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直接 RNA 测序 - 条形码混样建库（SQK-DRB004.24） (DRB_9230_v4_revA_26May2026)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

直接 RNA 测序 - 条形码混样建库（SQK-DRB004.24） V DRB_9230_v4_revA_26May2026

本实验指南具有以下特点：

  • 适用于天然 RNA 的混样测序
  • 可使用两类 RNA 作为起始材料：经 poly(A)+ 富集的 RNA 样品，或经 poly(A) 加尾处理的体外转录（IVT）转录本样品
  • 无需片段化
  • 已针对以下混样规模进行优化： 4–8 个经 poly(A)+ 富集的 RNA 样品，或 12-24 个经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本样品
  • 文库制备约需 ~360 分钟
  • 仅与 RNA 测序芯片兼容

仅供科研使用

FOR RESEARCH USE ONLY.

概览

本实验指南具有以下特点：

  • 适用于天然 RNA 的混样测序
  • 可使用两类 RNA 作为起始材料：经 poly(A)+ 富集的 RNA 样品，或经 poly(A) 加尾处理的体外转录（IVT）转录本样品
  • 无需片段化
  • 已针对以下混样规模进行优化： 4–8 个经 poly(A)+ 富集的 RNA 样品，或 12-24 个经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本样品
  • 文库制备约需 ~360 分钟
  • 仅与 RNA 测序芯片兼容

仅供科研使用

Document version: DRB_9230_v4_revA_26May2026

1. 实验方案概览

更新 MinKNOW 26.01 中直接 RNA 测序的链分类规则

MinKNOW 26.01 更新了 RNA 链分类规则，提升了测序性能，同时提高了用户界面及测序实验报告结果的准确性。

变更内容

在较早版本的 MinKNOW（25.09 及之前）中，堵塞孔（在易堵孔样本中尤为常见）可能被误判为处于有效测序状态，从而导致以下问题：

  • 测序过程中质量分数（Q 值）逐步下降；
  • 在测序后期的孔扫描中，错误地报告较高的孔利用率；
  • 堵塞孔未能被及时识别和清理，进而限制整体测序产出。

在 MinKNOW 26.01 中，该问题已通过改进堵塞孔的识别机制得到修正。

该更新将带来哪些影响？

  • 孔扫描将更准确地反映真实的可用孔数量；
  • 堵塞孔将被更有效地识别和清理；
  • 在部分实验中，测序性能有望得到提升。

上述改进将影响所有测序实验，但在易堵孔样本中尤为明显。对于非易发生堵孔的样本，通常变化较小或不明显。

请注意： 您可能会在 MinKNOW 用户界面和报告中看到 纳米孔利用率有所下降 。这一变化源于测量方法的校正，并不代表实际测序性能的下降。


更多有关 MinKNOW 26.01 更新的信息，请参阅发布说明：

请确保您始终使用本方案的最新版本。

直接 RNA 条形码测序试剂盒的特点

本试剂盒适用于：

  • 多达 24 个天然 RNA 样本的混样测序
  • 解析天然 RNA 的分子特征信息（如碱基修饰）
  • 避免引入逆转录或 PCR 偏倚
  • 难以进行逆转录的转录本

直接 RNA 条形码混样建库测序实验指南简介

本实验指南详细描述了使用直接 RNA 条形码测序试剂盒-24（SQK-DRB004.24）对天然 RNA 进行混样测序的操作流程及常见问题的解决方法。使用经 poly(A)+ 富集的 RNA 或经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本作为起始材料。首先，将逆转录条形码与样本连接，然后合并各样本。随后，对带有条形码的样本进行逆转录，合成第一链 cDNA，以增强天然 RNA 链的稳定性。接着，通过 USER 消化反应去除未正确连接到 RNA 的逆转录条形码突出端，以避免条形码交叉污染。接着，将测序接头与 RNA-cDNA 杂交链连接，以便在 MinION™/GridION™ 或PromethION™ RNA 测序芯片（分别为 FLO-MIN004RA 和 FLO-PRO004RA）上测序。需要注意的是，cDNA 互补链只起到提高 RNA 测序产出的作用，不会被测序。

您可首先使用 RNA 参照品（RCS）作为起始样本完成一次对照实验，以熟悉此项技术。

测序工作流程：

实验准备

您将需要：

  • 提取RNA，并评估其长度、浓度和纯度。 质量评估步骤对确保实验成功至关重要。

请注意： 请确保 RNA 浓度足够，以满足每个样本可配制为 5 µl 含有 450 fmol RNA 的要求。

提示： 如使用 NEBNext® High Input Poly(A) mRNA Isolation Module（NEBNext 高起始量 Poly(A) mRNA 分离试剂盒），建议将样本的洗脱体积降低至 7 µl，以提高样本浓度。该体积可满足后续分配需求：其中 1 µl 用于片段分析质检，1 µl 用于定量，剩余 5 µl 用于文库制备。

请注意： 所需 RNA 的用量取决于 RNA 的长度。建议您使用 NEBioCalculator 或类似工具计算样本所需的起始 RNA 量。


  • 对 RNA 样本进行 poly(A)+ 筛选或转录本富集。
  • 确保您已准备好测序试剂盒、正确的仪器以及第三方试剂。
  • 下载数据收集和分析软件。
  • 检查您的测序芯片上有足够多的活性纳米孔，以确保测序良好运行。

文库制备

下表概述了文库制备所需的步骤，包括时间安排和可以中止的节点。

实验步骤 流程 时间 中止节点
逆转录条形码连接 连接逆转录条形码后，加入 EDTA 终止反应；随后合并样本并进行纯化。 ~90 分钟 完成此步骤后请直接进行下一步。
逆转录 合成 RNA 第一链以提高稳定性，并进行样本纯化 ~90分钟 完成此步骤后请直接进行下一步。
多余条码灭活处理 使用 USER 消化反应去除多余逆转录条形码（RTB）的突出端，并进行样本纯化 ~90 分钟 此阶段可将逆转录后的 RNA 于 -80°C 保存，以备后续使用。
测序接头连接及纯化 将测序接头连接至 RNA–cDNA 杂交分子末端 ~90 分钟 强烈建议在连接测序接头后立即进行文库测序。
测序芯片的预处理及上样 对测序芯片进行预处理，然后将制备好的文库加至芯片中进行测序 10分钟

