Ligation sequencing amplicons V14 (SQK-LSK114)
GridION: Protocol
Ligation sequencing amplicons V14 (SQK-LSK114) V ACDE_9163_v114_revU_29Jun2022
- This protocol uses amplicon DNA
- Library preparation time ~60 minutes
- Fragmentation optional
- No PCR
For Research Use Only
FOR RESEARCH USE ONLY
Contents
Introduction to the protocol
Library preparation
- 3. End-prep
- 4. Ligación de los adaptadores y purificación
- 5. Cebado y carga de la celda de flujo MinION/GridION
Secuenciación y análisis
- 6. Adquisición de datos e identificación de bases
- 7. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo
- 8. Análisis
Resolución de problemas
Descripción general
- This protocol uses amplicon DNA
- Library preparation time ~60 minutes
- Fragmentation optional
- No PCR
For Research Use Only
1. Overview of the protocol
Introduction to the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) protocol
This protocol describes how to carry out sequencing of amplicon sample using the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114). It is recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.
Steps in the sequencing workflow:
Prepare for your experiment
You will need to:
- Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
- Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
- Download the software for acquiring and analysing your data
- Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run
Library preparation
The table below is an overview of the steps required in the library preparation, including timings and stopping points.
| Library preparation step | Process | Time | Stop option |
|---|---|---|---|
| End-prep | Prepare the DNA ends for adapter attachment. | 35 minutes | 4°C overnight |
| Adapter ligation and clean-up | Attach sequencing adapters to the DNA ends and perform a bead clean-up. | 30 minutes | 4°C short-term storage or for repeated use, such as re-loading your flow cell. -80°C for single-use long-term storage. We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted. |
| Priming and loading the flow cell | Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing. | 5 minutes |
Sequencing and analysis
You will need to:
- Start a sequencing run using the MinKNOW software which will collect raw data and convert it into basecalled reads
IMPORTANTE
Compatibilidad del protocolo
Este protocolo debería usarse solo en combinación con los siguientes productos:
- Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
- Control Expansion (EXP-CTL001) (material complementario de control)
- Flow Cell R10.4.1 (FLO-MIN114) (celda de flujo)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
- MinION Mk1B - Requisitos informáticos del MinION Mk1B (en inglés)
- MinION Mk1C - Requisitos informáticos del MinION Mk1C (en inglés)
- GridION - Requisitos informáticos del GridION (en inglés)
2. Equipment and consumables
Material
- 100-200 fmol of amplicon DNA
- Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) (kit de secuenciación por ligación V14)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (NEB E7546) (Módulo de reparación de extremos/Adición de dA)
- Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
- Microcentrífuga
- Mezclador vórtex
- Termociclador
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Cubeta con hielo
- Temporizador
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
For this protocol, we recommend 100-200 fmol of amplicon DNA.
However, adjust your sample input quantity depending on your amplicon DNA sample length:
| Fragment library length | Starting input |
|---|---|
| Very short (<1 kb) | 200 fmol |
| Short (1-10 kb) | 100–200 fmol |
| Long (>10 kb) | 1 µg |
For more information on sample input and flow cell loading amounts for our ligation sequencing protocols please visit our know-how document.
Cantidad de muestra inicial de ADN
Cómo realizar un control de calidad del ADN de la muestra inicial
Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.
Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC
Contaminantes químicos
Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.
NEB reagents for our amplicon Ligation Sequencing protocols.
Please note, for our amplicon protocols, NEBNext FFPE DNA Repair Mix is not required.
We recommend purchasing the required NEB reagents separately as this is more cost effective:
- NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB, E7546)
- Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| Flongle | 50 |
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
IMPORTANTE
A fin de garantizar un elevado rendimiento de ligación del adaptador Ligation Adapter (LA), recomendamos el uso del tampón Ligation Buffer (LNB) incluido en el kit Ligation Sequencing Kit V14, en lugar del tampón de ligasa de otros fabricantes.
IMPORTANTE
El adaptador incluido en este kit, Ligation Adapter (LA), no es intercambiable con otros adaptadores de secuenciación.
Contenido del kit Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
Nota: Hemos cambiando el formato de nuestros kits; hemos sustituido algunos de los viales de un solo uso por botellas de mayor contenido.
Formato de tubos monouso 
Formato en botella 
Nota: este producto contiene un reactivo, AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter Inc., que puede conservarse con el kit a -20 °C sin perjudicar su estabilidad.
