Ligation sequencing gDNA - Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL (SQK-MLK114.96-XL)

Oxford Nanopore Technologies
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PromethION: Protocol

Ligation sequencing gDNA - Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL (SQK-MLK114.96-XL) V MLK_9193_v114_revB_30Sep2024

  • For barcoding of native genomic DNA libraries
  • Requires the Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL
  • No PCR required
  • Features 96 unique barcodes
  • Enables low-plex sequencing
  • Allows analysis of native DNA
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

概要

  • For barcoding of native genomic DNA libraries
  • Requires the Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL
  • No PCR required
  • Features 96 unique barcodes
  • Enables low-plex sequencing
  • Allows analysis of native DNA
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: MLK_9193_v114_revB_30Sep2024

1. Overview of the protocol

Introduction to the manual Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL protocol

This protocol describes how to carry out native barcoding of genomic DNA using the Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL (SQK-MLK114.96-XL). This kit is designed to enable low-plex sequencing.

This manual protocol outlines sample preparation with two options for low-plex sequencing:

  • Two samples across one flow cell. Allowing users to sequence up to 96 samples across 48 flow cells, reducing cost per sample.
  • Three samples across two flow cells. Allowing users to sequence up to 96 samples across 64 flow cells, maximising data output.

Using this protocol provides users with an easy workflow for whole genome sequencing (WGS), while enabling scalability options to best suit their sequencing requirements.

To efficiently load multiple PromethION Flow Cells, we recommend using the Loading multiple PromethION Flow Cells protocol as a guideline.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and optional stopping points.

Library preparation Process Time Stop option
DNA repair and end-prep Repair the fragmented DNA and prepare the DNA ends for barcode attachment 35 minutes 4°C overnight
Native barcode ligation Ligate the native barcodes to the DNA ends 60 minutes 4°C overnight
Adapter ligation and clean-up Attach the sequencing adapters to the barcoded DNA ends 50 minutes 4°C short-term storage or for repeated use, such as re-loading your flow cell
-80°C for single-use, long-term storage.
We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes

*Please note, timing estimates will vary depending on the number of samples being processed, number of pools generated, number of flow cells loaded and user experience.


MLK11496 workflow image loading options

Sequencing

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
  • Demultiplex barcoded reads in MinKNOW or the Guppy software
  • (Optional): Start the EPI2ME software and select a workflow for further analysis
重要

We do not recommend mixing barcoded libraries with non-barcoded libraries prior to sequencing.

重要

Optional fragmentation and size selection

By default, the protocol contains no DNA fragmentation step, however in some cases it may be advantageous to fragment your sample. For example, when working with lower amounts of input gDNA (100 ng – 500 ng), fragmentation will increase the number of DNA molecules and therefore increase throughput. Instructions are available in the DNA Fragmentation section of Extraction methods.

Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments - instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.

重要

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

  • Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL (SQK-MLK114.96-XL)
  • R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M)
  • Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003)
  • Native Barcoding Auxiliary Kit V14 (EXP-NBA114)
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
  • Flow Cell Wash Kit XL (EXP-WSH004-XL)
  • PromethION 24/48 device - PromethION IT requirements document

2. Equipment and consumables

材料
  • Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL (SQK-MLK114.96-XL)
  • 1000 ng gDNA per sample
消耗品
  • PromethION Flow Cell
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
  • NEBNext FFPE Repair Mix (NEB, M6630)
  • NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • Eppendorf twin.tec® PCR plate 96 LoBind, semi-skirted (Eppendorf™, cat # 0030129504) with heat seals
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
装置
  • PromethION sequencing device
  • PromethION Flow Cell Light Shield
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • Microfuge
  • Magnetic rack
  • マグネットラック
  • ボルテックスミキサー
  • サーマルサイクラー
  • Multichannel pipette and tips
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットとチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • P2 ピペットとチップ
  • アイスバケツ（氷入り）
  • タイマー
  • Qubit fluorometer (or equivalent)
オプション装置
  • Agilent Bioanalyzer (or equivalent)
  • Eppendorf 5424 centrifuge (or equivalent)

For this protocol, you will need 1000 ng gDNA per sample.

インプットDNA

インプットDNAのQC方法

インプットDNAの量と品質の要件を満たすことが重要です。DNAの使用量が少なすぎたり多すぎたり、あるいは品質の低いDNA（例としてDNAが非常に断片化されていたり、RNAや化学汚染物質が含まれている場合など）を使用すると、ライブラリーの調製に影響を及ぼす可能性があります。

DNAサンプルの品質管理の方法については、Input DNA/RNA QC protocolのプロトコルをご覧ください。

コンタミネーション

DNAの抽出する方法によっては、精製DNAに特定の化学汚染物質が残留する可能性があり、ライブラリ調製の効率やシークエンシングの品質に影響を及ぼす可能性があります。コンタミネーションについての詳細は、コミュニティーの Contaminants page をご覧ください。

Convenient reagent kits are available on request from NEB for the Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL.

The NEB Next® Companion Module contains the appropriate reagents and the required volumes for the Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL. For more information from NEB, please see "Find Products for Nanopore Sequencing".

サードパーティー試薬

このプロトコールで使用されているすべてのサードパーティー試薬は、当社が検証し、使用を推奨しているものです。Oxford Nanopore Technologiesでは、それ以外の試薬を用いたテストは行っていません。

すべてのサードパーティ製試薬については、製造元の指示に従って使用の準備をすることをお勧めします。

フローセルのチェックをしてください

シークエンシング実験を開始する前に、フローセルのポアの数を確認することを強くお勧めします。このフローセルの確認は、MinION/GridION/PromethIONの場合は代理店への到着から１２週間以内に行ってください。またはFlongle Flow Cellの場合は代理店への到着から4週間以内に行う必要があります。Oxford Nanopore Technologiesは、フローセルチェックの実施から2日以内に結果が報告され、推奨される保管方法に従っていた場合に、以下の表に記載されているナノポアの有効数に満たさない場合には、フローセルを交換します。 フローセルのチェックを行うには、Flow Cell Check documentの指示に従ってください。

Flow cell 保証する最小有効ポア数（以下の数未満のフローセルが交換対象となります）
Flongle Flow Cell 50
MinION/GridION Flow Cell 800
PromethION Flow Cell 5000
重要

The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL (SQK-MLK114.96-XL) contents

MLK114.96-XL tubes

Name Acronym Cap colour Number of vials Fill volume per vial (µl)
Native Adapter NA Green 1 320
Sequencing Buffer SB Red 4 1,700
Library Beads LIB Pink 4 1,800
Library Solution LIS White cap, pink sticker 4 1,800
EDTA EDTA Clear 1 700
Elution Buffer EB Clear cap, black label 1 10,000
Long Fragment Buffer LFB Clear cap, orange label 1 20,000
Flow Cell Flush FCF Clear cap, light blue label 6 15,500
Flow Cell Tether FCT White cap, purple sticker 2 1,600
AMPure XP Beads AXP Clear cap 1 6,000
Native Barcodes NB01-96 N/A 1 plate 8 µl per well

Note: This product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

The barcodes are orientated in columns in the barcode plate.

