MinION: Protocol

Ligation sequencing gDNA - whole genome amplification (SQK-LSK110) V WAL_9115_v110_revH_10Nov2020

For research use only

This is a Legacy product This kit is soon to be discontinued and we recommend all customers to upgrade to the latest chemistry for their relevant kit which is available on the Store. If customers require further support for any ongoing critical experiments using a Legacy product, please contact Customer Support via email: support@nanoporetech.com.

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

For research use only

Document version: WAL_9115_v110_revH_10Nov2020

1. Overview of the protocol

IMPORTANTE

This is a Legacy product

This kit is soon to be discontinued and we recommend all customers to upgrade to the latest chemistry for their relevant kit which is available on the Store. If customers require further support for any ongoing critical experiments using a Legacy product, please contact Customer Support via email: support@nanoporetech.com. For further information on please see the product update page.

Overview

Oxford Nanopore Technologies' range of sequencing kits is designed to prepare DNA and RNA libraries using 10 ng input material or more. We have now adapted a method for whole genome amplification for use with nanopore devices. The Qiagen REPLI-g Midi kit works on as little as 10 pg bacterial DNA and yields up to 40 µg DNA. After amplification, the sample is treated with T7 Endonuclease I, which resolves the hyperbranched structure of the WGA product and allows to obtain average qscores which are similar to those obtained without WGA.

Using the whole genome amplification protocol results in shorter fragment lengths - mostly up to 5 kb - than preparing a DNA library using the Ligation Sequencing Kit.

Introduction to the whole genome amplification protocol

This protocol describes how to carry out sequencing of genomic DNA using the Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK110). It is highly recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
Download the software for acquiring and analysing your data
Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

You will need to:

Amplify the genomic DNA using random primers
Digest the amplified DNA with T7 Endonuclease I to remove branching, and size-select for longer fragments using AMPure XP beads
Prepare the DNA ends for adapter attachment
Attach sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell

Sequencing and analysis

You will need to:

Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
Start the EPI2ME software and select a workflow for further analysis (this step is optional)

IMPORTANTE

This protocol was developed using E. coli gDNA. If using a different type of sample, please refer to the QIAGEN protocol for advice on how to modify the sample prep accordingly.

IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK110)
Control Expansion (EXP-CTL001)
R9.4.1 (FLO-MIN106D) flow cells
Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)

2. Equipment and consumables

Material

10 pg high molecular weight genomic DNA
Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK110)
Qiagen REPLI-g Midi Kit

Consumibles

Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB E7180S or E7180L) (módulo de acompañamiento NEBNext de secuenciación por ligación para Oxford Nanopore Technologies®) Como alternativa, se pueden utilizar los siguientes productos de NEBNext®:
NEBNext FFPE Repair Mix (NEB M6630) (mezcla de reparación de ADN)
NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (NEB E7546) (Módulo de reparación de extremos/Adición de dA)
NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056) (Módulo de ligación rápida)
Covaris g-TUBE
Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
Etanol al 70 % recién preparado en agua sin nucleasas
T7 Endonuclease I (NEB, cat # M0302)
TE buffer: 10 mM Tris (pH 8.0), 0.1 mM EDTA
PEG 8000, 50% w/v (Rigaku Reagents, 25322-68-3)
0.5 M EDTA, pH 8 (Thermo Scientific, R1021)
5 M NaCl (Sigma, 71386)
1 M Tris-HCl pH 8.0 (Thermo Scientific, 15893661)

Instrumental

Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
Microcentrífuga
Mezclador vórtex
Heating block at 37°C capable of taking 1.5 ml tubes
Termociclador
Cubeta con hielo
Temporizador
Pipeta y puntas P1000
Pipeta y puntas P200
Pipeta y puntas P100
Pipeta y puntas P20
Pipeta y puntas P10
Pipeta y puntas P2

Equipo opcional

Standard gel electrophoresis equipment
Bioanalizador Agilent (o equivalente)
Qubit fluorometer (or equivalent for QC check)
Centrifuga Eppendorf 5424 (o equivalente)

For this protocol, you will need 10 pg high molecular weight genomic DNA.

