Ligation sequencing gDNA - PCR barcoding (SQK-LSK109 with EXP-PBC001)

Oxford Nanopore Technologies
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MinION: Protocol

Ligation sequencing gDNA - PCR barcoding (SQK-LSK109 with EXP-PBC001) V PBGE12_9066_v109_revV_25May22

For barcoding genomic DNA for nanopore sequencing

  • Offering highest yield
  • ~85 mins library prep
  • Using up to 12 barcodes
  • Includes PCR steps
  • Compatible with R10.3 flow cells

For Research Use Only

This is a Legacy product This kit is soon to be discontinued and we recommend all customers to upgrade to the latest chemistry for their relevant kit which is available on the Store. If customers require further support for any ongoing critical experiments using a Legacy product, please contact Customer Support via email: support@nanoporetech.com.

FOR RESEARCH USE ONLY

Descripción general

For barcoding genomic DNA for nanopore sequencing

  • Offering highest yield
  • ~85 mins library prep
  • Using up to 12 barcodes
  • Includes PCR steps
  • Compatible with R10.3 flow cells

For Research Use Only

This is a Legacy product This kit is soon to be discontinued and we recommend all customers to upgrade to the latest chemistry for their relevant kit which is available on the Store. If customers require further support for any ongoing critical experiments using a Legacy product, please contact Customer Support via email: support@nanoporetech.com.

Document version: PBGE12_9066_v109_revV_25May22

1. Overview of the protocol

IMPORTANTE

This is a Legacy product

This kit is soon to be discontinued and we recommend all customers to upgrade to the latest chemistry for their relevant kit which is available on the Store. If customers require further support for any ongoing critical experiments using a Legacy product, please contact Customer Support via email: support@nanoporetech.com. For further information on please see the product update page.

PCR Barcoding Expansion 1-12 features

This kit is recommended for users who:

  • want to optimise their sequencing experiment for throughput
  • require control over read length
  • would like to utilise upstream processes such as size selection or whole genome amplification
  • want to multiplex up to 12 different samples
IMPORTANTE

Optional fragmentation and size selection

By default, the protocol contains no DNA fragmentation step, however in some cases it may be advantageous to fragment your sample. For example, when working with lower amounts of input gDNA (100 ng – 500 ng), fragmentation will increase the number of DNA molecules and therefore increase throughput. Instructions are available in the DNA Fragmentation section of Extraction methods.

Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments - instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.

Introduction to the PCR barcoding protocol

This protocol describes how to carry out PCR barcoding of DNA using the Ligation Sequencing Kit 1D (SQK-LSK109) and the PCR Barcoding Expansion 1-12 (EXP-PBC001). It is highly recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment

You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success.
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Library preparation

You will need to:

  • Prepare the DNA ends for adapter attachment
  • Attach barcoding adapters supplied in the kit to the DNA ends
  • Amplify each barcoded sample by PCR, then pool the samples together
  • Repair the DNA, and prepare the DNA ends for adapter attachment
  • Attach sequencing adapters supplied in the kit to the DNA ends
  • Prime the flow cell, and load your DNA library into the flow cell

PCR Barcoding ligation protocol svg from DT

Sequencing and analysis

You will need to:

  • Start a sequencing run using the MinKNOW software, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads
  • Start the EPI2ME software and select the barcoding workflow
IMPORTANTE

We do not recommend mixing barcoded libraries with non-barcoded libraries prior to sequencing.

IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

  • Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109)
  • FLO-MIN106D (R9.4.1) flow cells
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
  • PCR Barcoding Expansion 1-12 (EXP-PBC001)

2. Equipment and consumables

Material
  • <1 µg of each DNA sample to be barcoded in 45 µl
  • PCR Barcoding Expansion 1-12 (EXP-PBC001)
  • Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109)
  • Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002)
Consumibles
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB E7180S or E7180L) (módulo de acompañamiento NEBNext de secuenciación por ligación para Oxford Nanopore Technologies®) Como alternativa, se pueden utilizar los siguientes productos de NEBNext®:
  • NEBNext FFPE Repair Mix (NEB M6630) (mezcla de reparación de ADN)
  • NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (NEB E7546) (Módulo de reparación de extremos/Adición de dA)
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056) (Módulo de ligación rápida)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water
  • LongAmp Taq 2X Master Mix (e.g. NEB, cat # M0287)
Instrumental
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Termociclador
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Cubeta con hielo
  • Temporizador
Equipo opcional
  • Bioanalizador Agilent (o equivalente)
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
  • Centrifuga Eppendorf 5424 (o equivalente)

For this protocol, you will need <1 µg of each DNA sample to be barcoded in 45 µl.

