淀星（PS）的离心管瞬时离心，使用宽口枪头移除残余洗脱液，并合并至前一步收集的洗脱液中。请确保沉淀星（PS）表面无残留液体。
弃掉含有沉淀星（PS）的离心管。
使用宽口枪头轻轻吹打 DNA 文库十次，轻柔混匀。
轻柔地充分重悬DNA，以避免样本中DNA 分布不均。
构建好的 DNA 文库即可用于测序芯片上样。在上样前，请将文库置于冰上保存。
文库保存建议
若为 短期 保存或重复使用（例如在清洗芯片后再次上样），我们建议将文库置于Eppendorf LoBind 离心管中 4℃ 保存。 若为一次性使用且储存时长 超过3个月 ，我们建议将文库置于Eppendorf LoBind 离心管中 -80℃ 保存。
9. 纯化（不使用沉淀星）
材料
- Oxford Nanopore 试剂盒中的洗脱缓冲液（EB）
- 沉淀缓冲液（PTB）
耗材
- 2.0 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
- 离心机
- 迷你离心机
- Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
- P200 移液枪和枪头
- P1000 移液枪和枪头
- P1000 移液枪和宽口枪头
请根据所使用的 DNA超长片段测序试剂盒（SQK-ULK114）的批次，选择对应的操作方法。
我们此前发现 SQK-ULK114 试剂盒中的沉淀星（PS）存在问题，并已将其从操作方法中移除，以规避潜在风险。
经过生产工艺优化和内部验证，沉淀星（PS）现已改进，并重新纳入 SQK-ULK114 试剂盒中。
| 不应使用沉淀星的试剂盒形式： | 包含改进版可用沉淀星的试剂盒形式： |
|---|---|
| ULK114.20.xxxx 或更早批次 | ULK114.30.0001 及更高批次 |
将下表所列试剂置于室温解冻，经迷你离心机瞬时离心后涡旋振荡混匀：
| 试剂 | 室温下解冻 | 瞬时离心 | 吹打混匀 |
|---|---|---|---|
| 沉淀缓冲液（PTB） | ✓ | ✓ | ✓ |
| 洗脱缓冲液（EB） | ✓ | ✓ | ✓ |
解冻后，请将各试剂置于冰上。
如您不使用沉淀星（PS）进行纯化操作，建议选用 2ml Eppendorf DNA LoBind 离心管。
使用常规移液枪头，向样本中加入 500 μl 沉淀缓冲液（PTB）。
使用 Hula 混匀仪（低速旋转式混匀仪）以 3 rpm 的速度旋转混合20分钟。
肉眼检查 DNA 是否已形成玻璃样白色沉淀。
1000 x g 离心一分钟。
使用常规移液枪枪头，小心吸去上清液，注意不要扰动 DNA 沉淀。
1000 x g 离心一分钟。
使用常规移液枪枪头，小心吸去残留的上清液，注意不要扰动 DNA 沉淀。
使用常规移液枪枪头，向含有 DNA 的离心管内加入 300 µl 的洗脱缓冲液（EB）。室温孵育过夜（至少12小时）。
使用宽口枪头轻轻吹打含有DNA文库的洗脱液十次，轻柔混匀。
轻柔地充分重悬DNA，以避免样本中DNA 分布不均。
构建好的 DNA 文库即可用于测序芯片上样。在上样前，请将文库置于冰上保存。
文库保存建议
若为 短期 保存或重复使用（例如在清洗芯片后再次上样），我们建议将文库置于Eppendorf LoBind 离心管中 4℃ 保存。 若为一次性使用且储存时长 超过3个月 ，我们建议将文库置于Eppendorf LoBind 离心管中 -80℃ 保存。
10. SpotON 测序芯片的预处理及上样
材料
- 测序芯片冲洗液（FCF）
- 冲洗系绳 UL（FTU）
- 上样溶液 UL（LSU）
- 测序缓冲液 UL（SBU）
耗材
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- MinION及GridION测序芯片
- （非必需）牛血清白蛋白（BSA）（50 mg/mL）（例如 Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/mL， AM2616）