Cantidad de muestra inicial de ADN

Cómo realizar un control de calidad de la muestra inicial de ADN

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

NEBNext® Companion Module para secuenciación por ligación, de Oxford Nanopore Technologies®

A los clientes que no conozcan la secuenciación por nanoporos, se les recomienda que adquieran el módulo de acompañamiento NEBNext® Ligation Sequencing para Oxford Nanopore Technologies® (NEB E7180S o E7180L), que contiene todos los reactivos NEB necesarios para usar con el kit Ligation Sequencing Kit.

Nótese que en los protocolos con amplicones no es necesario usar ni la mezcla de reparación de ADN NEBNext FFPE DNA Repair Mix, ni el tampón de reparación de ADN NEBNext FFPE DNA Repair Buffer.

Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK110) contents

Name	Acronym	Cap colour	No. of vials	Fill volume per vial (µl)
DNA CS	DCS	Yellow	1	35
Adapter Mix F	AMX-F	Green	1	40
Ligation Buffer	LNB	Clear	1	200
L Fragment Buffer	LFB	White cap, orange stripe on label	2	1,800
S Fragment Buffer	SFB	Grey	2	1,800
Sequencing Buffer II	SBII	Red	1	500
Elution Buffer	EB	Black	1	200
Loading Beads II	LBII	Pink	1	360
Loading Solution	LS	White cap, pink sticker on label	1	360
Flush Buffer	FB	Blue	6	1,170
Flush Tether	FLT	Purple	1	200

3. Computer requirements and software

Requisitos informáticos para el MinION Mk1B

Para secuenciar con el MinION Mk1B es necesario tener un ordenador o portátil de alto rendimiento, que pueda soportar la velocidad de adquisición de datos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1B IT Requirements.

Requisitos informáticos para el MinION Mk1C

El MinION Mk1C contiene ordenador y pantalla integrados, lo que elimina la dependencia de cualquier accesorio para generar y analizar datos de nanoporos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1C IT Requirements.

Software for nanopore sequencing

MinKNOW

The MinKNOW software controls the nanopore sequencing device, collects sequencing data and basecalls in real time. You will be using MinKNOW for every sequencing experiment to sequence, basecall and demultiplex if your samples were barcoded.

For instructions on how to run the MinKNOW software, please refer to the MinKNOW protocol.

EPI2ME (optional)

The EPI2ME cloud-based platform performs further analysis of basecalled data, for example alignment to the Lambda genome, barcoding, or taxonomic classification. You will use the EPI2ME platform only if you would like further analysis of your data post-basecalling.

For instructions on how to create an EPI2ME account and install the EPI2ME Desktop Agent, please refer to the EPI2ME Platform protocol.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo	Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle	50
MinION/GridION	800
PromethION	5000

4. Whole genome amplification

Material

10 pg high molecular weight genomic DNA
Qiagen REPLI-g Midi Kit

Consumibles

Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
T7 Endonuclease I (NEB, cat # M0302)
Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
Etanol al 70 % recién preparado en agua sin nucleasas
TE buffer: 10 mM Tris (pH 8.0), 0.1 mM EDTA
PEG 8000, 50% w/v (Rigaku Reagents, 25322-68-3)
0.5 M EDTA, pH 8 (Thermo Scientific, R1021)
5 M NaCl (Sigma, 71386)
1 M Tris-HCl pH 8.0 (Thermo Scientific, 15893661)

Instrumental

Termociclador
Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
Cubeta con hielo

Equipo opcional

Qubit fluorometer (or equivalent for QC check)

Steps 2-8 are from the REPLI-g protocol, included here for completeness.