2021-09-14 Native Barcoding 96 kit contents v2 columns

To maximise the use of the Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL, the Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) and the Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) expansion packs are available.

These expansion packs provide extra library preparation and flow cell priming reagents to allow users to get the most out of their use of the Multiplex Ligation Sequencing Kit V14 XL (SQK-MLK114.96-XL).

Both expansion packs used together will provide enough reagents for 12 reactions. For customers requiring extra EDTA to maximise the use of barcodes, we recommend using 0.25 M EDTA and adding 4 µl.

Native Barcode Auxiliary V14 (EXP-NBA114) contents:

EXP-NBA114 tubes

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
Native Adapter NA Green 2 40
AMPure XP Beads AXP Amber 1 400
Long Fragment Buffer LFB Orange 2 1,800
Short Fragment Buffer SFB Clear 2 1,800

Note: This Product contains AMPure XP Reagent manufactured by Beckman Coulter, Inc. and can be stored at -20°C with the kit without detriment to reagent stability.

Sequencing Auxiliary Vials V14 (EXP-AUX003) contents:

EXP-AUX003 bottles

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (μl)
Elution Buffer EB Black 2 500
Sequencing Buffer SB Red 2 700
Library Solution LIS White cap, pink label 2 600
Library Beads LIB Pink 2 600
Flow Cell Flush FCF light blue label 2 8,000
Flow Cell Tether FCT Purple 2 200