Chinese_Direct_RNA_barcoding_workflow_with_pause_17March26

测序和分析

您将需要：

  • 使用 MinKNOW™ 软件运行测序，该软件将收集由测序仪产出的原始数据并将其识别为碱基序列。

直接 RNA 条形码测序试剂盒样本与混样测序的注意事项

混样测序的样本数量取决于您对数据产出和覆盖度的需求。请结合测序芯片的总产出，合理调整样本数量。

我们建议您从以下配置开始：

  • 对于经 poly(A)+ 富集的 RNA 样本，建议进行4–8个样本的混样测序；
  • 对于经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本， 建议进行12个样本的混样测序；根据转录本长度及覆盖度需求，可增加至最多24个样本。

我们不建议您在同一次测序实验中同时使用经 poly(A)+ 富集的 RNA 样本和经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本。

请注意，直接 RNA 条形码测序试剂盒-24（SQK-DRB004.24）尚未针对总 RNA 样本进行优化。使用总 RNA 时，无法保证测序表现，且测序产出可能降低。

与 DNA 测序不同，RNA 序列通过纳米孔的方向是从 3’ 端到 5’ 端。但碱基识别算法会自动翻转数据，因此序列片段仍以5'-3'的形式显示。

实验方案适用性

本实验方案只适用于与以下产品搭配使用：

2. 仪器及耗材

材料
  • 直接 RNA 条形码测序试剂盒-24（SQK-DRB004.24）
  • 450 fmol 经 poly(A)+ 富集的 RNA 样品，或 450 fmol 经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本 RNA 样品
耗材
  • MinION/GridION RNA 测序芯片 (FLO-MIN004RA) 或 PromethION RNA 测序芯片 (FLO-PRO004RA)
  • T3 DNA 连接酶（NEB，M0317）
  • Induro® 逆转录酶 和 5x Induro® 逆转录反应缓冲液（NEB，M0681）
  • 小鼠 RNase 抑制剂（NEB，M0314）
  • USER （尿嘧啶-特异性切除试剂) 酶（NEB, M5505L）
  • Agencourt RNAClean XP 磁珠 （Beckman Coulter®，A63987）
  • 10mM 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）溶液（例如 NEB N0447）
  • 5M 无 RNA 酶的氯化钠溶液（ThermoFisher，10609823 或等效产品）
  • NEBNext 高起始量 Poly(A) mRNA 分离试剂盒（NEB，E3370）
  • 无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
  • Qubit™ RNA HS Assay（RNA 高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32852）
  • Qubit™ dsDNA HS Assay（双链 DNA 高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32851）
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
  • 0.2 ml 薄壁 PCR 离心管 或 0.2 ml 96 孔 PCR 板
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • PCR 封板膜
仪器
  • MinION、GridION 或 PromethION 测序设备
  • MinION/GridION 测序芯片遮光片 或 PromethION 测序芯片遮光片
  • 涡旋混匀仪
  • 迷你离心机
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 适用于1.5ml Eppendorf 离心管的磁力架
  • Eppendorf 5424 离心机（或等效器材）
  • 盛有冰的冰桶
  • 计时器
  • 热循环仪
  • Qubit™ 荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2 移液枪和枪头

本流程中，每个样本需使用 5 µl RNA：其中应含约 450 fmol 的经 poly(A)+ 富集的 RNA，或约 450 fmol 的经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本 RNA 。

请注意： 请确保 RNA 浓度足够，以满足每个样本可配制为 5 µl 含有 450 fmol RNA 的要求。

提示： 如使用 NEBNext® High Input Poly(A) mRNA Isolation Module（NEBNext 高起始量 Poly(A) mRNA 分离试剂盒），建议将样本的洗脱体积降低至 7 µl，以提高样本浓度。该体积可满足后续使用需求：其中 1 µl 用于片段分析质检，1 µl 用于定量，剩余 5 µl 用于文库制备。

所需 RNA 量取决于 RNA 长度。您可使用低于推荐值的起始样本量，但测序产出可能降低。

建议您使用 NEBioCalculator 或类似工具计算样本所需的起始量。

请注意： 该方法尚未在以总 RNA 为起始材料的条件下进行验证。使用总 RNA 作为起始材料时，可能导致结果不稳定、产量降低及测序产出下降。

起始 RNA

选择符合质量和浓度要求的起始 RNA 至关重要。使用过少或过多的 RNA，或者质量较差的 RNA（如碎片化或含有化学污染物）都会影响文库的制备。

有关如何对 RNA 样品进行质控，请参考起始 DNA/RNA 质控实验指南。

有关使用RNA作为起始材料的更多信息，请参阅以下链接：

您亦可在纳米孔社区的 DNA/RNA Handling 页面找到上述文件。

我们建议您使用 NEBNext® High Input Poly(A) mRNA Isolation Module（NEBNext 高起始量 Poly(A) mRNA 分离试剂盒，E3370S）分离带 poly(A)尾的 RNA 样本。其他方法可能适用，但尚未经过内部团队验证。

第三方试剂

Oxford Nanopore Technologies 推荐您使用本实验指南中列出的所有第三方试剂，并已对其进行验证。我们尚未对其它替代试剂进行测试。

我们建议您按制造商说明准备待用的第三方试剂。

测序芯片质检

我们强烈建议您在开始测序实验前，对测序芯片的活性纳米孔数进行质检。质检需在您收到 MinION/GridION/PremethION RNA 测序芯片 12 周内进行。Oxford Nanopore Technologies 会对活性孔数量少于以下标准、且尚未投入测序使用的芯片进行替换*：请您按照测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。

