Ligation sequencing V14 - low input by PCR (SQK-LSK114 with EXP-PCA001)

Oxford Nanopore Technologies
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GridION: Protocol

Ligation sequencing V14 - low input by PCR (SQK-LSK114 with EXP-PCA001) V LWP_9183_v114_revK_07Mar2023

This protocol:

  • requires the PCR Expansion (EXP-PCA001) with the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
  • uses genomic DNA, amplicons or cDNA
  • results in high yield
  • has a library preparation time ~140 minutes + PCR
  • includes PCR steps
  • is compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

概览

This protocol:

  • requires the PCR Expansion (EXP-PCA001) with the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
  • uses genomic DNA, amplicons or cDNA
  • results in high yield
  • has a library preparation time ~140 minutes + PCR
  • includes PCR steps
  • is compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: LWP_9183_v114_revK_07Mar2023

1. Overview of the protocol

Introduction to the low input protocol

This protocol describes how to carry out sequencing using a low starting input with the PCR Expansion (EXP-PCA001). The protocol outlines how ligate the PCR Adapter onto the gDNA fragment ends before PCR amplification. For amplicon DNA inputs, we recommend using a tailed primer approach and starting from the PCR step before preparing the sample with the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114).

It is highly recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.

Note: For amplicon inputs, first-round PCR product with the following tailed primers are required. 5’ TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC-[ project-specific forward primer sequence ] 3’ 5’ ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC-[ project-specific reverse primer sequence ] 3’

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Experiment workflow

The table below is an overview of the steps required in the sample and library preparation, including timings and optional stopping points.

Library preparation Process Time Stop option
For gDNA: DNA end-prep

or

For amplicons: Incorporate tailed primers		 Prepare the DNA ends for PCR adapter attachment

or

Perform a round of PCR to incoporate tailed primers		 35 minutes 4°C overnight
PCR adapter ligation and amplification Amplify the DNA using the PCR primers 45 minutes 4°C overnight
End-prep Repair the DNA and prepare the DNA ends for adapter attachment 35 minutes 4°C overnight
Adapter ligation and clean-up Attach the sequencing adapters to the DNA ends 20 minutes 4°C short-term storage or for repeated use, such as re-loading your flow cell
-80°C for single-use, long-term storage.
We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes

low input PCA v2

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run for SQK-LSK114 using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
  • Start the EPI2ME software and select a workflow for further analysis (this step is optional)
重要

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

材料
  • 100 ng of sheared genomic DNA or amplicon DNA
  • 连接测序试剂盒V14（SQK-LSK114）
  • PCR Expansion (EXP-PCA001)
耗材
  • MinION及GridION测序芯片
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • NEBNext Ultra II 末端修复/ dA尾添加模块（NEB，E7546）
  • Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
  • NEB Blunt/TA 连接酶预混液（NEB，M0367）
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • 0.2 ml 薄壁PCR管
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • 新制备的80%乙醇（用无核酸酶水配制）
  • （非必需）牛血清白蛋白（BSA）（50 mg/mL）（例如 Invitrogen™ UltraPure™ BSA （50 mg/mL）， AM2616）
仪器
  • MinION 或 GridION 测序仪
  • MinION 及GridION 测序芯片遮光片
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 适用于1.5ml Eppendorf 离心管的磁力架
  • 迷你离心机
  • 涡旋混匀仪
  • 热循环仪
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2移液枪和枪头
  • 盛有冰的冰桶
  • 计时器
  • Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
可选仪器
  • Agilent生物分析仪（或等效仪器）
  • Eppendorf 5424 离心机（或等效器材）

100 ng of gDNA input is required.

If using amplicons, 100 ng of first-round PCR product (with tailed primers) is required per sample.

重要

Fragmentation and size selection

For successful amplification, it is critical that the DNA fragment distribution of templates used in the PCR are <8 Kbp. If the input DNA is not < Kbp, use follow steps outline in Shearing genomic DNA using the Covaris g-TUBE™ to shear the sample to each a fragment distribution <8 Kbp.

Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments. Instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.

起始DNA

DNA质控

选择符合质量和浓度要求的起始DNA至关重要的。使用过少或过多的DNA，或者质量较差的DNA（如，高度碎片化、含有RNA或化学污染物的DNA）都会影响文库制备。

有关如何对DNA样品进行质控，请参考起始DNA/RNA质控实验指南 。

化学污染物

从原始样本中提取DNA的方法不同，可能会导致经纯化的DNA中所残留的化学污染物不同。这会影响文库的制备效率和测序质量。请在牛津纳米孔社区的 Contaminants（污染物）页面 了解更多信息。

第三方试剂

Oxford Nanopore Technologies推荐您使用本实验指南中提及的所有第三方试剂，并已对其加以验证。我们尚未对其它替代试剂进行测试。

我们建议您按制造商说明准备待用的第三方试剂.