Native barcode sequences

Component Forward sequence Reverse sequence
NB01 CACAAAGACACCGACAACTTTCTT AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG
NB02 ACAGACGACTACAAACGGAATCGA TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT
NB03 CCTGGTAACTGGGACACAAGACTC GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG
NB04 TAGGGAAACACGATAGAATCCGAA TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA
NB05 AAGGTTACACAAACCCTGGACAAG CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT
NB06 GACTACTTTCTGCCTTTGCGAGAA TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC
NB07 AAGGATTCATTCCCACGGTAACAC GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT
NB08 ACGTAACTTGGTTTGTTCCCTGAA TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT
NB09 AACCAAGACTCGCTGTGCCTAGTT AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT
NB10 GAGAGGACAAAGGTTTCAACGCTT AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC
NB11 TCCATTCCCTCCGATAGATGAAAC GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA
NB12 TCCGATTCTGCTTCTTTCTACCTG CAGGTAGAAAGAAGCAGAATCGGA
NB13 AGAACGACTTCCATACTCGTGTGA TCACACGAGTATGGAAGTCGTTCT
NB14 AACGAGTCTCTTGGGACCCATAGA TCTATGGGTCCCAAGAGACTCGTT
NB15 AGGTCTACCTCGCTAACACCACTG CAGTGGTGTTAGCGAGGTAGACCT
NB16 CGTCAACTGACAGTGGTTCGTACT AGTACGAACCACTGTCAGTTGACG
NB17 ACCCTCCAGGAAAGTACCTCTGAT ATCAGAGGTACTTTCCTGGAGGGT
NB18 CCAAACCCAACAACCTAGATAGGC GCCTATCTAGGTTGTTGGGTTTGG
NB19 GTTCCTCGTGCAGTGTCAAGAGAT ATCTCTTGACACTGCACGAGGAAC
NB20 TTGCGTCCTGTTACGAGAACTCAT ATGAGTTCTCGTAACAGGACGCAA
NB21 GAGCCTCTCATTGTCCGTTCTCTA TAGAGAACGGACAATGAGAGGCTC
NB22 ACCACTGCCATGTATCAAAGTACG CGTACTTTGATACATGGCAGTGGT
NB23 CTTACTACCCAGTGAACCTCCTCG CGAGGAGGTTCACTGGGTAGTAAG
NB24 GCATAGTTCTGCATGATGGGTTAG CTAACCCATCATGCAGAACTATGC
NB25 GTAAGTTGGGTATGCAACGCAATG CATTGCGTTGCATACCCAACTTAC
NB26 CATACAGCGACTACGCATTCTCAT ATGAGAATGCGTAGTCGCTGTATG
NB27 CGACGGTTAGATTCACCTCTTACA TGTAAGAGGTGAATCTAACCGTCG
NB28 TGAAACCTAAGAAGGCACCGTATC GATACGGTGCCTTCTTAGGTTTCA
NB29 CTAGACACCTTGGGTTGACAGACC GGTCTGTCAACCCAAGGTGTCTAG
NB30 TCAGTGAGGATCTACTTCGACCCA TGGGTCGAAGTAGATCCTCACTGA
NB31 TGCGTACAGCAATCAGTTACATTG CAATGTAACTGATTGCTGTACGCA
NB32 CCAGTAGAAGTCCGACAACGTCAT ATGACGTTGTCGGACTTCTACTGG
NB33 CAGACTTGGTACGGTTGGGTAACT AGTTACCCAACCGTACCAAGTCTG
NB34 GGACGAAGAACTCAAGTCAAAGGC GCCTTTGACTTGAGTTCTTCGTCC
NB35 CTACTTACGAAGCTGAGGGACTGC GCAGTCCCTCAGCTTCGTAAGTAG
NB36 ATGTCCCAGTTAGAGGAGGAAACA TGTTTCCTCCTCTAACTGGGACAT
NB37 GCTTGCGATTGATGCTTAGTATCA TGATACTAAGCATCAATCGCAAGC
NB38 ACCACAGGAGGACGATACAGAGAA TTCTCTGTATCGTCCTCCTGTGGT
NB39 CCACAGTGTCAACTAGAGCCTCTC GAGAGGCTCTAGTTGACACTGTGG
NB40 TAGTTTGGATGACCAAGGATAGCC GGCTATCCTTGGTCATCCAAACTA
NB41 GGAGTTCGTCCAGAGAAGTACACG CGTGTACTTCTCTGGACGAACTCC
NB42 CTACGTGTAAGGCATACCTGCCAG CTGGCAGGTATGCCTTACACGTAG
NB43 CTTTCGTTGTTGACTCGACGGTAG CTACCGTCGAGTCAACAACGAAAG
NB44 AGTAGAAAGGGTTCCTTCCCACTC GAGTGGGAAGGAACCCTTTCTACT
NB45 GATCCAACAGAGATGCCTTCAGTG CACTGAAGGCATCTCTGTTGGATC
NB46 GCTGTGTTCCACTTCATTCTCCTG CAGGAGAATGAAGTGGAACACAGC
NB47 GTGCAACTTTCCCACAGGTAGTTC GAACTACCTGTGGGAAAGTTGCAC
NB48 CATCTGGAACGTGGTACACCTGTA TACAGGTGTACCACGTTCCAGATG
NB49 ACTGGTGCAGCTTTGAACATCTAG CTAGATGTTCAAAGCTGCACCAGT
NB50 ATGGACTTTGGTAACTTCCTGCGT ACGCAGGAAGTTACCAAAGTCCAT
NB51 GTTGAATGAGCCTACTGGGTCCTC GAGGACCCAGTAGGCTCATTCAAC
NB52 TGAGAGACAAGATTGTTCGTGGAC GTCCACGAACAATCTTGTCTCTCA
NB53 AGATTCAGACCGTCTCATGCAAAG CTTTGCATGAGACGGTCTGAATCT
NB54 CAAGAGCTTTGACTAAGGAGCATG CATGCTCCTTAGTCAAAGCTCTTG
NB55 TGGAAGATGAGACCCTGATCTACG CGTAGATCAGGGTCTCATCTTCCA
NB56 TCACTACTCAACAGGTGGCATGAA TTCATGCCACCTGTTGAGTAGTGA
NB57 GCTAGGTCAATCTCCTTCGGAAGT ACTTCCGAAGGAGATTGACCTAGC
NB58 CAGGTTACTCCTCCGTGAGTCTGA TCAGACTCACGGAGGAGTAACCTG
NB59 TCAATCAAGAAGGGAAAGCAAGGT ACCTTGCTTTCCCTTCTTGATTGA
NB60 CATGTTCAACCAAGGCTTCTATGG CCATAGAAGCCTTGGTTGAACATG
NB61 AGAGGGTACTATGTGCCTCAGCAC GTGCTGAGGCACATAGTACCCTCT
NB62 CACCCACACTTACTTCAGGACGTA TACGTCCTGAAGTAAGTGTGGGTG
NB63 TTCTGAAGTTCCTGGGTCTTGAAC GTTCAAGACCCAGGAACTTCAGAA
NB64 GACAGACACCGTTCATCGACTTTC GAAAGTCGATGAACGGTGTCTGTC
NB65 TTCTCAGTCTTCCTCCAGACAAGG CCTTGTCTGGAGGAAGACTGAGAA
NB66 CCGATCCTTGTGGCTTCTAACTTC GAAGTTAGAAGCCACAAGGATCGG
NB67 GTTTGTCATACTCGTGTGCTCACC GGTGAGCACACGAGTATGACAAAC
NB68 GAATCTAAGCAAACACGAAGGTGG CCACCTTCGTGTTTGCTTAGATTC
NB69 TACAGTCCGAGCCTCATGTGATCT AGATCACATGAGGCTCGGACTGTA
NB70 ACCGAGATCCTACGAATGGAGTGT ACACTCCATTCGTAGGATCTCGGT
NB71 CCTGGGAGCATCAGGTAGTAACAG CTGTTACTACCTGATGCTCCCAGG
NB72 TAGCTGACTGTCTTCCATACCGAC GTCGGTATGGAAGACAGTCAGCTA
NB73 AAGAAACAGGATGACAGAACCCTC GAGGGTTCTGTCATCCTGTTTCTT
NB74 TACAAGCATCCCAACACTTCCACT AGTGGAAGTGTTGGGATGCTTGTA
NB75 GACCATTGTGATGAACCCTGTTGT ACAACAGGGTTCATCACAATGGTC
NB76 ATGCTTGTTACATCAACCCTGGAC GTCCAGGGTTGATGTAACAAGCAT
NB77 CGACCTGTTTCTCAGGGATACAAC GTTGTATCCCTGAGAAACAGGTCG
NB78 AACAACCGAACCTTTGAATCAGAA TTCTGATTCAAAGGTTCGGTTGTT
NB79 TCTCGGAGATAGTTCTCACTGCTG CAGCAGTGAGAACTATCTCCGAGA
NB80 CGGATGAACATAGGATAGCGATTC GAATCGCTATCCTATGTTCATCCG
NB81 CCTCATCTTGTGAAGTTGTTTCGG CCGAAACAACTTCACAAGATGAGG
NB82 ACGGTATGTCGAGTTCCAGGACTA TAGTCCTGGAACTCGACATACCGT
NB83 TGGCTTGATCTAGGTAAGGTCGAA TTCGACCTTACCTAGATCAAGCCA
NB84 GTAGTGGACCTAGAACCTGTGCCA TGGCACAGGTTCTAGGTCCACTAC
NB85 AACGGAGGAGTTAGTTGGATGATC GATCATCCAACTAACTCCTCCGTT
NB86 AGGTGATCCCAACAAGCGTAAGTA TACTTACGCTTGTTGGGATCACCT
NB87 TACATGCTCCTGTTGTTAGGGAGG CCTCCCTAACAACAGGAGCATGTA
NB88 TCTTCTACTACCGATCCGAAGCAG CTGCTTCGGATCGGTAGTAGAAGA
NB89 ACAGCATCAATGTTTGGCTAGTTG CAACTAGCCAAACATTGATGCTGT
NB90 GATGTAGAGGGTACGGTTTGAGGC GCCTCAAACCGTACCCTCTACATC
NB91 GGCTCCATAGGAACTCACGCTACT AGTAGCGTGAGTTCCTATGGAGCC
NB92 TTGTGAGTGGAAAGATACAGGACC GGTCCTGTATCTTTCCACTCACAA
NB93 AGTTTCCATCACTTCAGACTTGGG CCCAAGTCTGAAGTGATGGAAACT
NB94 GATTGTCCTCAAACTGCCACCTAC GTAGGTGGCAGTTTGAGGACAATC
NB95 CCTGTCTGGAAGAAGAATGGACTT AAGTCCATTCTTCTTCCAGACAGG
NB96 CTGAACGGTCATAGAGTCCACCAT ATGGTGGACTCTATGACCGTTCAG