Transfer 10 pg genomic DNA into a DNA LoBind tube
Adjust the volume to 5 μl with nuclease-free water
Mix thoroughly by inversion avoiding unwanted shearing
Spin down briefly in a microfuge

DLB:

Reagent	Volume
DLB buffer	9 µl
Nuclease-free water	32 µl
Total	41 µl

Stop Solution:

Reagent	Volume
Stop Solution	12 µl
Nuclease-free water	68 µl
Total	80 µl

Reagent	Volume
Input gDNA, 10 pg	5 µl
Reconstituted DLB buffer	5 µl
Total	10 µl

Reagent	Volume
REPLI-g Midi Reaction Buffer	29 µl
REPLI-g Midi DNA Polymerase	1 µl
Total	30 µl

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

Reagent	Volume
1.5 µg of amplified DNA	x µl
NEBuffer 2	3 µl
T7 Endonuclease I	1.5 µl
Nuclease-free water	25.5-x µl
Total	30 µl

Reagent	Volume
1 M Tris-HCl	20 μl
0.5 M EDTA pH 8	4 μl
5 M NaCl	640 μl
PEG 8000	440 μl
Nuclease-free water	888 μl
Total	1992 μl

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of DNA using a Qubit fluorometer - recovery aim ~700 ng.

FIN DEL PROCESO

Take forward approximately 700 ng of DNA in 48 µl into the DNA repair and end-prep step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

5. DNA repair and end-prep

Material

gDNA in 47 µl nuclease-free water

Consumibles

Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
NEBNext FFPE DNA Repair Mix (NEB M6630)
NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB E7546)
Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water

Instrumental

Pipeta y puntas P1000
Pipeta y puntas P100
Pipeta y puntas P10
Thermal cycler
Microcentrífuga
Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
Gradilla magnética
Cubeta con hielo

Para obtener un rendimiento óptimo, NEB recomienda lo siguiente:

Descongelar todos los reactivos en hielo.
Golpear suavemente los tubos de reactivos con el índice o invertirlos, para asegurarse de que estén bien mezclados.
Nota: No mezclar en vórtex las mezclas FFPE DNA Repair Mix, ni Ultra II End Prep Enzyme Mix.
Centrifugar los tubos antes de abrirlos.
Los tampones Ultra II End Prep Buffer y FFPE DNA Repair Buffer pueden tener un poco de precipitado. Dejar que la mezcla alcance la temperatura ambiente y mezclar pipeteando varias veces para romper el precipitado; para solubilizarlo, agitar el tubo en vórtex durante 30 s.
Nota: Es importante mezclar bien los tampones mediante vórtex.
El tampón FFPE DNA Repair Buffer puede tener un matiz amarillo; no importa si está así; se puede utilizar.

Between each addition, pipette mix 10-20 times

Reagent	Volume
DNA	48 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Buffer	3.5 µl
Ultra II End-prep reaction buffer	3.5 µl
Ultra II End-prep enzyme mix	3 µl
NEBNext FFPE DNA Repair Mix	2 µl
Total	60 µl

IMPORTANTE

AMPure XP bead clean-up

It is recommended that the repaired/end-prepped DNA sample is subjected to the following clean-up with AMPure XP beads. This clean-up can be omitted for simplicity and to reduce library preparation time. However, it has been observed that omission of this clean-up can: reduce subsequent adapter ligation efficiency, increase the prevalence of chimeric reads, and lead to an increase in pores being unavailable for sequencing. If omitting the clean-up step, proceed to the next section.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

FIN DEL PROCESO

Una vez el ADN está reparado y con los extremos preparados, se puede proceder a la ligación del adaptador. En este punto, también se puede guardar la muestra a 4 ⁰C hasta el día siguiente.