测序芯片 芯片上的活性孔数确保不少于
MinION/GridION RNA 测序芯片 800
PromethION RNA 测序芯片 5000

*（请注意：自收到之日起，芯片须一直贮存于 Oxford Nanopore Technologies 推荐的条件下。且质检结果须在质检后的两日内递交给我们。）

直接 RNA 条形码测序试剂盒-24（SQK-DRB004.24）内容物

直接 RNA 条形码测序试剂盒-24（SQK-DRB004.24）包含 24 种条形码，并可支持最多 6 次建库反应。

SQK-DRB00424_Kit_content

名称 缩写 管盖颜色 管数 每管溶液体积 (μl)
RNA 条形码接头 RBA 绿色 1 45
RNA 洗脱缓冲液 REB 棕色 1 300
置换链 DS 橙色 1 10
测序缓冲液 SB 红色 1 700
文库溶液 LIS 白色瓶盖，粉色标签 1 600
EDTA EDTA 蓝色 1 700
RNA 冲洗系绳 RFT 紫色 1 200
短片段缓冲液 SFB 透明瓶 1 13,000
测序芯片冲洗液 FCF 透明瓶盖，浅蓝色标签 1 8,000
逆转录条形码孔板 RTB01-24 - 两板，每板三套条形码组合 每孔 5µl

3. 逆转录条形码（RTB）连接

材料
  • 450 fmol 经 poly(A)+ 富集的 RNA 样品，或 450 fmol 经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本 RNA 样品
  • 逆转录条形码（RTB）
  • EDTA（EDTA）
  • 短片段缓冲液（SFB）
耗材
  • T3 DNA 连接酶（NEB，M0317）
  • Agencourt RNAClean XP 磁珠 （Beckman Coulter®，A63987）
  • 无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
  • 0.2 ml 薄壁 PCR 离心管 或 0.2 ml 96 孔 PCR 板
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
  • 涡旋混匀仪
  • 迷你离心机
  • 热循环仪
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 磁性分离架
  • 盛有冰的冰桶
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2 移液枪和枪头

测序芯片质检

我们建议您在开始文库制备之前，对测序芯片的活性纳米孔数量进行质检，以确保其足够支持实验的顺利进行。

请您按照测序芯片质检文档中的说明进行芯片质检。

按下表制备试剂：

试剂 1.于室温下解冻 2.混匀方法 3.瞬时离心 4.使用前请始终置于冰上保存
T3 DNA 连接酶 未冻结，直接置于冰上。 请勿 涡旋振荡。 ✓ ✓
StickTogether™ DNA 连接酶缓冲液 ✓ 涡旋振荡混匀 ✓ ✓
EDTA ✓ 涡旋振荡混匀 ✓ ✓
短片段缓冲液（SFB） ✓ 涡旋振荡混匀 ✓ ✓
逆转录条形码（RTB） ✓ 使用微孔板振荡器混匀，或拍打孔板混匀；也可对所用孔逐个吹打混匀 ✓ ✓

注意： StickTogether DNA 连接酶缓冲液中可能存在少量沉淀。待缓冲液恢复至室温后，使用移液枪上下吹打数次，打散沉淀；然后将离心管涡旋振荡数秒，确保试剂充分混匀。

逆转录条形码（RTB）板孔仅限一次性使用。使用前请确认所选孔密封完好；一旦刺穿或开启，不得再次使用。

直接 RNA 条形码测序试剂盒样本与混样测序的注意事项

混样测序的样本数量取决于您对数据产出和覆盖度的需求。请结合测序芯片的总产出，合理调整样本数量。

我们建议您从以下配置开始：

  • 对于经 poly(A)+ 富集的 RNA 样本，建议进行4–8个样本的混样测序；
  • 对于经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本， 建议进行12个样本的混样测序；根据转录本长度及覆盖度需求，可增加至最多24个样本。

我们不建议您在同一次测序实验中同时使用经 poly(A)+ 富集的 RNA 样本和经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本。

请注意，直接 RNA 条形码测序试剂盒-24（SQK-DRB004.24）尚未针对总 RNA 样本进行优化。使用总 RNA 时，无法保证测序表现，且测序产出可能降低。

为计划上样于同一测序芯片的各样本选择不同的逆转录条形码（RTB）。

请注意： 一个实验最多可为24个样本添加条码并混样测序。每个样本应仅对应一种条形码。

使用无核酸酶水稀释 RNA 样本：

  • 取约 450 fmol 经 poly(A)+ 富集的 RNA 或 经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本样品，分别转移至 0.2 ml 薄壁 PCR 管或 PCR 板的各孔中。
  • 如不足5 μl，请加入无核酸酶水补足。
  • 为避免不必要的打断，请轻柔吹打或轻弹离心管以充分混匀。
  • 使用迷你离心机瞬时离心。

在含 RNA 样本的 0.2 ml PCR 管或 96 孔板中，按以下顺序向各管/孔加入试剂：

试剂 体积
前一步骤所得 RNA 样品 5 µl
StickTogether 连接酶缓冲液（2x） 7.5 µl
逆转录条形码（RTB） 1 µl
T3 DNA 连接酶 1.5 µl
总体积 15 µl

轻弹 PCR 管/孔板以充分混匀，并瞬时离心。

在 25°C 条件下于热循环仪中孵育 20 分钟。

将反应从热循环仪中取出。

向每个样品中加入 1 μl EDTA，轻弹 PCR 管/孔板以充分混匀反应体系，随后对样品瞬时离心。

在此步骤中添加 EDTA 的目的是终止反应。

请注意： 不进行该步骤会增加条形码交叉污染的风险。

将反应体系于室温下孵育 5 分钟。

将样品瞬时离心。于一支洁净的 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管中，混合各已连接逆转录条形码的样本。

涡旋振荡以重悬 RNAClean AMPure XP 磁珠。

向合并的样本中加入等体积（1×体积）的 RNAClean AMPure XP 磁珠，轻弹离心管以充分混合。

请根据混样样本数量，参照下表所示体积：

混样样本数量 合并后样本总体积 加入到样本中的磁珠体积 管内终体积
4 64 µl 64 µl 128 µl
6 96 µl 96 µl 192 µl
8 128 µl 128 µl 256 µl
12 192 µl 192 µl 384 µl
24 384 µl 384 µl 768 µl