测序芯片质检

我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到MinION /GridION /PremethION测序芯片12周之内进行，或者在您收到Flongle测序芯片四周内进行。Oxford Nanopore Technologies会对活性孔数量少于以下标准的芯片进行替换** ：

测序芯片 芯片上的活性孔数确保不少于
Flongle 测序芯片 50
MinION/GridION 测序芯片 800
PromethION 测序芯片 5000

** 请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于Oxford Nanopore Technologies推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两天内递交给我们。请您按照 测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。

重要

AMPure XP Beads

Within the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114), AMPure XP Beads (AXP) are supplied at the volume needed to complete the "End-prep" and "Adapter ligation and clean up" steps of the protocol. However, for initially preparing the sample ends and the PCR steps, extra AMPure XP Beads are required for purification and clean-up. Please note, other purification methods are available.

连接测序试剂盒V14（SQK-LSK114）内容物

请注意： 我们正在将部分试剂的包装形式由单次管装改为瓶装。

单次管装试剂： SQK-LSK114 v2

部分试剂改为瓶装： SQK-LSK114 v3

声明： 本产品包含由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc）生产的 AMPure XP 试剂，并可与试剂盒一起于-20°C 下储存（试剂稳定性将不受损害）。

请注意： DNA参照（DCS）是一段可比对到Lambda基因组的3'端、长度为3.6 kb 的标准扩增子。

PCR Expansion (EXP-PCA001) contents

PCR expansion pack

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (μl)
PCR Primers PRM White 4 20
PCR Adapters PCA Blue 4 140

3. End-prep

材料
  • 100 ng of sheared genomic DNA or amplicon DNA
耗材
  • NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
  • NEBNext® Ultra II End Prep Reaction Buffer from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • 新制备的80%乙醇（用无核酸酶水配制）
  • 0.2 ml薄壁PCR管
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
  • Qubit dsDNA HS Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（Invitrogen, Q32851）
仪器
  • P1000 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • 热循环仪
  • 迷你离心机
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 磁力架
  • Vortex mixer
  • 盛有冰的冰桶
可选仪器
  • Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
CHECKPOINT

测序芯片质检

我们强烈建议您在开始文库制备前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检，以确保测序实验顺利运行。

详情请参阅 MinKNOW 实验指南中的 测序芯片质检说明。

Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Ensure the reagents are well mixed.
    Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.

Prepare the DNA in nuclease-free water

  1. Transfer 100 ng genomic DNA into a 0.2 ml thin-walled PCR tube
  2. Adjust the volume to 48 μl with nuclease-free water
  3. Mix thoroughly by flicking the tube to avoid unwanted shearing
  4. Spin down briefly in a microfuge

In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:

Reagent Volume
100 ng DNA 48 µl
Ultra II End-prep Reaction Buffer 7 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
Nuclease-free water 2 µl
Total 60 µl

Mix by pipetting and briefly spin down.

使用热循环仪，在20℃下孵育5分钟，然后在65℃下孵育5分钟。

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

将DNA样本转至干净的1.5 ml Eppendorf DNA LoBind离心管中。

Add 60 µl of resuspended AMPure XP beads to the end-prep reaction and mix by flicking the tube.

将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育5分钟。

准备500μl新制备的80％乙醇（用无核酸酶水配制）。

将样品瞬时离心，并静置于磁力架上待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去清液。

保持离心管在磁力架上不动，以200µl新鲜制备的80%乙醇洗涤磁珠。小心不要吹散磁珠。用移液枪将乙醇吸走并弃掉。

重复上述步骤。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的乙醇。让磁珠在空气中干燥约30秒，但不要干至表面开裂。

Remove the sample from the magnet and resuspend the pellet in 16 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

将离心管静置于磁力架上至少一分钟，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

Remove and retain 16 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

可选操作

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

步骤结束

Take forward the repaired and end-prepped DNA into the next step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

4. PCR adapters ligation and amplification

材料
  • PCR Adapter (PCA)
  • Primer Mix (PRM)
耗材
  • Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • 新制备的80%乙醇（用无核酸酶水配制）
  • NEB Blunt/TA 连接酶预混液（NEB，M0367）
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • 10 mM Tris-HCl pH 8.5
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • 0.2 ml薄壁PCR管
仪器
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 磁力架
  • 迷你离心机
  • 热循环仪
  • Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头

Add the reagents as follows in the order below:

Reagent Volume
End-prepped DNA 15 µl
PCR Adapter (PCA) 10 µl
Blunt/TA Ligase Master Mix 25 µl
Total 50 µl

Mix by pipetting and briefly spin down.