仪器
- MinION 或 GridION 测序仪
- MinION 及GridION 测序芯片遮光片
- P1000 移液枪和宽口枪头
- P200 移液枪和宽口枪头
- P1000 移液枪和枪头
- P200 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
请注意：本试剂盒仅兼容 R10.4.1 测序芯片（FLO-MIN114）。
请务必仅使用 SQK-ULK114 试剂盒中提供的试剂对测序芯片进行预处理和上样。 其他试剂盒中的试剂与本操作指南不兼容。
测序芯片的预处理及上样
我们建议所有新用户在首次运行测序芯片前，观看视频测序芯片的预处理及上样。
请勿在 DNA 文库上样前安装 MinION 测序芯片遮光片
为确保操作顺利，并便于在测序芯片各端口进行操作，请 勿 在 DNA 文库上样前安装 MinION 测序芯片遮光片。
如已提前安装，请取下并妥善保存，待后续使用。
于室温下解冻测序缓冲液 UL（SBU）、上样溶液 UL（LSU）、冲洗系绳 UL（FTU）和一管测序芯片冲洗液（FCF），涡旋振荡混匀。瞬时离心后置于冰上。
在一支新的离心管中，按下表配制待上样的 DNA 文库：添加 DNA 文库时，请使用宽口移液枪头。
| 试剂 | 每张测序芯片的上样体积 |
|---|---|
| 测序缓冲液 UL (SBU) | 37.5 µl |
| 上样溶液 UL (LSU) | 3.7 µl |
| DNA 文库 | 33.8 µl |
| 总体积 | 75 µl |
注意： 在加入 DNA 文库前，请确保测序缓冲液 UL（SBU）和上样溶液 UL（LSU）已充分吹打混匀。
使用宽口枪头轻轻吹打制备好的 DNA 文库十次，轻柔混匀。
室温下孵育 30 分钟后，再次使用宽口枪头缓慢吹打，轻柔混匀。肉眼检查，确保样本均匀。
打开 MinION 或 GridION 测序仪的盖子，将测序芯片插入金属固定夹的下方。用力向下按压预处理孔孔盖处，以确保正确的热、电接触。
为文库上样前，完成测序芯片质检，查看可用孔数目。
如此前已对测序芯片进行过质检，则此步骤可省略。
详情请参阅 MinKNOW 实验指南中的测序芯片质检说明 。
顺时针转动测序芯片的预处理孔孔盖，使预处理孔显露出来。
小心地从测序芯片中反旋吸出缓冲液。请勿吸出超过 20-30 µl的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。
将预处理孔打开后，检查孔周围是否有小气泡。请按照以下方法，从孔中排出少量液体以清除气泡：
1.将 P1000 移液枪转至 200µl 刻度。
2.将枪头垂直插入预处理孔中。
3.转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在 220-230 µl之间，或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。
注意： 肉眼检查，确保从预处理孔到传感器阵列的缓冲液连续且无气泡。
为在 R10.4.1 测序芯片（FLO-MIN114）上获得最优测序表现并提高测序产出，我们建议您向测序芯片预处理液中加入终浓度为 0.2 mg/ml 的牛血清白蛋白（BSA）。我们不推荐使用重组牛血清白蛋白。
为在 R10.4.1 测序芯片（FLO-MIN114）上获得最优测序表现并提高测序产出，我们建议您向测序芯片预处理液中加入终浓度为 0.2 mg/ml 的牛血清白蛋白（BSA）。我们不推荐使用重组牛血清白蛋白。
配制含 BSA 的芯片预处理液：将下表试剂加入至 1.5 ml 的 Eppendorf 管中，在室温下颠倒并吹打混匀。
| 试剂 | 体积 |
|---|---|
| 50mg/ml 的牛血清白蛋白 (BSA) | 5 µl |
| 冲洗系绳 UL（FTU） | 30 µl |
| 测序芯片冲洗液（FCF） | 1170 µl |
| 总体积 | 1205 µl |