将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育10分钟。

短暂涡旋振荡短片段缓冲液（SFB）。

将合并后的样品从 Hula 混匀仪上取下，短暂离心后，置于磁力架上沉淀 5–10 分钟。将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色，吸出上清。

提示： 去除上清时，可留约 10 μl 不要吸出，以避免扰动磁珠。

加入 500 μl 短片段缓冲液（SFB）洗涤磁珠。轻弹离心管将磁珠混匀后，将离心管瞬时离心，再放回磁力架，静置至少 5 分钟，待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸出缓冲液并弃去。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用 P20 移液枪吸走残留的缓冲液。

让磁珠在空气中干燥约 30 秒，但不要干至表面开裂。

将离心管从磁力架上取下，并按以下说明使用无核酸酶水重悬沉淀。轻弹离心管混匀，然后瞬时离心。

请根据混样样本数量，参照下表所示体积：

混样样本数量 用于洗脱的无核酸酶水体积
1–8 28 µl
9–16 56 µl
17–24 84 µl

室温下孵育 10 分钟。

将离心管置于磁力架上5分钟，直至磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将全部洗脱液转移至一支新的 1.5ml Eppendorf DNA LoBind 管中。

连接有逆转录条形码的 RNA 样本即可用于后续的逆转录步骤。

4. 逆转录

材料
  • 连接有逆转录条形码的 RNA 样本
  • 短片段缓冲液（SFB）
耗材
  • Induro® 逆转录酶 和 5x Induro® 逆转录反应缓冲液（NEB，M0681）
  • 10mM 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）溶液（例如 NEB N0447）
  • 小鼠 RNase 抑制剂（NEB，M0314）
  • Agencourt RNAClean XP 磁珠 （Beckman Coulter®，A63987）
  • 无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
  • 0.2 ml 薄壁PCR管
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
  • 涡旋混匀仪
  • 迷你离心机
  • 热循环仪
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 磁性分离架
  • 盛有冰的冰桶
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2 移液枪和枪头

按下表制备试剂：

试剂 1.于室温下解冻 2.瞬时离心 3.吹打混匀 4.使用前请始终置于冰上保存
Induro 逆转录反应缓冲液 (5x) ✓ ✓ ✓ ✓
10 mM dNTP 溶液 ✓ ✓ ✓ ✓
鼠源 RNase 抑制剂 ✓ ✓ ✓ ✓
Induro 逆转录酶 ✓ ✓ ✓ ✓
短片段缓冲液（SFB） ✓ ✓ ✓ 不需要

当混样样本数超过8个时，需将混合后的样本分成多个逆转录反应进行，以确保最适样本与试剂比例。

请按照以下步骤进行操作。

在洁净的 0.2 ml PCR 管中，按下表配制逆转录反应预混液：

试剂 不超过 8 个样本（1 个反应体系） 9–16 个样本（2 个反应体系） 17–24 个样本（3 个反应体系）
Induro RT 缓冲液（5×） 8 µl 16 µl 24 µl
10 mM dNTP 溶液 2 µl 4 µl 6 µl
鼠源 RNase 抑制剂 0.4 µl 0.8 µl 1.2 µl
总体积 10.4 µl 20.8 µl 31.2 µl

吹打混匀后，瞬时离心。

在洁净的 0.2 ml PCR 管中，按下表制备逆转录反应：

试剂 不超过 8 个样本（1 个反应体系） 9–16 个样本（2 个反应体系） 17–24 个样本（3 个反应体系）
每个反应中加入的带条码样本总体积 28 µl 28 µl 28 µl
前一步骤所得逆转录反应预混液 10.4 µl 10.4 µl 10.4 µl
每个反应的总体积 38.4 µl 38.4 µl 38.4 µl
反应总数 1 2 3

向每个逆转录反应中加入 2 μl Induro 逆转录酶。轻轻吹打直至样品充分混匀。

请注意，所需反应数量取决于混样样本的数量：

  • ≤8 个样本：1 个反应
  • 9–16 个样本：2 个反应
  • 17–24 个样本：3 个反应

将反应体系置于热循环仪中孵育：60°C 30 分钟，随后 70°C 10 分钟。

将样品转移至一支洁净的 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 管中。

请注意： 若使用超过 8 个带条形码样本，并已将逆转录反应分为多个进行，请在反应结束后将所有反应体系合并至同一离心管中。

样本数量 合并反应数 反应合并后的总体积
1–8 个样本 1 40.4 µl
9–16 个样本 2 80.8 µl
17–24 个样本 3 121.2 µl

涡旋振荡以重悬 RNAClean AMPure XP 磁珠。

向合并后的样品中加入 1.5×体积的 RNAClean AMPure XP 磁珠，轻弹离心管以充分混匀。

将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育10分钟。

短暂涡旋振荡短片段缓冲液（SFB）。

将合并后的样品从 Hula 混匀仪上取下，短暂离心后，置于磁力架上沉淀 5–10 分钟。将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色，吸出上清。

提示：去除上清时，可留约 10 μl 不要吸出，以避免扰动磁珠。

加入150 μl 短片段缓冲液（SFB）洗涤磁珠。轻弹离心管将磁珠混匀后，将离心管瞬时离心，再放回磁力架，静置待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸出缓冲液并弃去。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用 P20 移液枪吸走残留的缓冲液。

让磁珠在空气中干燥约 30 秒，但不要干至表面开裂。

将离心管从磁力架上移开。将磁珠重悬于 41 µl 无核酸酶水中。轻弹离心管以混匀，然后瞬时离心。

室温下孵育洗脱液 10 分钟。

将离心管置于磁力架上5分钟，直至磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将全部洗脱液转移至一支新的 1.5ml Eppendorf DNA LoBind 管中。

取 1μl 洗脱样品，用 Qubit 荧光计和 Qubit dsDNA HS Assay （双链DNA高灵敏度检测）试剂盒定量。

  • 对于经 poly(A)+ 富集的 RNA 样品：在 4 个样本混样时，预期总回收量为 400–600 ng。

  • 对于经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本样品：在 12 个样本混样时，预期总回收量为 800–1000 ng。
  • 对于经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本样品：在 24 个样本混样时，预期总回收量为 1600–2000 ng。