Nota: la muestra de control de ADN (DCS) es un amplicón estándar de 3,6 kb, que mapea el extremo 3' del genoma Lambda.
3. End-prep
Material
- 100-200 fmol amplicon DNA
- DNA Control Sample (DCS) (muestra de control)
- AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
Consumibles
- NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
- NEBNext® Ultra II End Prep Reaction Buffer from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P10
- Thermal cycler
- Microcentrífuga
- Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
- Gradilla magnética
- Cubeta con hielo
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
CHECKPOINT
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos se verifique la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.
Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.
Descongelar el reactivo DNA Control Sample (DCS) a temperatura ambiente, centrifugar, mezclar con la pipeta y poner en hielo.
Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:
For optimal performance, NEB recommend the following:
Thaw all reagents on ice.
Ensure the reagents are well mixed.
Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.Always spin down tubes before opening for the first time each day.
The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.
Prepare the DNA in nuclease-free water:
- Transfer 100-200 fmol of amplicon DNA into a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
- Adjust the volume to 49 μl with nuclease-free water
- Mix thoroughly by pipetting up and down, or by flicking the tube
- Spin down briefly in a microfuge
In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:
Between each addition, pipette mix 10-20 times.
| Reagent | Volume |
|---|---|
| DNA CS | 1 µl |
| DNA | 49 µl |
| Ultra II End-prep Reaction Buffer | 7 µl |
| Ultra II End-prep Enzyme Mix | 3 µl |
| Total | 60 µl |
Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.
Incubar en el termociclador, primero a 20 ºC durante 5 minutos y después a 65 ºC durante 5 minutos más.
Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.
Transferir la muestra de ADN a un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.
Añadir 60 µl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción de preparación de extremos y mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo.
Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Preparar 500 µl de etanol al 80 %, con agua sin nucleasas.
Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.
Dejar el tubo en el imán y lavar el agregado de microesferas, con cuidado de no desplazarlo, con 200 µl de etanol al 80 %. Retirar el etanol con una pipeta y desechar.
Repetir el paso anterior.
Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.
Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 61 µl de agua sin nucleasas. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Extraer 61 µl de eluido y guardar en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.
CHECKPOINT
Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.
FIN DEL PROCESO
Una vez el ADN está reparado y con los extremos preparados, se puede proceder a la ligación del adaptador. En este punto, también se puede guardar la muestra a 4 ⁰C hasta el día siguiente.
4. Ligación de los adaptadores y purificación
Material
- Ligation Adapter (LA) (adaptador de ligación)
- Ligation Buffer (LNB) (tampón de ligación) del kit Ligation Sequencing Kit
- Long Fragment Buffer (LFB) (tampón para fragmentos largos)
- Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
- AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
- Elution Buffer (EB) (tampón de elución) del kit de Oxford Nanopore
Consumibles
- Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
- Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
- Gradilla magnética
- Microcentrífuga
- Mezclador vórtex
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
CONSEJO
Recomendamos utilizar Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467).
La ligasa Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467) puede adquirirse por separado o como parte del NEBNext® Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (ref. E7672S or E7672L).
La ligasa Quick T4 DNA Ligase (NEB, E6057), disponible en la versión anterior —NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L)— también es compatible, pero los nuevos reactivos recomendados ofrecen mayor eficacia y ligación.
IMPORTANTE
Aunque la ligasa recomendada de otros fabricantes se suministra con su propio tampón, la eficiencia del adaptador, Ligation Adapter (LA), es mayor cuando se usa el tampón Ligation Buffer (LNB) suministrado en el kit Ligation Sequencing Kit.
Centrifugar los viales Ligation Adapter (LA) y Salt-T4® DNA Ligase y poner en hielo.
Descongelar el vial Ligation Buffer (LNB) a temperatura ambiente, centrifugar y mezclar con la pipeta. Debido a su viscosidad, la agitación en vórtex de este tampón es ineficaz. Tras descongelar y mezclar, colocar en hielo inmediatamente.
Descongelar el vial Elution Buffer (EB) a temperatura ambiente, agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
IMPORTANTE
La fase de lavados tras la ligación de los adaptadores está diseñada para enriquecer los fragmentos de ADN de >3 kb o para purificar todos los fragmentos por igual, según el tampón que se utilice -Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).