此阶段请勿安装 MinION 测序芯片遮光片。
如已安装，请将其取下并妥善保存，待后续步骤需要时再使用。
通过预处理孔向芯片中加入 800 µl 预处理液，避免引入气泡。等待5分钟。
完成测序芯片的预处理：
1.轻轻地翻起 SpotON 加样孔孔盖，使 SpontON 上样孔显露出来。
2.通过预处理孔（而非 SpotON 加样孔）向芯片中加入 200µl 预处理液，避免引入气泡。
请确保测序芯片的 SpotON 加样孔及预处理孔孔盖均已打开，准备上样。
使用宽口移液枪头，向 SpotON 加样孔中加入 75 μl DNA文库。
注意：请勿将枪头直接接触或插入 SpotON 加样孔，以免损坏芯片阵列。
上样后，静置不超过两分钟，等待 DNA 文库自然流入 SpotON 加样孔。
如文库未能顺利进入 SpotON 加样孔，您可按后文说明，通过对芯片施加负压辅助上样。
用戴有洁净手套的手指堵住废液孔2和预处理孔。
在废液孔2和预处理孔被覆盖的情况下，将 P200 移液枪的移液按钮下压至第二停止点，再将枪头插入废液孔1。
以非常缓慢的速度吸液，使 DNA 文库进入 SpotON 加样孔。仔细观察加液孔上方的 DNA 文库液滴，一旦文库开始进入 SportON 加样孔，请立即将移液枪移开废液孔。
注意： 请避免向测序芯片急速施加负压，以防引入气泡。气泡会对测序芯片造成不可逆转地损害。
轻轻合上 SpotON 加样孔孔盖，确保塞头塞入加样孔内。合上预处理孔盖。
为获得最佳测序产出，在文库样本上样后，请立即在测序芯片上安装遮光片。
我们建议在清洗芯片并重新上样时，将遮光片保留在测序芯片上。一旦文库从测序芯片中吸出，即可取下遮光片。
按下述步骤安装测序芯片遮光片：
1.小心将遮光片的前沿（平端）与金属固定夹的边沿对齐。 注意： 请勿将遮光片强行压到固定夹下方。
2.将遮光片轻轻盖在测序芯片上。遮光片的 SpotON 加样孔孔盖缺口应与芯片上的 SpotON 加样孔孔盖接合，遮盖住整个测序芯片的前部。
MinION测序芯片的遮光片并非固定在测序芯片上，因此当为芯片加装遮光片后，请小心操作。
合上测序设备上盖，在 MinKNOW 上设置测序实验。
为提高数据产出，我们建议每个超长 DNA 文库在同一张芯片上进行三次连续测序。
为恢复通道状态并最大化测序数据产出，请务必在每两次测序间，使用测序芯片清洗试剂盒（EXP-WSH004）清洗芯片。
一次反应制备的文库量足以支持在一张 MinION/GridION 测序芯片上连续上样六次。每次上样前，需将 33.8 µl 文库与 37.5 µl 测序缓冲液 UL（SBU）和 3.7 µl 上样溶液（LSU）混合均匀后加入芯片。
请参考测序芯片清洗试剂盒操作指南中的 Flushing a MinION/GridION Flow Cell（冲洗 MinION/GridION 测序芯片）部分，以获取核酸酶冲洗的详细操作说明。清洗后如需立即再次对超长 DNA 文库测序，请按照以下说明操作：
11. 将超长 DNA 文库再次上样至 MinION/GridION 测序芯片
材料
- 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）
- 冲洗系绳 UL（FTU）
- 测序芯片冲洗液（FCF）
- 测序缓冲液 UL（SBU）
- 上样溶液 UL（LSU）
耗材
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
- （非必需）牛血清白蛋白（BSA）（50 mg/mL）（例如 Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/mL， AM2616）
仪器
- P1000 移液枪和宽口枪头
- P200 移液枪和宽口枪头
- P1000 移液枪和枪头
- P200 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