3. DNA repair and end-prep

材料
  • 1000 ng gDNA per sample
  • AMPure XP Beads (AXP)
消耗品
  • NEBNext FFPE DNA Repair Mix (NEB, M6630)
  • NEBNext® Ultra II End Repair / dA-tailing Module (NEB, E7546)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • 0.2 ml 薄壁のPCRチューブ
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • Thermal cycler
  • アイスバケツ（氷入り）
  • Microfuge
  • Hula mixer (gentle rotator mixer)
  • マグネットラック
  • Qubit fluorometer (or equivalent)
重要

Optional fragmentation and size selection

By default, the protocol contains no DNA fragmentation step, however in some cases it may be advantageous to fragment your sample. For example, when working with lower amounts of input gDNA (100 ng – 500 ng), fragmentation will increase the number of DNA molecules and therefore increase throughput. Instructions are available in the DNA Fragmentation section of Extraction methods.

Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments - instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.

Thaw the AMPure XP Beads (AXP) at room temperature and mix by vortexing. Keep the beads at room temperature.

Prepare the NEBNext FFPE DNA Repair Mix and NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer’s instructions, and place on ice.

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Flick and/or invert the reagent tubes to ensure they are well mixed.
    Note: Do not vortex the FFPE DNA Repair Mix or Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The Ultra II End Prep Buffer and FFPE DNA Repair Buffer may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for 30 seconds to solubilise any precipitate.
    Note: It is important the buffers are mixed well by vortexing.

  5. The FFPE DNA Repair Buffer may have a yellow tinge and is fine to use if yellow.

重要

Do not vortex the NEBNext FFPE DNA Repair Mix or NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix.

In clean 0.2 ml thin-walled PCR tubes, aliquot 1000 ng per sample.

Make up each sample to 12 µl using nuclease-free water. Mix gently by pipetting and spin down.

Combine the following components per sample:

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent Volume
DNA sample 12 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer 0.875 µl
Ultra II End-prep reaction buffer 0.875 µl
Ultra II End-prep enzyme mix 0.75 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix 0.50 µl
Total 15 µl
ヒント

When processing increased numbers of samples, we recommend making up a mastermix of the reagents for the total number of samples and adding 3 µl to each individual sample.

Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting and spin down briefly.

サーマルサイクラーを使用して、初めに20℃で5分間インキュベートした後に、65℃で5分間インキュベートしてください。

Transfer each sample to clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Resuspend the AMPure XP beads (AXP) by vortexing.

Add 15 µl of resuspended AMPure XP Beads (AXP) to each end-prep reaction and mix by flicking the tube.

Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）で5分間インキュベートします（常温）。

Prepare 500 μl of 80% ethanol in nuclease-free water per sample.

Spin down the samples and pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless. Keep the tubes on the magnet and pipette off the supernatant.

Keep the tubes on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

If the pellet was disturbed, wait for beads to pellet again before removing the ethanol.

Repeat the previous step.

Briefly spin down and place the tubes back on the magnet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for 30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the tubes from the magnetic rack and resuspend the pellet in 10 µl nuclease-free water. Spin down and incubate for 2 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 10 µl of eluate for each sample into clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes, individually.

Note: If users are having difficulty retaining 10 µl without disturbing the beads, 8.5 µl can be retained instead, allowing 1 µl for quantification and 7.5 µl to be taken forward into the Native Barcode Ligation step.

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of each eluted sample using a Qubit fluorometer.

Keeping your samples separate, sandardise them to an equimolar mass.

Make up the volume of each sample to 7.5 µl using nuclease-free water.

最終ステップ

Take forward the equimolar samples in 7.5 µl to be barcoded and pooled in the native barcode ligation step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

4. Native barcode ligation

材料
  • Native Barcodes (NB01-NB96)
  • EDTA (EDTA)
  • AMPure XP Beads (AXP)
消耗品
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat # AM9937)
  • ヌクレアーゼフリー水で用事調整した 80% エタノール溶液
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Q32851)
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
装置
  • マグネットラック
  • ボルテックスミキサー
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • Microfuge
  • サーマルサイクラー
  • アイスバケツ（氷入り）
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
オプション装置
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）

Prepare the NEB Blunt/TA Ligase Master Mix according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes.

Thaw the EDTA at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

Thaw the native barcodes at room temperature. Use one barcode per sample. Individually mix the barcodes by pipetting, spin down, and place them on ice.

Select a unique barcode for each sample to be run in a group:

  • For two samples on one flow cell, select two unique barcodes, one for each sample.
  • For three samples on two flow cells, select three unique barcodes, one for each sample.

In clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes, add the reagents in the following order per sample:

Reagent Volume
End-prepped DNA 7.5 µl
Native barcode 2.5 µl
Blunt/TA Ligase Master Mix 10 µl
Total 20 µl

反応液を完全に混合するために、ゆっくりとピペッティングし短時間スピンダウンして下さい。

Incubate for 20 minutes at room temperature.

Add 4 µl of EDTA to each tube and mix thoroughly by pipetting and spin down briefly.

Note: EDTA is added at this step to stop the reaction.

Pool each group of two or three uniquely barcoded samples in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

For example:

  • Up to 48 pools of two differentially barcoded samples
  • Up to 32 pools of three differentially barcoded samples

Ensure the beads are at room temperature and resuspend the AMPure XP beads (AXP) by vortexing.

Add AMPure XP Beads (AXP) to the pooled reaction in a 0.4X ratio and mix by pipetting. The volume for AMPure XP Beads (AXP) will vary depending on the number of barcoded samples in the pool:

  • For two barcoded samples add 19 µl of AMPure XP Beads (AXP)
  • For three barcoded samples add 29 µl of AMPure XP Beads (AXP)

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Prepare 1 ml of fresh 80% ethanol in nuclease-free water per barcoded sample pool.