室温下孵育10 分钟。

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 20 µl of resuspended AMPure XP beads for a 0.4X clean and mix by pipetting up and down ten times.

将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育5分钟。

准备500μl新制备的80％乙醇（用无核酸酶水配制）。

将样品瞬时离心，并静置于磁力架上待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去上清液。

保持离心管在磁力架上不动，以200µl新鲜制备的80%乙醇洗涤磁珠。小心不要吹散磁珠。用移液枪将乙醇吸走并弃掉。

重复上述步骤。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的乙醇。让磁珠在空气中干燥约30秒，但不要干至表面开裂。

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 25 µl nuclease-free water. Spin down and incubate for 2 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain the eluate once it is clear and colourless. Transfer the eluted sample to a fresh 0.2 ml PCR tube.

  • Dispose of the pelleted beads
重要

If using amplicon input, start your second round of PCR from this point. Ensure the sample has undergone a round of PCR with tailed primers.

Quantify 1 µl of adapted DNA using a Qubit fluorometer.

Prepare the PCA adapted DNA in nuclease-free water:

  1. Transfer 20 ng genomic DNA into a 0.2 ml thin-walled PCR tube.
  2. Adjust the volume to 48 μl with nuclease-free water.
  3. Mix thoroughly by flicking the tube.
  4. Spin down briefly in a microfuge.

Set up the adapted DNA PCR as follows:

Reagent Volume
Nuclease-free water 46 µl
Primer Mix (PRM) 2 µl
10 ng/µl adapter ligated template 2 µl
HotStart LongAmp Taq 2x master mix 50 µl
Total volume 100 µl

If the amount of input material is altered, the number of PCR cycles may need to be adjusted to produce the same yield.

轻弹离心管以充分混合，并瞬时离心。

Amplify using the following cycling conditions:

Cycle step Temperature Time No. of cycles
Initial denaturation 94 °C 3 mins 1
Denaturation 94 °C 15 secs 15-18 (a)
Annealing 56 °C 15 secs 15-18 (a)
Extension 65 °C 6 mins (b) 15-18 (a)
Final extension 65 °C 10 mins 1
Hold 4 °C ∞

a. Adjust accordingly if input quantities are altered.

b. Adjust accordingly for different lengths of amplicons and the type of polymerase that is being used (LongAmp Taq amplifies at a rate of 50 seconds per kb). Here 6 min is used for ~8 Kbp templates.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 40 µl of resuspended AMPure XP beads to the reaction and mix by flicking the tube.

将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育5分钟。

准备500μl新制备的80％乙醇（用无核酸酶水配制）。

将样品瞬时离心，并静置于磁力架上待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去上清液。

Keep the samples on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellets. Remove the ethanol using a pipette and discard.

重复上述步骤。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的乙醇。让磁珠在空气中干燥约30秒，但不要干至表面开裂。

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 52 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

Remove and retain 52 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Dispose of the pelleted beads

Quantify 1 µl of adapted DNA using a Qubit fluorometer.

Gel analysis of amplified and ligated DNA

Sometimes a high-molecular weight product is visible in the wells of the gel when the PCR products are run, instead of the expected smear. These libraries are typically associated with poor sequencing performance. We have found that repeating the PCR with fewer cycles can remedy this.

步骤结束

Take forward the sample into the next step. However, at this point, it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

5. DNA修复和末端制备 (5)

材料
  • AMPure XP 磁珠（AXP）
耗材
  • NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
  • NEBNext® Ultra II End Prep Reaction Buffer from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
  • 0.2 ml薄壁PCR管
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • 新制备的80%乙醇（用无核酸酶水配制）
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
  • Qubit dsDNA HS Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（Invitrogen, Q32851）
仪器
  • P1000 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • 热循环仪
  • 迷你离心机
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 磁力架
  • 盛有冰的冰桶
可选仪器
  • Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）

Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Ensure the reagents are well mixed.
    Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.

Prepare the PCR amplified DNA in nuclease-free water

  1. Transfer 1 ug genomic DNA into a 0.2 ml thin-walled PCR tube.
  2. Adjust the volume to 50 μl with nuclease-free water.
  3. Mix thoroughly by flicking the tube to avoid unwanted shearing.
  4. Spin down briefly in a microfuge.