在重新上样当前文库或上样新文库之前，请务必使用测序芯片清洗试剂盒（EXP-WSH004）对测序芯片进行清洗。
请按照适用于 MinION/GridION 的测序芯片清洗试剂盒（EXP-WSH004）实验指南进行操作。
- 该操作旨在清除测序芯片中的当前文库，为后续文库的上样做好准备；
- 清洗和上样过程中，应暂停 MinKNOW 的数据采集；
- 芯片清洗完成后，即可上样新文库。
如您计划在清洗后立即进行下一次文库上样，建议在清洗过程中保留测序芯片的遮光片；
若芯片在清洗后需暂时保存，则可将遮光片移除。
如计划在冲洗芯片后立即进行下一次超长片段 DNA 文库的测序，建议在每一步预处理后，吸出废液槽中的全部废液。
于室温下解冻测序缓冲液 UL（SBU）、上样溶液 UL（LSU）、冲洗系绳 UL（FTU）和一管测序芯片冲洗液（FCF），涡旋振荡混匀。瞬时离心后置于冰上。
在一支新的离心管中，按下表配制待上样的 DNA 文库：添加 DNA 文库时，请使用宽口移液枪头。
| 试剂 | 每张测序芯片的上样体积 |
|---|---|
| 测序缓冲液 UL (SBU) | 37.5 µl |
| 上样溶液 UL (LSU) | 3.7 µl |
| DNA 文库 | 33.8 µl |
| 总体积 | 75 µl |
注意： 在加入 DNA 文库前，请确保测序缓冲液 UL（SBU）和上样溶液 UL（LSU）已充分吹打混匀。
使用宽口枪头轻轻吹打含制备好的 DNA 文库十次，轻柔混匀。
室温下孵育 30 分钟后，再次使用宽口枪头缓慢吹打，轻柔混匀。肉眼检查，确保样本均匀。
顺时针转动预处理孔孔盖，使预处理孔显露出来。
小心地从测序芯片中反旋吸出缓冲液。请勿吸出超过 20-30 µl的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。
将预处理孔打开后，检查孔周围是否有小气泡。请按照以下方法，从孔中排出少量液体以清除气泡：
1.将 P1000 移液枪转至 200µl 刻度。
2.将枪头垂直插入预处理孔中。
3.转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在 220-230 µl之间，或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。
注意： 肉眼检查，确保从预处理孔到传感器阵列的缓冲液连续且无气泡。
为在 MinION R10.4.1 测序芯片（FLO-MIN114）上获得最优测序表现并提高测序产出，我们建议您向测序芯片预处理液中加入终浓度为 0.2 mg/ml 的牛血清白蛋白（BSA）。
注意： 我们不建议使用其他类型的白蛋白（例如重组人血清白蛋白）。
配制含 BSA 的芯片预处理液：将下表试剂加入至 1.5 ml 的 Eppendorf 管中，在室温下颠倒并吹打混匀。
| 试剂 | 体积 |
|---|---|
| 50 mg/ml 的牛血清白蛋白（BSA） | 5 µl |
| 冲洗系绳 UL （FTU） | 30 µl |
| 测序芯片冲洗液（FCF） | 1170 µl |
| 总体积 | 1205 µl |
通过预处理孔向芯片中加入 800µl 预处理液，避免引入气泡。等待5分钟。
为确保充分清除酸酶，两次预处理液冲洗之间须间隔 5 分钟。
盖上预处理孔孔盖，并确保 SpotON 加样孔孔盖处于闭合状态。
在吸出废液前，请确保测序芯片预处理孔和 SpotON 加样孔已关闭，以避免气泡进入传感器阵列，造成大量测序通道损失。
吸出废液的步骤如下：
1.如下图所示，合上测序芯片预处理孔和 SpotON 加样孔孔盖。
2.将 P1000 移液枪插入废液口1，吸出废液。
注意： 由于预处理孔和 SpotON 加样孔均已关闭，因此传感器阵列内的液体不会流失。
打开预处理孔孔盖，通过预处理孔向芯片中加入 200µl 预处理液，避免引入气泡。
合上预处理孔处孔盖，并使用 P1000 移液枪，通过废液孔1吸出废液槽中的所有液体。
确保测序芯片的 SpotON 加样孔及预处理孔孔盖均已打开，准备上样。