Para enriquecer fragmentos de ADN de 3 kb o mayores, utilizar el tampón para fragmentos largos, Long Fragment Buffer (LFB).
Para conservar fragmentos de ADN de todos los tamaños, utilizar el tampón para fragmentos cortos, Short Fragment Buffer (SFB).
Descongelar el vial Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) a temperatura ambiente, agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
En un tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml mezclar en el siguiente orden:
Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| Muestra de ADN del paso anterior | 60 µl |
| Ligation Adapter (LA) | 5 µl |
| Ligation Buffer (LNB) | 25 µl |
| Salt-T4® DNA Ligase | 10 µl |
| Total | 100 µl |
Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.
Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.
Añadir 40 μl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción y mezclar dando suaves golpes al tubo con el dedo.
Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.
Lavar las microesferas magnéticas con 250 μl o de Long Fragment Buffer (LFB) o de Short Fragment Buffer (SFB). Golpear el tubo suavemente con el dedo para resuspender las microesferas, centrifugar, colocar en la gradilla magnética y dejar que las microesferas precipiten. Retirar el sobrenadante con una pipeta y desechar.
Repetir el paso anterior.
Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.
Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 15 µl de Elution Buffer (EB). Centrifugar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tratándose de ADN de alto peso molecular, incubar a 37 ⁰C puede mejorar la recuperación de fragmentos largos.
Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.
Extraer 15 μl del eluido que contiene la biblioteca de ADN y conservar en un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.
Deshechar las microesferas precipitadas.
CHECKPOINT
Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.
Según el tamaño de los fragmentos de la biblioteca de ADN, prepare la biblioteca final en 12 µl de Elution Buffer (EB).
| Longitud de fragmentos | Cantidad a cargar en la celda de flujo |
|---|---|
| Muy cortos (<1 kb) | 100 fmol |
| Cortos (1-10 kb) | 35–50 fmol |
| Largos (>10 kb) | 300 ng |
Nota: Si el producto obtenido en la biblioteca está por debajo de la cantidad de muestra inicial recomendada, cargue la biblioteca entera.
Si es necesario, recomendamos utilizar una calculadora de masa a mol, como la calculadora de NEB.
FIN DEL PROCESO
La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo o a 4 °C hasta el momento de cargar.
CONSEJO
Recomendaciones de guardado de la biblioteca
Se recomienda guardar las bibliotecas en tubos Eppendorf DNA LoBind a 4 ⁰C, durante periodos de tiempo cortos o en caso de uso repetido, por ejemplo, para recargar celdas de flujo entre lavados. Para uso individual y para conservar a largo plazo por periodos de más de 3 meses, se recomienda guardar las bibliotecas a -80 ⁰C en tubos Eppendorf DNA LoBind.
5. Cebado y carga de la celda de flujo MinION/GridION
Material
- Flow Cell Flush (FCF)
- Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
- Library Solution (LIS)
- Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
- Sequencing Buffer (SB)
Consumibles
- Celda de flujo MinION/GridION
- Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
- Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
- (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
Instrumental
- Dispositivo MinION o GridION
- Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE
Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).
CONSEJO
Cebado y carga de la celda de flujo
Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.
IMPORTANTE
Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.
Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).
Para preparar la mezcla de cebado con seroalbúmina bovina, mezclar Flow Cell Flush (FCF) y Flow Cell Tether (FCT) como se indica a continuación. Mezclar con la pipeta a temperatura ambiente.
Nota: Hemos cambiando el formato de algunos de los viales de nuestros kits, de tubos monouso a botellas de mayor cantidad.
Formato en tubos monouso En el tubo de Flow Cell Flush (FCF), añadir directamente 5 µl de seroalbúmina bovina (BSA), a una concentración de 50 mg/ml y 30 µl de Flow Cell Tether (FCT).
Formato en botella: En un tubo proporcionado a la cantidad de celdas de flujo que se vayan a utilizar, mezclar los siguientes reactivos:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Flow Cell Flush (FCF) | 1 170 µl |
| Bovine Serum Albumin (BSA) a una concentración de 50 mg/ml | 5 µl |
| Flow Cell Tether (FCT) | 30 µl |
| Volumen total | 1 205 µl |
Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.
MEDIDA OPCIONAL
Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.
Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.
Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.
Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.
IMPORTANTE
Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.
Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.
Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).
IMPORTANTE
Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.