In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:

Reagent Volume
DNA 50 µl
Ultra II End-prep Reaction Buffer 7 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
Total 60 µl

轻轻吹打以充分混匀，并瞬时离心。

使用热循环仪，在20℃下孵育5分钟，然后在65℃下孵育5分钟。

涡旋振荡以重悬AMPure XP磁珠（AXP）。

将DNA样本转至干净的1.5 ml Eppendorf DNA LoBind离心管中。

将60µl重悬的AMPure XP磁珠（AXP）加入DNA末端修复反应体系中，轻弹试管以充分混合。

将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育5分钟。

准备500μl新制备的80％乙醇（用无核酸酶水配制）。

将样品瞬时离心，并静置于磁力架上待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去清液。

保持离心管在磁力架上不动，以200µl新鲜制备的80%乙醇洗涤磁珠。小心不要吹散磁珠。用移液枪将乙醇吸走并弃掉。

重复上述步骤。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的乙醇。让磁珠在空气中干燥约30秒，但不要干至表面开裂。

将离心管从磁力架上移开。将磁珠重悬于61µl无核酸酶的水中。室温下孵育2分钟。

将离心管静置于磁力架上至少一分钟，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将61µl洗脱液转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind管中。

CHECKPOINT

取1µl洗脱样品，用Qubit荧光计定量。

步骤结束

经过末端修复的DNA可用于稍后的接头连接。如需要，您也可以此时将样品置于4℃储存过夜。

6. 接头连接及纯化

材料
  • 连接接头（LA）
  • 连接测序试剂盒内的连接缓冲液（LNB）
  • 长片段缓冲液（LFB）
  • 短片段缓冲液（SFB）
  • AMPure XP 磁珠（AXP）
  • Oxford Nanopore测序试剂盒中的洗脱缓冲液（EB）
耗材
  • 耐盐T4 DNA连接酶（NEB, M0467）
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • Qubit dsDNA HS Assay（双链DNA高灵敏度检测）试剂盒（Invitrogen, Q32851）
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
仪器
  • 磁力架
  • 迷你离心机
  • 涡旋混匀仪
  • P1000 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • Qubit荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
提示

我们推荐您使用耐盐T4 DNA连接酶（NEB, M0467）。

耐盐 T4 DNA 连接酶（NEB，M0467）可单独购买，也包括在用于 Oxford Nanopore Technologies® 连接测序的 NEBNext® 配套模块 v2（货号 E7672S 或 E7672L）中。

虽然之前版本的 NEBNext® 配套模块（NEB，E7180S或E7180L）中的快速T4 DNA 连接酶（NEB，E6057）也可使用，但我们推荐的新试剂提供了更高的效率和更佳的连接效果。

重要

尽管第三方连接酶产品可能也附带缓冲液，但使用连接测序试剂盒中提供的连接缓冲液（LNB）时，连接接头（LA）的连接效率会更高。

瞬时离心连接接头（LA）和耐盐T4 DNA连接酶，置于冰上。

于室温下解冻连接缓冲液（LNB），解冻后瞬时离心，并用移液枪吹打混匀。该缓冲液的黏度较高，涡旋振荡会很难混匀。解冻并混匀后，请立即置于冰上。

将洗脱缓冲液（EB）于室温下解冻，涡旋振荡混匀后，再瞬时离心，置于冰上。

重要

接头连接后的纯化步骤，可通过选择不同缓冲液，按需富集大于3kb的DNA片段（LFB），或均等纯化所有大小的片段（SFB）。

  • 如若富集3kb或更长的DNA片段，请使用长片段缓冲液（LFB）
  • 如需保留所有大小的DNA片段，请使用短片段缓冲液（SFB）

请在室温下按需解冻一管长片段缓冲液（LFB）或短片段缓冲液（SFB），涡旋振荡混合，瞬时离心后置于冰上。

在一支1.5ml Eppendorf DNA LoBind离心管内，将所有试剂按以下顺序混合：

每添加一样试剂后，请吹打混匀10-20次，再添加下一样试剂。

试剂 体积
前一步骤所得DNA样品 60 µl
连接接头（LA） 5 µl
连接缓冲液（LNB） 25 µl
耐盐T4 DNA连接酶 10 µl
总体积 100 µl

轻轻吹打以充分混匀，并瞬时离心。

室温下孵育10分钟。

涡旋振荡以重悬AMPure XP磁珠（AXP）。

将40µl 重悬的AMPure XP磁珠加入反应体系中，轻弹离心管以充分混合。

将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育5分钟。

将样品瞬时离心，并静置于磁力架上待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去上清液。

用250μl的长片段缓冲液（LFB）或250μl的短片段缓冲液（SFB）洗涤磁珠。轻弹离心管将磁珠混匀后，将离心管瞬时离心，再放回磁力架，静置待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去清液。

重复上述步骤。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的上清液。让磁珠在空气中干燥约30秒，但不要干至表面开裂。

将离心管从磁力架上移开。将磁珠重悬于15µl洗脱缓冲液中（EB）。瞬时离心，然后在室温下孵育10分钟。对于高分子量的DNA，在37℃下孵育可以提高长片段的回收率。