Spin down the sample for 5 seconds and pellet on a magnet for 5 minutes. Keep the tube on the magnetic rack until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magentic rack and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

前のステップを繰り返します。

Spin down and place the tube back on the magnetic rack. Pipette off any residual ethanol. Allow the pellet to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 35 µl nuclease-free water by gently flicking.

Incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.

Spin down the tube for 5 seconds and pellet the beads on a magnetic rack until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 35 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

最終ステップ

Take forward the barcoded DNA library to the adapter ligation and clean-up step. However, you may store the sample at 4°C overnight.

5. Adapter ligation and clean-up

材料
  • Native Adapter (NA)
  • Long Fragment Buffer (LFB)
  • Elution Buffer (EB)
  • AMPure XP Beads (AXP)
消耗品
  • NEBNext® Quick Ligation Module (NEB, E6056)
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • Qubit™ Assay Tubes (Invitrogen, Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, cat # Q32851)
装置
  • 小型遠心機
  • マグネットラック
  • ボルテックスミキサー
  • Hula mixer（緩やかに回転するミキサー）
  • サーマルサイクラー
  • P1000 ピペット及びチップ
  • P200 ピペットとチップ
  • P100 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
  • P10 ピペットとチップ
  • Ice bucket with ice
  • Qubit蛍光光度計（またはQCチェックのための同等品）
重要

The Native Adapter (NA) used in this kit and protocol is not interchangeable with other sequencing adapters.

Prepare the NEBNext Quick Ligation Reaction Module according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes. Note: Do NOT vortex the Quick T4 DNA Ligase.

The NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5x) may have a little precipitate. Allow the mixture to come to room temperature and pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for several seconds to ensure the reagent is thoroughly mixed.

重要

Do not vortex the Quick T4 DNA Ligase.

Spin down the Native Adapter (NA) and Quick T4 DNA Ligase, pipette mix and place on ice.

Thaw the Elution Buffer (EB) at room temperature and mix by vortexing. Then spin down and place on ice.

To enrich for DNA fragments of 3 kb or longer, thaw one tube of Long Fragment Buffer (LFB) at room temperature, mix by vortexing, spin down and place on ice.

In a 1.5 ml Eppendorf LoBind tube, mix in the following order:

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent Volume
Pooled barcoded sample 30 µl
Native Adapter (NA) 5 µl
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5X) 10 µl
Quick T4 DNA Ligase 5 µl
Total 50 µl

反応液を完全に混合するために、ゆっくりとピペッティングし短時間スピンダウンして下さい。

反応液を室温で10分間インキュベートします。

重要

The next clean-up step uses Long Fragment Buffer (LFB) rather than 80% ethanol to wash the beads. The use of ethanol will be detrimental to the sequencing reaction.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

Add 20 µl of resuspended AMPure XP Beads (AXP) to the reaction and mix by pipetting.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.

Spin down the sample and pellet on the magnetic rack. Keep the tube on the magnet and pipette off the supernatant.

Wash the beads by adding 125 μl Long Fragment Buffer (LFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the tube to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the supernatant using a pipette and discard.

前のステップを繰り返します。

スピンダウンし、チューブをマグネットの上に戻します。残った上清をピペットで取り除きます。ペレットを30 秒間程乾かします。 ただし、 ペレットにひびが入るまでは乾燥させないでください。

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 35 µl Elution Buffer (EB).

Spin down and incubate for 10 minutes at 37°C. Every 2 minutes, agitate the sample by gently flicking for 10 seconds to encourage DNA elution.

溶出液が無色透明になるまで、少なくとも1分間マグネット上でビーズをペレット化します。

Remove and retain 35 µl of eluate containing the DNA library into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Dispose of the pelleted beads

CHECKPOINT

Qubit蛍光光度計を使用して、溶出したサンプル1 µlを定量します。

Make up each library to 32 µl at 50 fmol, using Elution Buffer (EB).

  • For two samples on one flow cell, make one DNA library from your eluate.
  • For three samples on two flow cells, make two DNA libraries from your eluate.

Note: If there is insufficient DNA to obtain 50 fmol, take forward the full volume of eluate as your DNA library and load onto one flow cell.

重要

Where possible, we recommend loading ~50 fmol of this final prepared library onto the R10.4.1 flow cell for our Multiplex Ligation Sequencing V14 protocol.

最終ステップ

調製されたライブラリーは、フローセルへのロードに使用されます。ライブラリーは、ロードの準備ができるまで氷上、または4℃で保存して下さい。

ヒント

推奨のライブラリー保存方法

短期間の保存や繰り返し使用する場合は__（例　フローセルをウオッシュして再度ロードする場合）は、ライブラリーをEppendorf DNA LoBindチューブに入れ、__4℃で保存 することをお勧めします。 __3か月以上の長期保存の場合は、____ライブラリーをEppendorf DNA LoBindチューブに -80 ° Cで保存 することをお勧めします。

オプショナルステップ

If quantities allow, the library may be diluted in Elution Buffer (EB) for splitting across multiple flow cells.

Depending on how many flow cells the library will be split across, more Elution Buffer (EB) than what is supplied in the kit will be required.

6. Priming and loading multiple flow cells on a PromethION

材料
  • Sequencing Buffer (SB)
  • Library Beads (LIB)
  • Library Solution (LIS)
  • Flow Cell Tether (FCT)
  • Flow Cell Flush (FCF)
消耗品
  • PromethION Flow Cell
  • 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
  • 2 ml Eppendorf DNA LoBind tubes
装置
  • PromethION 2 Solo device
  • PromethION sequencing device
  • P1000 pipette and tips
  • P200 ピペットとチップ
  • P20 ピペットとチップ
重要

This kit is only compatible with R10.4.1 flow cells (FLO-PRO114M).

Using the Library Solution

For most sequencing experiments, use the Library Beads (LIB) for loading your library onto the flow cell. However, for viscous libraries it may be difficult to load with the beads and may be appropriate to load using the Library Solution (LIS).

Thaw the Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) or Library Solution (LIS, if using), Flow Cell Tether (FCT) and Flow Cell Flush (FCF) at room temperature, before mixing by vortexing. Then spin down before storing on ice.