使用宽口移液枪头，向 SpotON 加样孔中加入 75 μl DNA文库。
注意：请勿将枪头直接接触或插入 SpotON 加样，以免损坏芯片阵列。
上样后，静置不超过两分钟，等待 DNA 文库自然流入 SpotON 加样孔。
如文库未能顺利进入 SpotON 加样孔，您可按后文说明，通过对芯片施加负压辅助上样。
用戴有洁净手套的手指堵住废液孔2和预处理孔。
在废液孔2和预处理孔被覆盖的情况下，将P200移液枪的移液按钮下压至第二停止点，再将枪头插入废液孔1。
以非常缓慢的速度吸液，使 DNA 文库进入 SpotON 加样孔。仔细观察加液孔上方的 DNA 文库液滴，一旦文库开始进入 SportON 加样孔，请立即将移液枪移开废液孔。
注意： 请避免向测序芯片急速施加负压，以防引入气泡。气泡会对测序芯片造成不可逆转地损害。
轻轻合上 SpotON 加样孔孔盖，确保塞头塞入加样孔内。合上预处理孔盖。
为获得最佳测序产出，在文库样本上样后，请立即在测序芯片上安装遮光片。
我们建议在清洗芯片并重新上样时，将遮光片保留在测序芯片上。一旦文库从测序芯片中吸出，即可取下遮光片。
按下述步骤安装测序芯片遮光片：
1.小心将遮光片的前沿（平端）与金属固定夹的边沿对齐。 注意： 请勿将遮光片强行压到固定夹下方。
2.将遮光片轻轻盖在测序芯片上。遮光片的 SpotON 加样孔孔盖缺口应与芯片上的 SpotON 加样孔孔盖接合，遮盖住整个测序芯片的前部。
MinION测序芯片的遮光片并非固定在测序芯片上，因此当为芯片加装遮光片后，请小心操作。
再次上样后，恢复 MinKNOW 中被暂停的测序实验，并启动孔扫描。
如需恢复测序实验，请导航至“Experiments”（实验）页面，点击“Resume”（恢复）并选择相应的测序芯片位置。
如需启动通道扫描，请点击“开始孔扫描”（Start pore scan）并选择相应的测序芯片位置。
更多信息，请参阅MinKNOW实验指南。
恢复测序实验：
孔扫描：
12. 数据采集和碱基识别
如何开始测序
在完成测序芯片的加样后，您即可在MinKNOW中启动测序实验。MinKNOW 软件负责仪器控制、数据采集以及实时碱基识别。有关设置和使用 MinKNOW 的详细信息，请参阅MinKNOW 实验指南。
您可以通过多种方式使用并设置MinKNOW：
- 在直接或远程连接到测序设备的计算机上；
- 直接在 GridION 或 PromethION 24/48 测序设备上。
有关在测序设备上使用 MinKNOW 的更多信息，请参阅相应设备的用户手册：
在MinKNOW中启动测序：
1. 在 "开始 "（Start）页面上，选择 开始测序 （Start Sequencing）。
2.输入实验详情：例如实验名称，测序芯片位置及样本ID。
3.在"试剂盒"页面上，选择 所用的建库试剂盒 。
4.在“实验配置”（Run Configuration）页面设置测序与输出参数，或保持默认值。
请注意： 如果在设置实验参数时关闭了碱基识别，您可在实验结束后，在MinKNOW中运行线下碱基识别。详情请参阅MinKNOW实验指南。
5.单击 "参数确认" 页面上的 开始 启动测序。
测序后数据分析
当于MinKNOW上完成测序后，您可按照“测序芯片的重复利用及回收”一节中的说明重复使用或返还测序芯片。
完成测序和碱基识别后，即可进行数据分析。有关碱基识别和后续分析选项的详细信息，请参阅数据分析文档。
在下游分析部分，我们将概述更多用于数据分析的选项。
13. 测序芯片的重复利用及回收
材料
- 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）
完成测序实验后，如您希望再次使用测序芯片，请按照“测序芯片清洗试剂盒实验指南”进行操作，并将清洗后的芯片置于 +2 至 +8℃ 保存。
您可在纳米孔社区获取测序芯片清洗试剂盒实验指南。
我们建议您在停止测序实验后尽快清洗测序芯片。如若无法实现，请将芯片留在测序设备上，于下一日清洗。