将离心管静置于磁力架上至少一分钟，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将此15µl洗脱液转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind管中。

丢弃磁珠

CHECKPOINT

取1µl洗脱样品，用Qubit荧光计定量。

根据您的 DNA 文库片段的大小，请使用洗脱缓冲液（EB）将最终文库的体积调整至 12 µl。

文库片段长度 测序芯片上样量
非常短 (<1 kb) 100 fmol
短 (1-10 kb) 35–50 fmol
长 (>10 kb) 300 ng

请注意： 如您的文库产量低于我们的推荐值，请使用全部文库上样。

您可按需使用质量与摩尔数转换计算器，如 NEB 计算器。

步骤结束

构建好的文库即可用于测序芯片上样。在上样前，请将文库置于冰上或4℃条件下保存。

提示

文库保存建议

若为 短期 保存或重复使用（例如在清洗芯片后再次上样），我们建议将文库置于Eppendorf LoBind 离心管中 4℃ 保存。 若为一次性使用且储存时长 __超过3个月__，我们建议将文库置于Eppendorf LoBind 离心管中 -80℃ 保存。

7. MinION及GridION 测序芯片的预处理及上样

材料
  • 测序芯片冲洗液（FCF）
  • 测序芯片系绳（FCT）
  • 文库溶液（LIS）
  • 文库颗粒（LIB）
  • 测序缓冲液（SB）
耗材
  • MinION及GridION测序芯片
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • 无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）
  • （非必需）牛血清白蛋白（BSA）（50 mg/mL）（例如 Invitrogen™ UltraPure™ BSA （50 mg/mL）， AM2616）
仪器
  • MinION 或 GridION 测序仪
  • MinION 及GridION 测序芯片遮光片
  • P1000 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
重要

请注意：本试剂盒仅兼容R10.4.1测序芯片（FLO-MIN114）。

提示

测序芯片的预处理及上样

我们建议所有新用户在首次运行测序芯片前，观看视频测序芯片的预处理及上样。

于室温下解冻测序缓冲液（SB）、文库颗粒（LIB）或文库溶液（LIS）、测序芯片系绳（FCT）和一管测序芯片冲洗液（FCF）。完全解冻后，涡旋振荡混匀，然后瞬时离心并置于冰上。

重要

为在MinION及GridION R10.4.1测序芯片（FLO-MIN114）上获得最优的测序表现并提高测序产出，我们推荐您向测序芯片预处理液中加入终浓度为0.2 mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）。

请注意： 我们不推荐使用其它类型的白蛋白（例如重组人血清白蛋白）。

按下表制备测序芯片的预处理液，室温下吹打混匀。

请注意： 我们正在将部分试剂的包装形式由单次管装改为瓶装。请按照与您所用试剂盒包装相对应的说明操作。

单次使用管装： 向一整管测序芯片冲洗液（FCF）中加入5µl 50mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）及 30µl 测序芯片系绳（FCT）。

瓶装： 请另拿一支适当体积的离心管制备测序芯片预处理液：

试剂 体积（每张芯片）
测序芯片冲洗液 (FCF) 1,170 µl
50mg/ml的牛血清白蛋白 (BSA) 5 µl
测序芯片系绳 (FCT) 30 µl
总体积 1,205 µl

打开MinION或GridION测序仪的盖子，将测序芯片插入金属固定夹的下方。用力向下按压芯片，以确保正确的热、电接触。

中文-测序芯片预处理上样1a

中文-测序芯片预处理上样1b

可选操作

为文库上样前，完成测序芯片检测，查看可用孔数目。

如此前已对测序芯片进行过质检，则此步骤可省略。

更多信息，请查看MinKNOW实验手册的 测序芯片质检 部分。

顺时针转动预处理孔孔盖，使预处理孔显露出来。

中文-测序芯片预处理上样2

重要

从测序芯片中反旋排出缓冲液。请勿吸出超过20-30µl的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。

将预处理孔打开后，检查孔周围是否有小气泡。请按照以下方法，从孔中排出少量液体以清除气泡：

  1. 将P1000移液枪转至200µl刻度。
  2. 将枪头垂直插入预处理孔中。
  3. 反向转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在220-230 µl之间，或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。
    __请注意：__ 肉眼检查，确保从预处理孔到传感器阵列的缓冲液连续且无气泡。