重要

Scale up reagent volumes as needed.

Ensure to prepare enough reagents for the total number of flow cells being processed and to take into account extra volume required for pipetting errors.

ヒント

Each vial provides enough reagent for the preparation of 12 samples. Thaw the appropriate number of vials of each reagent.

Prepare the flow cell priming mix in a suitable tube for the number of flow cells to flush. Once combined, mix well by briefly vortexing.

Reagents Volume per flow cell
Flow Cell Flush (FCF) 1,170 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Total volume 1,200 µl
重要

冷蔵庫からフローセルを取り出した後にフローセルが室温に戻るまで20分待ってからPromethIONに差し込んでください。湿度の高い環境ではフローセルに結露が生じることがあります。フローセルの上面と下面にある金色のコネクターピンに結露がないかを点検し、結露が確認された場合はリントフリーのウェットティッシュで拭き取ってください。フローセル下面にヒートパッド（黒いパッド）があることを確認してください。

PromethION 2 Soloの場合、フローセルは以下のようにセットします

  1. フローセルを金属プレートの上に平らに置きます。

  2. フローセルを、金色のピンまたは緑色の基板が見えなくなるまでドッキングポートにスライドさせます。

J2068 FC-into-P2-animation V5

PromethION 24/48 の場合は、フローセルをドッキングポートにセットします

  1. フローセルとコネクターを水平および垂直に並べてから、所定の位置にスムーズに挿入してください。
  2. フローセルをしっかりと押し下げ、ラッチがかみ合い、カチッと音がして所定の位置に収まることを確認します。

Step 1a V3

Step 1B

重要

フローセルを誤った角度で挿入すると、PromethIONのピンが損傷し、シーケンス結果に影響を及ぼす可能性があります。PromethIONのピンが損傷している場合は、support@nanoporetech.com までご連絡ください。

Screenshot 2021-04-08 at 12.08.37

If not already completed, perform a flow cell check on all flow cells.

Please refer to the Flow Cell Check protocol for further information.

インレットポートカバーを時計回りにスライドさせて開きます。

Prom loading 2

重要

フローセルからバッファーを引き上げる際には注意してください。20～30μl以上は除去せず、ポアのアレイ全体が常にバッファーで覆われていることを確認して下さい。アレイに気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。

インレットポートを開けた後、少量ずつ引き戻して気泡を取り除きます：

  1. P1000ピペットチップを200µlにセットします。
  2. チップをインレットポートに挿入します。
  3. ダイヤルが220～230µlを示すまで、またはピペットチップに少量のバッファ ーが入るのが確認できるまで、ホイールを回します。

Step 3 v1

気泡が入らないように、500 µl のプライミングミックスをインレットポートからフローセルに注入し、５分間待ちます。この間に、プロトコールの次のステップでライブラリーをロードする準備をしてください。

Step 4 v1

Library Beads(LIB)の液をピペッティングすることで十分に混合して下さい。

重要

Library Beads（LIB）チューブにはビーズの懸濁液が入っています。これらのビーズはすぐに沈殿するので、使用直前に混合することが重要です。

ほとんどのシーケンス実験にはLibrary Beads （LIB）の使用を推奨します。しかし、より粘性の高いライブラリーにはLibrary Solution（LIS）を使ってください。

新しい1.5mlのEppendorf DNA LoBindチューブに、以下のようにしてライブラリーをロードする準備をしてください

試薬 フローセルあたりの容量
Sequencing Buffer (SB) 100 µl
Library Beads (LIB) thoroughly mixed before use, or Library Solution (LIS) 68 µl
DNA library 32 µl
合計 200 µl

注） アレイカバレッジを向上させるため、ライブラリーのローディング量を増やしました。

オプショナルステップ

The Multiplex Ligation Kit V14 XL is designed for users running multiple flow cells. When handling multiple DNA libraries, the Sequencing Buffer (SB) and Library Beads (LIB) can be combined in a master mix:

  1. Mix the Sequencing Buffer (SB) and Library Beads (LIB) as described above, scaling up the final volume for the appropriate number of samples and adding up to 20% excess of each reagent.
  2. Mix the master mix by pipetting immediately before adding to the DNA samples.
  3. Pipette 168 µl of the master mix into each DNA sample-containing tube.
  4. Mix the samples by pipetting.

500μlのプライミングミックスをインレットポートにゆっくりと注入し、フローセルのプライミングを完了します。

Step 5 v1

調製したライブラリーは、ロードする直前にピペッティング混合して下さい。

P1000ピペットを使用して、インレットポートに200µlのライブラリーを注入します。

Step 6 v1

Close the valve to seal the inlet port and close the PromethION lid when ready.

Wait a minimum of 10 minutes after loading the flow cells onto the PromethION before initiating any experiments. This will help to increase the sequencing output.

Picture7

重要

最適なシークエンス出力を得るために、ライブラリーがロードされたすぐにライトシールドをフローセルに取り付けてください。

ライブラリーがフローセル上にある状態では（ウォッシングやリロードのステップを含める）、フローセルにライトシールドを付けたままにしておくことを推奨します。ライトシールドは、ライブラリーがフローセルから除去された時点で取り外すことができます。

ライトシールドがフローセルから取り外されている場合は、以下のようにライトシールドを取り付けます

  1. ライトシールドとインレットポートをフローセルのインレットポートカバーに合わせます。ライトシールドの前縁をフローセルIDの上に位置するようにします。
  2. ライトシールドをインレットポートカバーの周囲にしっかりと押し付けます。インレットポートクリップがインレットポートカバーの下にカチッとはまるようになっています。

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8a FAW

J2264 - Light shield animation PromethION Flow Cell 8b FAW

For multiple flow cell washing, use the same experiment name and identifying sample IDs for all runs to enable all flow cells to be paused simultaneously.

Screenshot 2023-02-14 114901

7. Data acquisition and basecalling

Overview of nanopore data analysis

For a full overview of nanopore data analysis, which includes options for basecalling and post-basecalling analysis, please refer to the Data Analysis document.

How to start sequencing

The sequencing device control, data acquisition and real-time basecalling are carried out by the MinKNOW software. Please ensure MinKNOW is installed on your computer or device. There are multiple options for how to carry out sequencing:

1. Data acquisition and basecalling in real-time using MinKNOW on a computer

Follow the instructions in the MinKNOW protocol beginning from the "Starting a sequencing run" section until the end of the "Completing a MinKNOW run" section.