逆转录后的样本即可用于后续的多于条码灭活处理步骤。

5. 多余条码灭活处理

材料
  • 逆转录后的 RNA 样本
  • 短片段缓冲液（SFB）
耗材
  • rCutSmart™ 缓冲液（NEB，B6004S）
  • USER （尿嘧啶-特异性切除试剂) 酶（NEB, M5505L）
  • Agencourt RNAClean XP 磁珠 （Beckman Coulter®，A63987）
  • 无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
  • 0.2 ml 薄壁PCR管
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • Qubit™ RNA HS Assay（RNA 高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32852）
  • Qubit™ dsDNA HS Assay （双链 DNA 高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32851）
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
仪器
  • 涡旋混匀仪
  • 迷你离心机
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 磁性分离架
  • Qubit™ 荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
  • 盛有冰的冰桶
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2 移液枪和枪头
  • Eppendorf 5424 离心机（或等效器材）
  • 恒温混匀仪或恒温加热仪

按下表制备试剂：

试剂 1.于室温下解冻 2.瞬时离心 3.吹打混匀 4.使用前请始终置于冰上保存
rCutSmart 试剂盒 ✓ ✓ ✓ 不需要
USER 酶 未冻结 ✓ ✓ ✓
短片段缓冲液（SFB） ✓ ✓ ✓ 不需要

在含有逆转录样品的离心管中配制反应体系：

可选： 您可直接在上一步含逆转录样本的 1.5 ml Eppendorf 离心管中配制反应体系。但如热循环仪或恒温加热仪仅支持 0.2 ml PCR 管，您可将样品转移至相应耗材中配置反应体系。

试剂 体积
前一步骤所得逆转录后的 RNA 样本 40 µl
rCutSmart 缓冲液 5 µl
USER 酶 5 µl
总体积 50 µl

37℃ 下孵育 30 分钟。

可选： 孵育结束后，如反应在 0.2 ml PCR 管中进行，建议将全部反应体系转移至一支洁净的 1.5 ml Eppendorf LoBind 离心管中，以进行后续纯化。

涡旋振荡以重悬 RNAClean AMPure XP 磁珠。

将 75 µl 重悬的 RNAClean AMPure XP 磁珠加入反应体系中，轻弹离心管混匀。

将离心管置于 Hula 混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育 10 分钟。

短暂涡旋振荡短片段缓冲液（SFB）。

将合并后的样品从 Hula 混匀仪上取下，短暂离心后，置于磁力架上沉淀 5–10 分钟。将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色，吸出上清。

提示： 去除上清时，可留约 10 μl 不要吸出，以避免扰动磁珠。

使用 150µl 短片段缓冲液（SFB）洗涤磁珠。轻弹离心管将磁珠充分混匀后，将离心管瞬时离心，再放回磁力架，静置待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸出缓冲液并弃去。

请注意： 请保留约 10 µl 缓冲液不要吸出，以避免扰动磁珠。

重复上述步骤。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的缓冲液。

让磁珠在空气中干燥约 30 秒，但不要干至表面开裂。

将离心管从磁力架上取下，将磁珠重悬于 21 µl 无核酸酶水中，轻弹离心管以混匀。

室温下孵育10分钟。

将离心管置于磁力架上 5 分钟，直至磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将 21µl 洗脱液转移至一支新的 1.5ml Eppendorf DNA LoBind 管中。

取 1μl 洗脱样品，用 Qubit 荧光计和 Qubit dsDNA HS Assay （双链DNA高灵敏度检测）试剂盒定量。

  • 对于经 poly(A)+ 富集的 RNA 样品：在 4 个样本混样时，预期总回收量为 300–500 ng。

  • 对于经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本样品：在 12 个样本混样时，预期总回收量为 450–650 ng。
  • 对于经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本样品：在 24 个样本混样时，预期总回收量为 900–1300 ng。

请注意： 测序接头连接步骤中可能无需使用全部 RNA 样本。请遵循下文建议，以优化反应效率并提高测序芯片纳米孔利用率，从而最大化测序产出。

本步骤剩余的RNA文库可在-80°C保存，以备后续需要时重新使用。

制备好的样本即可用于后续的测序接头连接步骤。

可在此处暂停：此时所得样品可在 -80 °C 下过夜保存。

6. 测序接头连接

材料
  • 逆转录及辅助链消化后的 RNA 样本
  • RNA 条形码接头（RBA）
  • RNA洗脱缓冲液（REB）
  • 短片段缓冲液（SFB）
  • 置换链（DS）
耗材
  • T3 DNA 连接酶（NEB，M0317）
  • 5M 无 RNA 酶的氯化钠溶液（ThermoFisher，10609823 或等效产品）
  • Agencourt RNAClean XP 磁珠 （Beckman Coulter®，A63987）
  • 无核酸酶水（如 Thermo Scientific，AM9937）
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
  • Qubit™ dsDNA HS Assay （双链 DNA 高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32851）
  • Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）
仪器
  • 涡旋混匀仪
  • 迷你离心机
  • 热循环仪
  • 恒温混匀仪或恒温加热仪
  • Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）
  • 磁性分离架
  • Qubit™ 荧光计（或用于质控检测的等效仪器）
  • 盛有冰的冰桶
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头
  • P10 移液枪和枪头
  • P2 移液枪和枪头
  • Eppendorf 5424 离心机（或等效器材）

按下表制备试剂：

试剂 1.于室温下解冻 2.瞬时离心 3.吹打混匀 4.使用前请始终置于冰上保存
StickTogether 连接酶缓冲液 ✓ ✓ ✓ ✓
T3 DNA 连接酶 未冻结 ✓ ✓ ✓
RNA 条形码接头（RBA） 未冻结 ✓ ✓ ✓
短片段缓冲液（SFB） ✓ ✓ ✓ 不需要
RNA 洗脱缓冲液（REB） ✓ ✓ ✓ 不需要
置换链（DS） ✓ ✓ ✓ ✓