中文-测序芯片预处理上样3

通过预处理孔向芯片中加入800µl预处理液，避免引入气泡。等待5分钟。在此期间，请按照以下步骤准备用于上样的DNA文库。

中文-测序芯片预处理上样4

将含有文库颗粒的LIB管用移液枪吹打混匀。

重要

LIB管内的文库颗粒分散于悬浮液中。由于颗粒沉降速度非常快，因此请在混匀颗粒后立即使用。

对于大多数测序实验，我们建议使用文库颗粒（LIB）。然而，对于粘度较高的文库，可以考虑使用文库溶液（LIS）。

在一支新的1.5ml Eppendorf LoBind离心管中，按下表所示准备上样文库：

试剂 体积（每张测序芯片）
测序缓冲液（SB） 37.5 µl
文库颗粒（LIB），使用前即时混匀；或文库溶液（LIS） 25.5 µl
DNA文库 12 µl
总体积 75 µl

完成测序芯片的预处理：

  1. 轻轻地翻起SpotON上样孔盖，使SpotON上样孔显露出来。 中文-测序芯片预处理上样5
  2. 通过预处理孔（而 非 SpotON加样孔）向芯片中加入200µl预处理液，避免引入气泡。 中文-测序芯片预处理上样6

临上样前，用移液枪轻轻吹打混匀制备好的文库。

通过SpotON加样孔向芯片中逐滴加入75µl样品。确保液滴流入孔内后，再加下一滴。

中文-测序芯片预处理上样7

轻轻合上SpotON加样孔孔盖，确保塞头塞入加样孔内。逆时针转动预处理孔孔盖，盖上预处理孔。

中文-测序芯片预处理上样8

中文-测序芯片预处理上样9

重要

为获得最佳测序产出，在文库样本上样后，请立即在测序芯片上安装遮光片。

我们建议在清洗芯片并重新上样时，将遮光片保留在测序芯片上。一旦文库从测序芯片中吸出，即可取下遮光片。

按下述步骤安装测序芯片遮光片：

  1. 小心将遮光片的前沿（平端）与金属固定夹的边沿对齐。 请注意： 请勿将遮光片强行压到固定夹下方。

  2. 将遮光片轻轻盖在测序芯片上。遮光片的SpotON加样孔孔盖缺口应与芯片上的SpotON加样孔孔盖接合，遮盖住整个测序芯片的前部。

MinION加装遮光片

注意

MinION测序芯片的遮光片并非固定在测序芯片上，因此当为芯片加装遮光片后，请小心操作。

步骤结束

小心合上测序设备上盖并在MinKNOW上设置测序实验。

8. 数据采集和碱基识别

纳米孔数据分析概览

有关纳米孔数据分析的完整概述，包括碱基识别和次级分析，请参阅 数据分析 文档。

如何开始测序

MinKNOW软件负责仪器控制，数据采集和实时碱基识别。如您已在计算机上安装MinKNOW，则可选择以下几种途径开展测序：

1. 使用计算机上的MinKNOW进行实时数据采集和碱基识别

请按照 MinKNOW 实验指南 的说明：从“开始测序”部分起，到“MinKNOW运行结束”部分止。

2. 使用GridION进行实时数据采集和碱基识别

请参照 GridION 用户手册 中的说明。

3. 使用MinION Mk1C测序仪进行实时数据采集和碱基识别

请参照 MinION Mk1C 使用指南中的说明。

4. 使用PromethION测序仪进行实时数据采集和碱基识别

请参照 PromethION 使用指南 或 PromethION 2 Solo 使用指南中的说明。

5. 使用计算机上的MinKNOW进行数据采集，过后再用NinKNOW进行线下碱基识别

请按照 MinKNOW 实验指南 中的说明：从“开始测序”部分起，到“MinKNOW运行结束”部分止。 当您设置实验参数时，请将 碱基识别 选项设为“关”。 测序实验结束后，请按照 MinKNOW 实验指南的本地分析 部分操作。

9. 下游分析

下游分析

您可以选择以下几个途径来进一步分析经过碱基识别的数据：

1. EPI2ME 工作流程

Oxford Nanopore Technologies通过EPI2ME Labs平台提供了一系列针对高阶数据分析的生物信息学教程和工作流程。上述资源汇总于纳米孔社区的 EPI2ME Labs 板块。该平台通过描述性文字、生物信息学代码和示例数据，具象化地展示出我们的研究和应用团队发布在 GitHub 上的工作流程。

2. 科研分析工具

Oxford Nanopore Technologies的研发部门开发了许多分析工具，您可在Oxford Nanopore的 GitHub 资料库中找到。这些工具面向有一定经验的用户，并包含如何安装和运行软件的说明。工具以源代码形式提供，因此我们仅提供有限的技术支持。

3. 纳米孔社区用户开发的分析工具

如果以上工具仍无法为您提供解决研究问题的分析方法，请参考资源中心的生物信息学板块。该板块汇总了许多由纳米孔社区成员开发、且在Github上开源的、针对纳米孔数据的生信分析工具。请注意，Oxford Nanopore Technologies不为这些工具提供支持，也不能保证它们与测序所用的最新的化学试剂/软件配置兼容。