或者，请按照回收程序将测序芯片返还至 Oxford Nanopore。
您可在 此处找到回收测序芯片的说明。
如果您遇到问题或对测序实验有疑问，请参阅本实验指南在线版本中的“疑难解答指南”一节。
14. 下游分析
下游分析
您可以选择以下几个途径来进一步分析经过碱基识别的数据：
1.EPI2ME 工作流程
Oxford Nanopore Technologies 通过 EPI2ME 提供了一系列针对高阶数据分析的生物信息学教程和工作流程。该平台通过描述性文字、生物信息学代码和示例数据，具象化地展示出我们的研究和应用团队发布在 GitHub 上的工作流程。
2.科研分析工具
Oxford Nanopore Technologies 的研发部门开发了许多分析工具，您可在 Oxford Nanopore 的 GitHub 资料库中找到。这些工具面向有一定经验的用户，并包含如何安装和运行软件的说明。工具是以源代码的形式提供的，因此我们仅提供有限的技术支持。
3.纳米孔社区用户开发的分析工具
如上述资源未能提供满足您研究需求的数据分析方法，请前往资源中心，查找适用的生物信息学工具。该工具库汇总了各种第三方用户开发、且在Github上开源的、针对纳米孔数据的生信分析工具。请注意，Oxford Nanopore Technologies不为这些工具提供支持，也不能保证它们与测序所用的最新的化学试剂/软件配置兼容。
15. 文库制备过程中的常见问题
以下表格列出了提取和文库制备过程中的常见问题，以及可能的原因和解决方法。
我们还在 Nanopore 社区的Support板块提供了常见问题解答（FAQ）。
如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮（support@nanoporetech.com）或 纳米孔社区的在线支持（LiveChat）联系我们。
故障排查
| 现象 | 措施及备注 |
|---|---|
| 低通量 | 1.加入经稀释的片段化反应试剂（FRA）后，轻轻涡旋振荡，以适度打断过长的DNA片段。 2.确保经稀释的片段化反应试剂（FRA）与 gDNA 充分混匀。 3.如DNA过于黏稠，无法加样，请减少起始材料的用量。 |
| DNA过于黏稠，无法流入测序芯片 | 1.减少起始材料以降低文库制备阶段所用gDNA的含量，从而降低黏度。 2.如使用本指南方法仍无法成功上样，请将标准 P200 移液枪量程调至文库上样体积，缓慢吹打文库 5 次，再重新上样。 |
| 读长低于预期 | 1.增加起始材料用量。 注意： 文库黏度与gDNA含量呈正相关。 2.可适当减少添加至 FRA 稀释缓冲液（FDB）的 FRA 试剂用量，以避免过度片段化基因组 DNA。 注意： 我们不推荐片段化反应试剂（FRA）的用量少于 2 μl。 3.我们建议使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）检测基因组DNA的分子量和片段分布，从而判断是否有超长片段。 |
| 无测序产出 | 1.使用NanoDrop分光光度计确认最终制备的文库中是否含有 gDNA。 2.检查样本黏度。根据本实验指南制备的超高分子量基因组 DNA 文库应呈粘稠状。 |
| DNA 沉降后移除清液的技巧 | 请小心不要吸出 DNA。为降低吸出 DNA 的风险，请少量逐次移除清液。 |
| 混匀 | 缓慢并小心地混匀，避免打断 DNA。用户也可选择低速涡旋振荡混匀，但可能因此打断超长序列片段；即便如此，所得序列片段的 N50 仍可达到 ~90 kb。 |
| 纯化后的文库没有回收到 DNA | 如 DNA 不再粘稠或 NanoDrop 读数偏低，则表明 DNA 可能在文库纯化步骤中丢失。 1.请确保待纯化的 DNA 具有超大分子量，否则可能在纯化过程中丢失。 2.请注意不要在纯化过程中吸出 DNA 沉淀。为避免上述问题，建议分次少量移除上清液，并确保尽可能移除全部上清。 |
Last updated: 7/2/2025
文档选项