2. Data acquisition and basecalling in real-time using the MinION Mk1B/Mk1D device

Follow the instructions in the MinION Mk1B user manual or the MinION Mk1D user manual.

3. Data acquisition and basecalling in real-time using the MinION Mk1C device

Follow the instructions in the MinION Mk1C user manual.

4. Data acquisition and basecalling in real-time using the GridION device

Follow the instructions in the GridION user manual.

5. Data acquisition and basecalling in real-time using the PromethION device

Follow the instructions in the PromethION user manual or the PromethION 2 Solo user manual.

6. Data acquisition using MinKNOW on a computer and basecalling at a later time using MinKNOW

Follow the instructions in the MinKNOW protocol beginning from the "Starting a sequencing run" section until the end of the "Completing a MinKNOW run" section. When setting your experiment parameters, set the Basecalling tab to OFF. After the sequencing experiment has completed, follow the instructions in the Post-run analysis section of the MinKNOW protocol.

8. ダウンストリーム解析

ベースコール後の分析

ベースコールされたデータをさらに解析するには、いくつかの方法があります。

1. EPI2ME workflows

詳細なデータ解析のために、オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズは、EPI2MEで利用可能な様々なバイオインフォマティクスのチュートリアルとワークフローを提供しています。このプラットフォームでは、研究チームとアプリケーションチームがGitHubに保存しているワークフローを記載しています。このプラットフォーム内にはバイオインフォマティクスのコードと説明をしているコメント、およびサンプルデータを使ってコードを試すことが出来ます。

2. 研究分析ツール

Oxford Nanopore Technologiesの研究部門では、Oxford Nanopore GitHub repositoryで多数の分析ツールを公開しています。これらのツールは上級ユーザー向けであり、ソフトウェアのインストールと実行方法の説明が含まれています。これらのツールは最低限のサポートしかしていません。

3. コミュニティーで開発されたツール

研究課題に適したデータ解析方法が上記のリソースのいずれにも記載されていない場合は、 resource centre を参照し、アプリケーションに適したバイオインフォマティクスツールを検索してください。 Nanoporeコミュニティーの多くのメンバーが、 ナノポアシークエンシングデータを解析するための独自のツールやパイプラインを開発しており、そのほとんどはGitHubで利用可能です。これらのツールはOxford Nanopore Technologiesではサポート対象外であり、最新のケミストリーやソフトウェア構成との互換性を保証するものではありませんのでご了承ください。

9. フローセルの再利用と返却

材料
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

シークエンス実験終了後、フローセルを再利用する場合は、Flow Cell Wash Kitのプロトコールに従い、洗浄したフローセルを2～8℃で保管してください。

Flow Cell Wash Kit protocolは、Nanoporeコミュニティーで入手できます。

ヒント

運転を停止したらできるだけ早くフローセルをウォッシュすることをお勧めします。しかし、これが不可能な場合はフローセルをデバイスに入れたまま、翌日にウォッシュをして下さい。

または、返送手順に従って、オックスフォード・ナノポアに返送してください。

フローセルの返却方法は hereをご覧ください。

(注： 製品を返却する前に、すべてのフローセルを脱イオン水で洗浄する必要があります。

重要

シークエンシング実験に関して問題が発生した場合や質問がある場合には、このプロトコルのオンライン版にあるトラブルシューティングガイドを参照してください。

10. Issues during DNA/RNA extraction and library preparation for Kit 14

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

サンプルの品質が低い

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
DNAの純度が低い（DNAのOD 260/280のナノドロップ測定値が1.8未満およびOD 260/230が2.0～2.2未満） DNA抽出で必要な純度が得られていない 夾雑物の影響は、 Contaminants に示されています。コンタミネーションをもたらさないために別の抽出方法extraction method をお試しください。.

追加のSPRIクリーンアップステップの実施を検討して下さい。
低いRNA インテグリティー（RNA Integrity Number: <9.5 RIN、またはrRNAバンドがゲル上でスメアになっている） 抽出中にRNAが分解された 別のRNA抽出方法 RNA extraction methodを試してください。RINの詳細については、 RNA Integrity Number の資料を参照してください。詳細については、 DNA/RNA Handling のページをご覧ください。
RNAのフラグメントが予想より短い 抽出中にRNAが分解された 別のRNA抽出方法 RNA extraction methodを試してください。 RINの詳細については、 RNA Integrity Number の資料を参照してください。詳細については、DNA/RNA Handling のページをご覧ください。

RNAを扱う際には、RNaseフリーの環境で作業し、実験器具もRNaseフリーにしておくことをお勧めします。

AMPureビーズクリーンアップ後のDNA回収率が低い

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
低回収率 AMPureビーズとサンプルの比率が予想していたのよりも低いことによるDNAの損失 1. AMPureビーズはすぐに沈降するため、サンプルに添加する前によく再懸濁させてください。

2. AMPureビーズ対サンプル比が0.4:1未満の場合、どのようなサイズのDNA断片でもクリーンアップ中に失われます。
低回収率 DNA断片が予想よりも短い サンプルに対するAMPureビーズの比率が低いほど、短い断片に対する選択が厳しくなります。 アガロースゲル(または他のゲル電気泳動法)上でインプットDNAの長さを設定してから、使用するAMPureビーズの適切な量を計算してください。 SPRI cleanup
エンドプレップ後の収率が低い 洗浄ステップで使用したエタノール濃度が低い（70%未満）。 エタノールが70%未満の場合、DNAは洗浄中にビーズから溶出されます。必ず正しい濃度（％）のエタノールを使用してください。

11. Issues during the sequencing run for Kit 14

以下は、最もよく起こる問題のリストであり、いくつかの原因と解決策が提案されています。

Nanopore Community Support セクションにFAQをご用意しています。

ご提案された解決策を試しても問題が解決しない場合は、テクニカルサポートに電子メール (support@nanoporetech.com)または LiveChat in the Nanopore Communityでご連絡ください。