请注意，下文测序接头连接步骤中推荐的 RNA 文库投入量基于内部测试获得的最佳测序结果。

  • 对于经 poly(A)+ 富集的 RNA 样品，相关测试基于约 2.4 kb 的经 poly(A) 筛选的通用人类参考 RNA（UHRR）；
  • 对于经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本样品，相关测试基于长度为 1–1.2 kb 的 IVT 转录本。

我们建议您在首次实验时采用下文推荐的投入量，后续可根据样本长度进一步优化。

在 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 管中，按以下步骤制备 RNA 文库：

1. 根据样本类型，按下表取相应量的 RNA 文库：

经 poly(A)+ 富集的 RNA 样品 经 poly(A) 加尾的 IVT 转录本样品
400 fmol 前一步所得 RNA 文库 1 pmol 前一步所得 RNA 文库

RNA 文库的摩尔量可根据 RNA 样本长度及多余条码灭活步骤结束时的定量结果计算。 建议您使用 NEBioCalculator 或类似工具计算样本所需的起始量。

2. 使用无核酸酶水将 RNA 文库补足至 20 µl。

在装有 RNA 文库的 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管中，按下表顺序加入试剂进行测序接头连接：

试剂 体积
上一步骤中的 RNA 样本（保留于原管中） 20 µl
StickTogether 连接酶缓冲液 30 µl
RNA 条形码接头（RBA） 6 µl
T3 DNA 连接酶 4 µl
总体积 60 µl

吹打混匀。

将反应置于热循环仪或恒温加热仪中，25°C 条件下孵育 30 分钟。

在洁净的 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管中，按以下方法配制 1.4 M NaCl，并吹打充分混匀：

试剂 体积
5M NaCl 14 µl
无核酸酶水 36 µl
1.4 M NaCl 总体积 50 µl

向连有测序接头的文库样本中加入 40 µl 1.4 M NaCl。

涡旋振荡以重悬 Agencourt RNAClean XP 磁珠。

向每个反应体系中加入 36 µl 重悬的 Agencourt RNAClean XP 磁珠，吹打混匀。

将离心管置于 Hula 混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育 10 分钟。

短暂涡旋振荡短片段缓冲液（SFB）。

将合并后的样品从 Hula 混匀仪上取下，短暂离心后，置于磁力架上沉淀 5–10 分钟。将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色，吸出上清。

提示：去除上清时，可留约 10 μl 不要吸出，以避免扰动磁珠。

使用 150µl 短片段缓冲液（SFB）洗涤磁珠。轻弹离心管将磁珠充分混匀后，将离心管瞬时离心，再放回磁力架，静置至少 5-10 分钟，待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸出缓冲液并弃去。

请注意： 请保留约 10 µl 缓冲液不要吸出，以避免扰动磁珠。

重复上述步骤。

将离心管瞬时离心后置于磁力架上。用移液枪吸走残留的缓冲液。

让磁珠在空气中干燥约 30 秒，但不要干至表面开裂。

将离心管从磁力架上取下。将磁珠重悬于 13µl RNA 洗脱缓冲液（REB）中，轻弹离心管以混匀。室温下孵育 10 分钟。

将离心管置于磁力架上 5 分钟，直至磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。

将 13µl 洗脱液转移至一支新的 1.5ml Eppendorf DNA LoBind 管中。

取 1μl RNA 文库，用 Qubit™ 荧光计和 Qubit™ dsDNA HS Assay （双链DNA高灵敏度检测）试剂盒定量。

  • 连接测序接头后的预期回收量：200–250 ng.

我们建议您将连有测序接头的 RNA 文库全量上样至测序芯片。

请注意： 若此步骤的回收量低于 150 ng，说明回收效率可能不理想，进而可能导致纳米孔利用率及测序产出低于预期。继续操作需谨慎；或回退至多余条码灭活步骤，使用此前保留的样品重新开始。

下述步骤中加入的置换链（DS）可大幅减少 RNA 文库中游离的测序接头。

可显著提高测序芯片上的纳米孔利用率和产出。

向 RNA 文库中加入 1 µl 置换链（DS）。 室温下孵育 5 分钟。

构建好的 RNA 文库即可用于测序芯片上样。

RNA 文库须立即测序，不宜保存备用。

7. MinION/GridION 测序芯片的预处理及上样

材料
  • 文库溶液（LIS）
  • 测序缓冲液（SB）
  • RNA 冲洗系绳（RFT）
  • 测序芯片冲洗液（FCF）
耗材
  • MinION/GridION RNA 测序芯片（FLO-MIN004RA）
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
  • MinION 或 GridION 测序仪
  • MinION/GridION 测序芯片遮光片
  • 涡旋混匀仪
  • 迷你离心机
  • P1000 移液枪和枪头
  • P200 移液枪和枪头
  • P100 移液枪和枪头
  • P20 移液枪和枪头

请注意：本试剂盒仅兼容 RNA 测序芯片（FLO-MIN004RA）。

从冰箱中取出测序芯片，在室温下放置 20 分钟，以便在预处理和上样时更清晰地观察到传感器阵列。

测序芯片的预处理及上样

我们推荐您在首次运行测序芯片前，观看视频测序芯片的预处理及上样。

于室温下解冻测序缓冲液（SB）、文库溶液（LIS）、RNA 冲洗系绳（RFT）和测序芯片冲洗液（FCF）。涡旋振荡混匀，必要时瞬时离心。

配制测序芯片预处理液：将下表试剂加入至 1.5 ml 的 Eppendorf 管中，涡旋振荡混匀，并瞬时离心。

试剂 体积（每张芯片）
RNA 冲洗系绳 (RFT) 30 µl
测序芯片冲洗液（FCF） 1,170 µl
总体积 1200 µl

打开 MinION 或 GridION 测序仪的盖子，将测序芯片插入金属固定夹的下方。用力向下按压预处理孔孔盖处，以确保正确的热、电接触。

中文-测序芯片预处理上样1a

中文-测序芯片预处理上样1b-11Dec24

为文库上样前，完成测序芯片质检，查看可用孔数目。

如此前已对测序芯片进行过质检，则此步骤可省略。

更多信息，请参阅测序芯片质检文档 。

顺时针转动测序芯片的预处理孔孔盖，使预处理孔显露出来。

中文-测序芯片预处理上样2

小心地从测序芯片中反旋吸出缓冲液。请勿吸出超过 20-30 µl的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。