10. 测序芯片的重复利用及回收

材料
  • 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）

完成测序实验后，如您希望再次使用测序芯片，请按照测序芯片清洗试剂盒的说明进行操作，并将清洗后的芯片置于2-8℃保存。

您可在纳米孔社区获取 测序芯片清洗试剂盒实验指南。

提示

我们建议您在停止测序实验后尽快清洗测序芯片。如若无法实现，请将芯片留在测序设备上，于下一日清洗。

请按照“回收程序”清洗好芯片，以便送回Oxford Nanopore。

您可在 此处找到回收测序芯片的说明。

请注意： 在将测序芯片寄回之前，请使用去离子水对每张芯片进行冲洗。

重要

如果您遇到问题或对测序实验有疑问，请参阅本实验指南在线版本中的“疑难解答指南”一节。

11. DNA/RNA提取和文库制备过程中可能出现的问题

以下表格列出了常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的“Support”板块 提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮(support@nanoporetech.com)）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们。

低质量样本

现象 可能原因 措施及备注
低纯度DNA（Nanodrop测定的DNA吸光度比值260/280<1.8，260/230 <2.0-2.2） 用户所使用的DNA提取方法未能达到所需纯度 您可在 污染物专题技术文档 中查看污染物对后续文库制备和测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法。

请考虑将样品再次用磁珠纯化。
RNA完整度低（RNA完整值（RIN）<9.5，或rRNA在电泳凝胶上的条带呈弥散状） RNA在提取过程中降解 请尝试其它 RNA 提取方法。您可在 RNA完整值专题技术文档 中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅 DNA/RNA 操作 页面。
RNA的片段长度短于预期 RNA在提取过程中降解 请尝试其它 RNA 提取方法。 您可在 RNA完整值专题技术文档中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅DNA/RNA 操作 页面。

我们建议用户在无RNA酶污染的环境中操作，并确保实验设备没有受RNA酶污染.

经AMPure磁珠纯化后的DNA回收率低

现象 可能原因 措施及备注
低回收率 AMPure磁珠量与样品量的比例低于预期，导致DNA因未被捕获而丢失 1. AMPure磁珠的沉降速度很快。因此临加入磁珠至样品前，请确保将磁珠重悬充分混匀。

2. 当AMPure磁珠量与样品量的比值低于0.4:1时，所有的DNA片段都会在纯化过程中丢失。
低回收率 DNA片段短于预期 AMPure磁珠量与样品量的比值越低，针对短片段的筛选就越严格。每次实验时，请先使用琼脂糖凝胶（或其他凝胶电泳方法）确定起始DNA的长度，并据此计算出合适的AMPure磁珠用量。 SPRI cleanup
末端修复后的DNA回收率低 清洗步骤所用乙醇的浓度低于70% 当乙醇浓度低于70%时，DNA会从磁珠上洗脱下来。请确保使用正确浓度的乙醇。

12. 测序过程中可能出现的问题

以下表格列出了常见问题，以及可能的原因和解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的“Support”板块 提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮(support@nanoporetech.com)）或微信公众号在线支持（NanoporeSupport）联系我们。

Mux扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 纳米孔阵列中引入了气泡 在对通过质控的芯片进行预处理之前，请务必排出预处理孔附近的气泡。否则，气泡会进入纳米孔阵列对其造成不可逆转地损害。 视频中演示了避免引入气泡的最佳操作方法。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 测序芯片没有正确插入测序仪 停止测序，将芯片从测序仪中取出，再重新插入测序仪内。请确保测序芯片被牢固地嵌入测序仪中，且达到目标温度。如用户使用的是GridION/PromethION测序仪，也可尝试将芯片插入仪器的其它位置进行测序。
inKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 文库中残留的污染物对纳米孔造成损害或堵塞 在测序芯片质检阶段，我们用芯片储存缓冲液中的质控DNA分子来评估活性纳米孔的数量。而在测序开始时，我们使用DNA文库本身来评估活性纳米孔的数量。因此，活性纳米孔的数量在这两次评估中会有约10%的浮动。

如测序开始时报告的孔数明显降低，则可能是由于文库中的污染物对膜结构造成了损坏或将纳米孔堵塞。用户可能需要使用其它的DNA/RNA提取或纯化方法，以提高起始核酸的纯度。您可在 污染物专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法 。

MinKNOW脚本失败

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示 "Script failed”（脚本失败）
重启计算机及MinKNOW。如问题仍未得到解决，请收集 MinKNOW 日志文件 并联系我们的技术支持。 如您没有其他可用的测序设备，我们建议您先将装有文库的测序芯片置于4°C 储存，并联系我们的技术支持团队获取进一步储存上的建议。