シークエンス開始時のポアがフローセルチェック後よりも少ない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ナノポアアレイに気泡が入ってしまった。 フローセルチェックをした後、フローセルをプライミングする前に、プライミングポート付近の気泡を取り除くことが必要です。 気泡を取り除かないと、気泡がナノポアアレイに移動し、空気に触れたたナノポアが不可逆的なダメージを負った可能性がある。これを防ぐための最適な方法が、 this videoで紹介されています。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 フローセルがデバイスに正しく挿入されていない。 シークエンスランを停止し、フローセルをシークエンス装置から取り出します。次に再度フローセルを挿入し、装置にしっかりと固定され、目標温度に達していることを確認します。GridIONやPromethIONの場合は別のフローセルの位置をお試しください。
MinKNOWのフローセルチェックで確認されたポアの数より、シークエンシング開始時のポア数が少なく表示された。 ライブラリー内の汚染物質がポアを失活させたり塞いだりしている。 フローセルチェックの際のポア数は、フローセル保存バッファー中のQC用のDNA分子を用いて計測されます。シークエンシングの開始時は、ライブラリ自体を使用してアクティブなポア数を推定します。このため、フローセルチェックとRun開始時のポア数は、約10％程度の変動が起こります。シークエンシング開始時に報告されたポアの数が大幅に減少している場合は、ライブラリー中の汚染物質がメンブレンを損傷していたり、ポアをブロックしている可能性があります。インプット材料の純度を向上させるために、別のDNA/RNA抽出または精製方法が必要となる場合があります。コンタミネーションの影響は、Contaminants Know-how pieceを参照にして下さい。夾雑物を除去するために別の抽出方法extraction method をお試しください。

MinKNOWのスクリプトに問題

問題点 この問題が生じた可能性のある原因 解決策とコメント
MinKNOW に 「Script failed」と表示されている"
コンピューターを再起動し、MinKNOWを再起動します。問題が解決しない場合は MinKNOW log files MinKNOWログファイルを収集し 、テクニカルサポートにご連絡ください。他のシークエンシングデバイスをお持ちでない場合は、 フローセルとロードしたライブラリーを4℃で保管することをお勧めします。詳細な保管方法については、テクニカルサポートにお問い合わせください。

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell 50 fmol of good quality library can be loaded on to a PromethION flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Multiplex Ligation Kit was used, and ethanol was used instead of LFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FCT tube). Make sure FCT was added to FCF before priming.

予想より短いリード長

問題点 予想される原因 解決策とコメント
予想より短いリード長 DNAサンプルの不要な断片化 読み取り長はサンプルDNA断片の長さを反映します。サンプルDNAは、抽出およびライブラリー調製中の操作で断片化した可能性があります。

1. 抽出の最適な方法については、Extraction Methods の抽出方法を参照してください。

2. ライブラリー調製に進む前に、アガロースゲル電気泳動で、サンプルDNAのフラグメント長の分布を確認してください。 DNA gel2 上の画像では、サンプル1は高分子量ですが、サンプル2は断片化されています。

3. ライブラリー調製中は、試薬を混合するためのピペッティングやボルテックス操作は、プロトコルで指示がないかぎり行わないでください。

利用できないポアの割合が多い場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
利用できないポアの割合が大きい（チャンネルパネルとポアのアクティブポートで青く表示されています）

image2022-3-25 10-43-25 上のアクティブなポアの図は、時間の経過とともに「利用できない」ポアの割合が増加していることを示しています。		 サンプル内に不純物が含まれている 一部のポアに吸着する不純物は、MinKNOWに組み込まれたポアのブロック解除機能によって、ポアから除去することができます。 このステップが完了すると、ポアの状態が「sequencing pore」に戻ります。利用できないポアの部分が多いか、増加した場合:

1.Flow Cell Wash Kit nuclease flush using the Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) を用いて、ヌクレアーゼ洗浄を 行うことができます。又は
2. PCRを数サイクル実行してサンプルDNAの量を増やし、サンプルDNAに含まれる問題の不純物が相対的に減る（希釈される）ようにします。

Inactiveのポアの割合が高い

問題点 予想される原因 解決策とコメント
利用できない(inactive/unavailable)ポアの割合が高い（チャネルパネルとポアアクティブポートでは水色で表示されています）ポアまたは膜に損傷が起きてしまった。 気泡がフローセルに混入した。 フローセルのプライミングやライブラリーのロードで気泡が入ると、ポアに不可逆的なダメージを与える可能性があります。 推奨の操作方法については、Priming and loading your flow cell のビデオをご覧ください。
利用できないポアの割合が多い場合 サンプルDNAに含まれる不純物 既知の化合物問題で、サンプルDNAに多糖類が含まれた事で、植物のゲノムDNAと結合しポアをブロックした。

1. 植物葉DNA抽出法 Plant leaf DNA extraction methodをご参照ください。
2. QIAGEN PowerClean Pro キットを使用してクリーンアップして下さい。
3. QIAGEN REPLI-g kit.キットを使用して、元のgDNAサンプルで全ゲノム増幅を実行します。
利用できないポアの割合が多い場合 サンプル内に不純物が含まれている 不純物の影響は、 Contaminants の ノウハウを参照して下さい。 サンプルDNAに不純物を残留させないために別の抽出方法をお試しください。

温度変動

問題点 予想される原因 解決策とコメント
温度変動 フローセルとデバイスの接続が途切れている。 フローセルの背面にある金属プレートを覆っているヒートパッドがあることを確認してください。 フローセルを再度挿入し、コネクターピンがデバイスにしっかりと接触していることを確認するために軽く押してください。問題が解決しない場合は、テクニカルサービスにご連絡してください。

目標温度に到達しない場合

問題点 予想される原因 解決策とコメント
MinKNOWが "Failed to reach target temperature "(目標温度に達しなかった)と表示する。" 装置が通常の室温より低い場所、または風通しの悪い場所（排気が出来ない場所）に置かれた時にフローセルが過熱してします。 MinKNOWでは、フローセルが目標温度に到達するまでの既定の時間枠があります。時間枠を超えると、エラーメッセージが表示され、シークエンシング実験が続行されます。しかし、不適切な温度でシークエンスを行うと、スループットが低下し、qスコアが低下する可能性があります。シークエンシングデバイスが風通しの良い室温に置かれていることを確認して、MinKNOW再スタートしてください。MinION Mk 1Bの温度制御の詳細については、FAQ を参照してください。

Last updated: 9/30/2024

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