En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.
En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 37,5 µl |
| Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere | 25,5 µl |
| Biblioteca de ADN | 12 µl |
| Total | 75 µl |
Completar el cebado de la celda de flujo:
- Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
- Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.
Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.
Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.
Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.
IMPORTANTE
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
ATENCIÓN
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.
FIN DEL PROCESO
Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.
6. Adquisición de datos e identificación de bases
Cómo empezar a secuenciar
Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.
Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:
- En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o en remoto.
- Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.
Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:
Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:
1. Ir a la página de inicio y pulsar "Iniciar secuenciación".
2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de muestra.
3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.
4. Configurar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o dejar la configuración por defecto en la pestaña Configuración del experimento.
Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, se puede activar en MinKNOW en la fase posejecución. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.
5. En la página de Inicio, pulsar Iniciar la secuenciación.
Identificación de bases duplex
La química del kit 14 ha mejorado la identificación de bases duplex, la cual requiere, tras realizar la identificación de bases simplex en MinKNOW, volver a identificar las bases en el programa Dorado con herramientas de identificación de bases duplex.
Para obtener información detallada sobre la configuración de un experimento de secuenciación, tanto para la identificación de bases simplex, como para la duplex, consultar la hoja informativa Kit 14 sequencing and duplex basecalling.
Nota: Mientras Dorado se esté ejecutando, recomendamos parar otros procesos de identificación de bases, para potenciar la memoria disponible en el programa. Esta acción se puede detener y reiniciar, cuando Dorado haya terminado, a través de la interfaz gráfica de MinKNOW.
Análisis de datos
Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.
Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y de análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.
En la sección Análisis posterior, se describen otras opciones para analizar los datos.
7. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo
Material
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)
Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.
El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.
CONSEJO
Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.
Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.
IMPORTANTE
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
8. Análisis
Análisis posterior a la identificación de bases
Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de identificación de bases:
1. Procesos de trabajo en EPI2ME
Para realizar un análisis de datos exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y procesos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, situados en la sección EPI2ME Labs de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los procesos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
2. Herramientas de análisis
El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.
3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad
Si en ninguno de los recursos anteriores se proporciona un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.
9. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) | El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI. |
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas. |
Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Escasa recuperación | Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. | 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza. |
| Escasa recuperación | Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado | Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar.  |
| Escasa recuperación tras la preparación de extremos | El paso de lavado utilizó etanol a <70 % | Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto. |
10. Problemas durante el experimento de secuenciación
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales. |
Ocupación de poro por debajo del 40 %
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Ocupación de poro <40 % | No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo | Procure cargar la biblioteca al volumen y la concentración adecuados, tal como se indica en el protocolo correspondiente. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular fmoles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, (opción "dsDNA: μg to fmol"). |
| Ocupación de poro próxima a 0 | Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN | En la fase de ligación del adaptador, utilice NEBNext Quick Ligation Module (E6056) y el tampón Ligation Buffer (LNB) de Oxford Nanopore Technologies, suministrado en el kit de secuenciación. Recuerde añadir la cantidad correcta de cada reactivo. Prepare una biblioteca de control con lambda para valorar la integridad de los reactivos de otros fabricantes. |
| Ocupación de poro próxima a 0 | Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y en la fase de lavado, después de la ligación del adaptador, se utilizó etanol en lugar de Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB). | El etanol puede desnaturalizar la proteína motor en los adaptadores de secuenciación. Usar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) después de la ligación de los adaptadores. |
| Ocupación de poro próxima a 0 | No hay anclaje en la celda de flujo | Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (Flush Tether (FLT) para los kits 9, 10 y 11, y Flow Cell Tether (FCT) para el kit 14). Asegurarse de añadir un anclaje —Flush Tether (FLT) o Flow Cell Tether (FCT)— al tampón antes del cebado; el tampón utilizado es Flush Buffer (FB) para los kits 9, 10 y 11 y Flow cell Flush (FCF) para el Kit 14. |
Longitud de lectura más corta de lo esperado
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Longitud de lectura más corta de lo esperado | Fragmentación no deseada de la muestra de ADN | La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.  En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente. |
Gran proporción de poros no disponibles
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)  Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles. | Hay contaminantes presentes en la muestra | Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Ciertos compuestos copurificados con ADN | Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Fluctuación de la temperatura
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observación | Posible causa | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ. |
Last updated: 8/21/2024
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