纳米孔利用率低于40%

现象 可能原因 措施及备注
纳米孔利用率<40% 测序芯片中的文库量不足 请确保您按照相应实验指南，向测序芯片中加入正确浓度和体积的测序文库。请在上样前对文库进行定量，并使用 Promega Biomath Calculator 等工具中的“ dsDNA：µg to pmol”功能来计算DNA分子的摩尔量。
纳米孔利用率接近0 使用连接测序试剂盒，但接头并未与DNA成功连接 请确保您在“测序接头连接”步骤中使用的是NEBNext快速连接模块（E6056），以及SQK-LSK114试剂盒中的连接缓冲液（LNB）。同时，请确保每种试剂的用量正确。您可通过制备Lambda对照文库来检验第三方试剂的可用性。
纳米孔利用率接近0 使用连接测序试剂盒；但在接头连接后的纯化步骤中并未使用LFB 或SFB洗涤，而是使用了酒精 酒精可导致测序接头上的马达蛋白变性。请确保在测序接头连接后使用LFB或SFB。
纳米孔利用率接近0 测序芯片中无系绳 系绳是随着预处理液加至芯片的（试剂盒9、10和11系列对应冲洗系绳FLT；试剂盒14系列对应测序芯片系绳FCT）。请确保您在制备预处理液时，按需将FLT或FCT加入冲洗缓冲液（对应试剂盒9、10和11系列）或测序芯片冲洗液（对应试剂盒14系列）中。

读长短于预期

现象 可能原因 措施及备注
读长短于预期 DNA样本降解 读长反映了起始DNA片段的长度。起始DNA在提取和文库制备过程中均有可能被打断。

1. 1. 请查阅纳米孔社区中的 提取方法 以获得最佳DNA提取方案。

2. 在进行文库制备之前，请先跑电泳，查看起始DNA片段的长度分布。DNA gel2 在上图中，样本1为高分子量DNA，而样本2为降解样本。

3. 在制备文库的过程中，请避免使用吹打或/和涡旋振荡的方式来混合试剂。轻弹或上下颠倒离心管即可。

大量纳米孔处于不可用状态

现象 可能原因 Comments and actions
大量纳米孔处于不可用状态 (在通道面板和纳米孔活动状态图上以蓝色表示)

image2022-3-25 10-43-25 上方的纳米孔活动状态图显示：状态为不可用的纳米孔的比例随着测序进程而不断增加。		 样本中含有污染物 使用MinKNOW中的“Unblocking”（疏通）功能，可对一些污染物进行清除。 如疏通成功，纳米孔的状态会变为"测序孔". 若疏通后，状态为不可用的纳米孔的比例仍然很高甚至增加：

1. 用户可使用 测序芯片冲洗试剂盒（EXP-WSH004）进行核酸酶冲洗 can be performed, 操作，或
2. 使用PCR扩增目标片段，以稀释可能导致问题的污染物。

大量纳米孔处于失活状态

现象 可能原因 措施及备注
大量纳米孔处于失活状态（在通道面板和纳米孔活动状态图上以浅蓝色表示。膜结构或纳米孔遭受不可逆转地损伤） 测序芯片中引入了气泡 在芯片预处理和文库上样过程中引入的气泡会对纳米孔带来不可逆转地损害。请观看 测序芯片的预处理及上样 视频了解最佳操作方法。
大量纳米孔处于失活/不可用状态 文库中存在与DNA共纯化的化合物 与植物基因组DNA相关的多糖通常能与DNA一同纯化出来。

1. 请参考 植物叶片DNA提取方法。
2. 使用QIAGEN PowerClean Pro试剂盒进行纯化。
3. 利用QIAGEN REPLI-g试剂盒对原始gDNA样本进行全基因组扩增。
大量纳米孔处于失活/不可用状态 样本中含有污染物 您可在 污染物专题技术文档 中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法。

温度波动

现象 可能原因 措施及备注
温度波动 测序芯片和仪器接触不良 检查芯片背面的金属板是否有热垫覆盖。重新插入测序芯片，用力向下按压，以确保芯片的连接器引脚与测序仪牢固接触。如问题仍未得到解决，请联系我们的技术支持。

未能达到目标温度

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示“未能达到目标温度” 测序仪所处环境低于标准室温，或通风不良（以致芯片过热） MinKNOW会限定测序芯片达到目标温度的时间。当超过限定时间后，系统会显示出错信息，但测序实验仍会继续。值得注意的是，在错误温度下测序可能会导致通量和数据质量（Q值）降低。请调整测序仪的摆放位置，确保其置于室温下、通风良好的环境中后，再在MinKNOW中继续实验。有关MinION MK1B温度控制的更多信息，请参考此 FAQ （常见问题）文档。

Last updated: 8/21/2024

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