6. Adapter ligation and clean-up

Material

Adapter Mix F (AMX F)
Ligation Buffer (LNB) (tampón de ligación) del kit Ligation Sequencing Kit
Long Fragment Buffer (LFB) (tampón para fragmentos largos)
Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
Elution Buffer (EB) (tampón de elución) del kit de Oxford Nanopore

Consumibles

NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056) (Módulo de ligación rápida)
Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)

Instrumental

Gradilla magnética
Microcentrífuga
Mezclador vórtex
Pipeta y puntas P1000
Pipeta y puntas P100
Pipeta y puntas P20
Pipeta y puntas P10

IMPORTANTE

Although the recommended 3rd party ligase is supplied with its own buffer, the ligation efficiency of Adapter Mix F (AMX-F) is higher when using Ligation Buffer supplied within the Ligation Sequencing Kit.

IMPORTANTE

La fase de lavados tras la ligación de los adaptadores está diseñada para enriquecer los fragmentos de ADN de >3 kb o para purificar todos los fragmentos por igual, según el tampón que se utilice -Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).

Para enriquecer fragmentos de ADN de 3 kb o mayores, utilizar el tampón para fragmentos largos, Long Fragment Buffer (LFB).
Para conservar fragmentos de ADN de todos los tamaños, utilizar el tampón para fragmentos cortos, Short Fragment Buffer (SFB).

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent	Volume
DNA sample from the previous step	60 µl
Ligation Buffer (LNB)	25 µl
NEBNext Quick T4 DNA Ligase	10 µl
Adapter Mix F (AMX-F)	5 µl
Total	100 µl

IMPORTANTE

If you have omitted the AMPure purification step after DNA repair and end-prep, do not incubate the reaction for longer than 10 minutes.

Deshechar las microesferas precipitadas.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

IMPORTANTE

We recommend loading 5-50 fmol of the final prepared library onto a flow cell.

Loading more than the maximal recommended amount of DNA can have a detrimental effect on output as higher quantities of DNA results in a larger number of ligated DNA ends with loaded motor protein. This depletes fuel in the Sequencing Buffer, regardless of whether or not the DNA fragments are being sequenced. This leads to fuel depletion and speed drop-off early in the sequencing run. Dilute the libraries in Elution Buffer if required.

If you are using the Flongle for sample prep development, we recommend loading 3-20 fmol instead.

FIN DEL PROCESO

La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo o a 4 °C hasta el momento de cargar.

CONSEJO

Library storage recommendations

We recommend storing libraries in Eppendorf DNA LoBind tubes at 4°C for short term storage or repeated use, for example, reloading flow cells between washes. For single use and long-term storage of more than 3 months, we recommend storing libraries at -80°C in Eppendorf DNA LoBind tubes. For further information, please refer to the DNA library stability Know-How document.

MEDIDA OPCIONAL

If quantities allow, the library may be diluted in Elution Buffer (EB) for splitting across multiple flow cells.

Additional buffer for doing this can be found in the Sequencing Auxiliary Vials expansion (EXP-AUX002), available to purchase separately. This expansion also contains additional vials of Sequencing Buffer II (SBII) and Loading Beads II (LBII), required for loading the libraries onto flow cells.

7. Priming and loading the SpotON flow cell

Material

Flush Buffer (FB)
Flush Tether (FLT)
Loading Beads II (LBII)
Sequencing Buffer II (SBII)
Loading Solution (LS)

Consumibles

Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind

Instrumental

MinION device
SpotON Flow Cell
Pipeta y puntas P1000
Pipeta y puntas P100
Pipeta y puntas P20

CONSEJO

Priming and loading a MinION flow cell

We recommend all new users watch the 'Priming and loading your flow cell' video before your first run.

Using the Loading Solution

We recommend using the Loading Beads II (LBII) for loading your library onto the flow cell for most sequencing experiments. However, if you have previously used water to load your library, you must use Loading Solution (LS) instead of water. Note: some customers have noticed that viscous libraries can be loaded more easily when not using Loading Beads II.

Press down firmly on the flow cell to ensure correct thermal and electrical contact.

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.

IMPORTANTE

The Loading Beads II (LBII) tube contains a suspension of beads. These beads settle very quickly. It is vital that they are mixed immediately before use.