将预处理孔打开后，检查孔周围是否有小气泡。请按照以下方法，从孔中排出少量液体以清除气泡：

1.将 P1000 移液枪转至 200µl 刻度。

2.将枪头垂直插入预处理孔中。

3.缓慢转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在 220-230µl 之间（即吸出 20-30µl 液体），或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。

注意： 肉眼检查，确保从预处理孔到传感器阵列的缓冲液连续且无气泡。

中文-测序芯片预处理上样3

通过预处理孔向芯片中加入 800µl 预处理液，避免引入气泡。等待5分钟。在此期间，请按照以下步骤准备用于上样的文库。

中文-测序芯片预处理上样4

在洁净的 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 管中，按以下步骤制备上样文库：

试剂 每张测序芯片的上样体积
测序缓冲液（SB） 37.5 µl
文库溶液 (LIS) 25.5 µl
全部体积的 RNA 文库 ~12 µl
总体积 75 µl

完成测序芯片的预处理：

  1. 轻轻地翻起 SpotON 上样孔盖，使 SpotON 上样孔显露出来。 中文-测序芯片预处理上样5
  2. 通过预处理孔（而 非 SpotON 加样孔）向芯片中加入 200µl 预处理液，避免引入气泡。 中文-测序芯片预处理上样6

临上样前，用移液枪轻轻吹打混匀制备好的文库。

通过 SpotON 加样孔向芯片中逐滴加入 75µl 制备好的文库。确保液滴流入孔内后，再加下一滴。

中文-测序芯片预处理上样7

轻轻合上 SpotON 加样孔孔盖，确保塞头塞入加样孔内。轻轻合上预处理孔盖。

中文-测序芯片预处理上样8

中文-测序芯片预处理上样9

为获得最佳测序产出，在文库样本上样后，请立即在测序芯片上安装遮光片。

我们建议在文库加样至测序芯片后（包括芯片清洗并重新加样时），将遮光片保留在测序芯片上。一旦文库从测序芯片中吸出，即可取下遮光片。

按下述步骤安装测序芯片遮光片：

1.小心将遮光片的前沿（平端）与金属固定夹的边沿对齐。 注意： 请勿将遮光片强行压到固定夹下方。

2.将遮光片轻轻盖在测序芯片上。遮光片的 SpotON 加样孔孔盖缺口应与芯片上的 SpotON 加样孔孔盖接合，遮盖住整个测序芯片的前部。

MinION加装遮光片

MinION测序芯片的遮光片并非固定在测序芯片上，因此当为芯片加装遮光片后，请小心操作。

合上测序设备上盖，在 MinKNOW 上设置测序实验。

当测序芯片插入 MinION Mk1D 测序仪后，仪器上盖会覆盖于芯片上方，但盖与芯片之间会留有一定空隙。此为正常现象，不影响设备性能。

请参阅此常见问题解答，了解有关测序仪上盖的更多信息。

MinION Mk1D with flow cell

8. 数据采集和碱基识别

如何开始测序

在完成测序芯片的加样后，您即可在 MinKNOW 中启动测序实验。MinKNOW 软件负责仪器控制、数据采集以及实时碱基识别。有关设置和使用 MinKNOW 的详细信息，请参阅MinKNOW 实验指南。

您可以通过多种方式使用并设置MinKNOW：

  • 在直接或远程连接到测序设备的计算机上。
  • 直接在 GridION 或 PromethION 24/48 测序设备上。

有关在测序设备上使用 MinKNOW 的更多信息，请参阅相应设备的用户手册：

在MinKNOW中启动测序：

1. 在 "开始 "（Start）页面上，选择 开始测序 （Start Sequencing）。

2. 输入实验详情：例如实验名称，测序芯片位置及样本ID。

3. 在"试剂盒"页面上，选择 直接 RNA 条形码测序试剂盒-24（SQK-DRB004.24）。

4. 在“实验配置”（Run Configuration）页面设置测序与输出参数，或保持默认值。

请注意： 如果在设置实验参数时关闭了碱基识别，您可在实验结束后，在 MinKNOW 中运行线下碱基识别。详情请参阅MinKNOW实验指南。

请注意： 运行设置中，默认不 生成 POD5 文件。如需在下游分析中使用 Dorado 分析 RNA 修饰，请在运行配置时 开启（ON）POD5 选项。

5. 单击 "参数确认" 页面上的 开始 （Start）启动测序。

测序后数据分析

当于MinKNOW上完成测序后，您可按照“测序芯片的重复利用及回收”一节中的说明重复使用或返还测序芯片。

完成测序和碱基识别后，即可进行数据分析。有关碱基识别和后续分析选项的详细信息，请参阅数据分析文档。

在下游分析部分，我们将概述更多用于数据分析的选项。

9. 测序芯片的重复利用及回收

测序芯片清洗试剂盒（EXP-WSH004 或 EXP-WSH004-XL）与直接 RNA 条形码测序试剂盒-24（SQK-DRB004.24）当前不兼容。

我们尚未验证测序芯片清洗试剂盒（EXP-WSH004 或 EXP-WSH004-XL）与直接 RNA 条形码测序试剂盒-24（SQK-DRB004.24）的兼容性；因此不建议或支持联合使用。

请按照回收程序将测序芯片返还至 Oxford Nanopore。

您可在 此处找到回收测序芯片的说明。

如果您遇到问题或对测序实验有疑问，请参阅本实验指南中“疑难解答指南”一节。

10. 下游分析

下游分析

您可以选择以下几个途径来进一步分析经过碱基识别的数据：

EPI2ME 工作流程

Oxford Nanopore Technologies 通过 EPI2ME 提供了一系列针对高阶数据分析的生物信息学教程和工作流程。该平台通过描述性文字、生物信息学代码和示例数据，具象化地展示出我们的研究和应用团队发布在 GitHub 上的工作流程。