Reagent	Volume per flow cell
Sequencing Buffer II (SBII)	37.5 µl
Loading Beads II (LBII) mixed immediately before use, or Loading Solution (LS), if using	25.5 µl
DNA library	12 µl
Total	75 µl

Note: Load the library onto the flow cell immediately after adding the Sequencing Buffer II (SBII) and Loading Beads II (LBII).

Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

8. Adquisición de datos e identificación de bases

Cómo empezar a secuenciar

Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.

Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:

En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o en remoto.
Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.

Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:

Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:

1. Ir a la página de inicio y pulsar "Iniciar secuenciación".

2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de muestra.

3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.

4. Configurar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o dejar la configuración por defecto en la pestaña Configuración del experimento.

Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, se puede activar en MinKNOW en la fase posejecución. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.

5. En la página de Inicio, pulsar Iniciar la secuenciación.

Análisis de datos

Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.

Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y de análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.

En la sección Análisis posterior, se describen otras opciones para analizar los datos.

9. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo

Material

Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

10. Análisis posterior

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:

1. Flujos de trabajo de EPI2ME

A fin de realizar un análisis en profundidad de los datos, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales sobre bioinformática y flujos de trabajo, que están disponibles en EPI2ME. La plataforma proporciona un espacio donde los flujos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis para la investigación

Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y flujos de trabajo bioinformáticos, disponibles en EPI2ME Labs, que encontrará en la sección del mismo nombre de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los proyectos que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte el centro de recursos Resource Centre y busque herramientas bioinformáticas para su aplicación. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/programas informáticos.

11. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2)	El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria	Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel).	El ARN se degradó durante la extracción	Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado	El ARN se degradó durante la extracción	Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación	Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto.	1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación	Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado	Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar.
Escasa recuperación tras la preparación de extremos	El paso de lavado utilizó etanol a <70 %	Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

12. Issues during the sequencing run

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo	Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos	Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo	La celda de flujo no está colocada correctamente	Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo	La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros	El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"		Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Pore occupancy below 40%

Observation	Possible cause	Comments and actions
Pore occupancy <40%	Not enough library was loaded on the flow cell	Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0	The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA	Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the sequencing kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents.
Pore occupancy close to 0	The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation	Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0	No tether on the flow cell	Tethers are adding during flow cell priming (FLT/FCT tube). Make sure FLT/FCT was added to FB/FCF before priming.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado	Fragmentación no deseada de la muestra de ADN	La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado. 3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros) Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.	Hay contaminantes presentes en la muestra	Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones: 1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) 2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible)	Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo	Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles	Ciertos compuestos copurificados con ADN	Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas. 1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method. 2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro. 3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles	Hay contaminantes presentes en la muestra	Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Reducción de la velocidad de secuenciación y del índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Reducción de la velocidad de secuenciación y el índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación	En la química del kit 9 (p. ej., SQK-LSK109), cuando la celda de flujo está sobrecargada con la biblioteca se observa un consumo rápido de combustible (consulte el protocolo correspondiente a su biblioteca de ADN para ver las recomendaciones)	Añadir más combustible a la celda de flujo, siguiendo las instrucciones en el protocolo de MinKNOW. En futuros experimentos, cargar cantidades menores de biblioteca en la celda de flujo.

Fluctuación de la temperatura

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura	La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo	Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación	Posible causa	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada"	El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo).	MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ.

Guppy – no input .fast5 was found or basecalled

Observation	Possible cause	Comments and actions
No input .fast5 was found or basecalled	input_path did not point to the .fast5 file location	The --input_path has to be followed by the full file path to the .fast5 files to be basecalled, and the location has to be accessible either locally or remotely through SSH.
No input .fast5 was found or basecalled	The .fast5 files were in a subfolder at the input_path location	To allow Guppy to look into subfolders, add the --recursive flag to the command

Guppy – no Pass or Fail folders were generated after basecalling

Observation	Possible cause	Comments and actions
No Pass or Fail folders were generated after basecalling	The --qscore_filtering flag was not included in the command	The --qscore_filtering flag enables filtering of reads into Pass and Fail folders inside the output folder, based on their strand q-score. When performing live basecalling in MinKNOW, a q-score of 7 (corresponding to a basecall accuracy of ~80%) is used to separate reads into Pass and Fail folders.

Guppy – unusually slow processing on a GPU computer

Observation	Possible cause	Comments and actions
Unusually slow processing on a GPU computer	The --device flag wasn't included in the command	The --device flag specifies a GPU device to use for accelerate basecalling. If not included in the command, GPU will not be used. GPUs are counted from zero. An example is --device cuda:0 cuda:1, when 2 GPUs are specified to use by the Guppy command.

Device:

London Calling 2025

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Documentation

Nanopore Learning

Ligation sequencing gDNA - whole genome amplification (SQK-LSK110)

Introduction to the protocol

Library preparation

Secuenciación y análisis de datos

Troubleshooting

Document versions

MinION: Protocol

Ligation sequencing gDNA - whole genome amplification (SQK-LSK110) V WAL_9115_v110_revH_10Nov2020

Contents

Introduction to the protocol

Library preparation

Secuenciación y análisis de datos

Troubleshooting

Descripción general

1. Overview of the protocol

IMPORTANTE

This is a Legacy product

Overview

Introduction to the whole genome amplification protocol

IMPORTANTE

This protocol was developed using E. coli gDNA. If using a different type of sample, please refer to the QIAGEN protocol for advice on how to modify the sample prep accordingly.

IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

2. Equipment and consumables

Material

Consumibles

Instrumental

Equipo opcional

For this protocol, you will need 10 pg high molecular weight genomic DNA.

Cantidad de muestra inicial de ADN

Cómo realizar un control de calidad de la muestra inicial de ADN

Contaminantes químicos

NEBNext® Companion Module para secuenciación por ligación, de Oxford Nanopore Technologies®

Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK110) contents

3. Computer requirements and software

Requisitos informáticos para el MinION Mk1B

Requisitos informáticos para el MinION Mk1C

Software for nanopore sequencing

MinKNOW

EPI2ME (optional)

Verificar la celda de flujo

4. Whole genome amplification

Material

Consumibles

Instrumental

Equipo opcional

Steps 2-8 are from the REPLI-g protocol, included here for completeness.

Prepare the DNA in nuclease-free water.

Reconstitute the DLB buffer and Stop Solution from the Qiagen REPLI-g Midi kit as follows:

In a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, mix the following:

Incubate the reaction for 3 minutes at room temperature.

Add 10 µl of reconstituted Stop Buffer to the reaction and mix by pipetting.

In a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, mix the following:

Add the REPLI-g Midi polymerase mastermix to the DNA reaction, and mix by pipetting.

Transfer the sample to a clean 0.2 ml PCR tube, and incubate for 16 hours at 30° C and 3 minutes at 65° C using the thermal cycler.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Transferir la muestra a un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA Lobind.

Add 90 µl of resuspended AMPure XP beads to the amplification reaction and mix by pipetting.

Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Prepare 500 μl of fresh 70% ethanol in nuclease-free water.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 70% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 100 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Remove and retain 100 µl of eluate in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

CHECKPOINT

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

In a clean 0.2 ml PCR tube, mix the reagents in the following order:

Incubate the reaction for 15 minutes at 37° C.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Prepare the Custom buffer in a clean 2 ml Eppendorf DNA LoBind tube:

Transfer thoroughly mixed Agencourt AMPure XP beads into two 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes, so that each contains 1 ml.

Pellet the beads on a magnet. Keeping the tube on the magnet, pipette off the supernatant.

Wash the beads with 1 ml of nuclease-free water by resuspending the pellet. Return the tube to the magnetic rack, allow beads to pellet, remove the water using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.