科研分析工具

Oxford Nanopore Technologies 的研发部门开发了许多分析工具，您可在 Oxford Nanopore 的 GitHub 资料库中找到。这些工具面向有一定经验的用户，并包含如何安装和运行软件的说明。工具是以源代码的形式提供的，因此我们仅提供有限的技术支持。

纳米孔社区用户开发的分析工具

如上述资源未能提供满足您研究需求的数据分析方法，请前往资源中心，查找适用的生物信息学工具。该工具库汇总了各种第三方用户开发、且在 Github 上开源的、针对纳米孔数据的生信分析工具。请注意，Oxford Nanopore Technologies 不为这些工具提供支持，也不能保证它们与测序所用的最新的化学试剂/软件配置兼容。

11. RNA 提取和文库制备过程中可能出现的问题

下表列出了常见问题及其可能原因与解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的Support板块提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮（support@nanoporetech.com）或 纳米孔社区的在线支持（LiveChat）联系我们。

低质量样本

现象 可能原因 措施及备注
RNA 完整值低 （RNA 完整值（RIN）<9.5，或 rRNA 在电泳凝胶上的条带呈弥散状) RNA在提取过程中降解 请尝试其它RNA 提取方法。您可在RNA完整值 文档中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅 DNA/RNA 操作 页面。
RNA 的片段长度短于预期 RNA 在提取过程中降解 请尝试其它 RNA 提取方法。您可在RNA完整值 文档中查看更多有关RNA完整值（RIN）的介绍。更多信息，请参阅 DNA/RNA 操作 页面。

我们建议用户在操作 RNA 时处于无 RNA 酶污染的环境中，并确保实验室设备未受 RNA 酶污染。

12. RNA 测序过程中可能出现的问题

下表列出了常见问题及其可能原因与解决方法。

我们还在 Nanopore 社区的Support板块提供了常见问题解答（FAQ）。

如果以下方案仍无法解决您的问题，请通过电邮（support@nanoporetech.com）或 纳米孔社区的在线支持（LiveChat）联系我们。

MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 纳米孔阵列中引入了气泡 在对通过质控的芯片进行预处理之前，请务必排出预处理孔附近的气泡。否则，气泡会进入纳米孔阵列对其造成不可逆转地损害。如何为 MinION 测序芯片上样及如何为 PromethION 测序芯片上样的视频中演示了避免引入气泡的最佳操作方法。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 测序芯片没有正确插入测序仪 停止测序，将芯片从测序仪中取出，再重新插入测序仪内。请确保测序芯片牢固嵌入测序仪中，并已到达目标温度。如用户使用的是GridION/PromethION测序仪，也可尝试将芯片插入仪器的其它芯片槽进行测序。
MinKNOW Mux 扫描在测序起始时报告的活性孔数少于芯片质检时报告的活性孔数 文库中残留的污染物对纳米孔造成损害或堵塞 在测序芯片质检阶段，我们用芯片储存缓冲液中的质控 DNA 分子来评估活性纳米孔的数量。而在测序开始时，我们使用文库本身来评估活性纳米孔的数量。因此，活性纳米孔的数量在这两次评估中会有约10%的浮动。如测序开始时报告的孔数明显降低，则可能是由于文库中的污染物对膜结构造成了损坏或将纳米孔堵塞。用户可能需要使用其它的 RNA 提取或纯化方法，以提高起始核酸的纯度。您可在 污染物专题技术文档中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的 提取方法。

MinKNOW脚本失败

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示 "Script failed”（脚本失败）
重启计算机及MinKNOW。如问题仍未得到解决，请收集 MinKNOW日志文件并联系我们的技术支持。如您没有其他可用的测序设备，我们建议您先将装有文库的测序芯片置于4°C 储存，并联系我们的技术支持团队获取进一步储存上的建议。

纳米孔利用率低于40%

现象 可能原因 措施及备注
纳米孔利用率<40% 测序芯片中的文库量不够 请确保您按照相应实验指南，向测序芯片中加入正确浓度和体积的测序文库。请在上样前对文库进行定量，并使用NEBio 计算器等工具中的“ RNA ss: mass to moles”功能来计算摩尔量。
纳米孔利用率接近0 测序芯片中无系绳 系绳（FCT 管）随测序芯片预处理液加至芯片。请确保您在制备预处理液时，按需将测序芯片系绳（FCT）加入测序芯片冲洗液（FCF）中。

大量纳米孔处于“失活”（Inactive）状态

现象 可能原因 措施及备注
大量纳米孔处于失活状态（在通道面板和纳米孔活动状态图上以浅蓝色表示。膜结构或纳米孔遭受不可逆转地损伤 测序芯片中引入了气泡 芯片预处理和文库上样过程中引入的气泡会对纳米孔带来不可逆转地损害。请观看如何为 MinION 测序芯片上样及如何为 PromethION 测序芯片上样，了解最佳操作方法。
大量纳米孔处于失活/不可用状态 样本中含有污染物 您可在Contaminants 中查看污染物对测序实验的影响。请尝试其它不会导致污染物残留的提取方法。

温度波动

现象 可能原因 措施及备注
温度波动 测序芯片和仪器接触不良 检查芯片背面的金属板是否有热垫覆盖。重新插入测序芯片，用力向下按压，以确保芯片的连接器引脚与测序仪牢固接触。如问题仍未得到解决，请联系我们的技术支持。

未能达到目标温度

现象 可能原因 措施及备注
MinKNOW显示“未能达到目标温度” 测序仪所处环境低于标准室温，或通风不良（以致芯片过热） MinKNOW会限定测序芯片达到目标温度的时间。当超过限定时间后，系统会显示出错信息，但测序实验仍会继续。值得注意的是，在错误温度下测序可能会导致通量和数据质量（Q值）的降低。请调整测序仪的摆放位置，确保将其置于室温下、通风良好的环境中，再在MinKNOW中重启进程。有关 MinION 温度控制的更多信息，请点击 此链接查看。
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Last updated: 5/26/2026

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