Cantidad de muestra inicial de ADN

Cómo realizar un control de calidad del ADN de la muestra inicial

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

NEBNext® Companion Module para secuenciación por ligación, de Oxford Nanopore Technologies®

A los clientes que no conozcan la secuenciación por nanoporos, se les recomienda que adquieran el módulo de acompañamiento NEBNext® Ligation Sequencing para Oxford Nanopore Technologies® (NEB E7180S o E7180L), que contiene todos los reactivos NEB necesarios para usar con el kit Ligation Sequencing Kit.

Nótese que en los protocolos con amplicones no es necesario usar ni la mezcla de reparación de ADN NEBNext FFPE DNA Repair Mix, ni el tampón de reparación de ADN NEBNext FFPE DNA Repair Buffer.

PCR Barcoding Expansion 1-12 (EXP-PBC001) contents

2017 07 18 PCB v1 DS

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (μl)
PCR Barcode 1-12 BC1-12 Clear 12 20
Barcode Adapter BCA Blue stripe 1 260

Ligation Sequencing Kit contents (SQK-LSK109)

SQK-LSK109 v1

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (µl)
DNA CS DCS Yellow 1 50
Adapter Mix AMX Green 1 40
Ligation Buffer LNB Clear 1 200
L Fragment Buffer LFB White cap, orange stripe on label 2 1,800
S Fragment Buffer SFB Grey 2 1,800
Sequencing Buffer SQB Red 2 300
Elution Buffer EB Black 1 200
Loading Beads LB Pink 1 360

Flow Cell Priming Kit contents (EXP-FLP002)

FLP

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (μl)
Flush Buffer FB Blue 6 1,170
Flush Tether FLT Purple 1 200

3. Computer requirements and software

Requisitos informáticos para el MinION Mk1B

Para secuenciar con el MinION Mk1B es necesario tener un ordenador o portátil de alto rendimiento, que pueda soportar la velocidad de adquisición de datos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1B IT Requirements.

Requisitos informáticos para el MinION Mk1C

El MinION Mk1C contiene ordenador y pantalla integrados, lo que elimina la dependencia de cualquier accesorio para generar y analizar datos de nanoporos. Encontrará más información en el documento MinION Mk1C IT Requirements.

MinION Mk1D IT requirements

Sequencing on a MinION Mk1D requires a high-spec computer or laptop to keep up with the rate of data acquisition. For more information, refer to the MinION Mk1D IT requirements document.

Software for nanopore sequencing

MinKNOW

The MinKNOW software controls the nanopore sequencing device, collects sequencing data and basecalls in real time. You will be using MinKNOW for every sequencing experiment to sequence, basecall and demultiplex if your samples were barcoded.

For instructions on how to run the MinKNOW software, please refer to the MinKNOW protocol.

EPI2ME (optional)

The EPI2ME cloud-based platform performs further analysis of basecalled data, for example alignment to the Lambda genome, barcoding, or taxonomic classification. You will use the EPI2ME platform only if you would like further analysis of your data post-basecalling.

For instructions on how to create an EPI2ME account and install the EPI2ME Desktop Agent, please refer to this link.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000

4. End-prep

Material
  • <1 µg of each DNA sample to be barcoded in 45 µl
Consumibles
  • NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (NEB E7546) (Módulo de reparación de extremos/Adición de dA)
  • Etanol al 70 % recién preparado en agua sin nucleasas
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
Instrumental
  • Termociclador
  • Cubeta con hielo
  • Microfuge
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
Equipo opcional
  • Qubit fluorometer (or equivalent for QC check)
IMPORTANTE

Optional fragmentation and size selection

By default, the protocol contains no DNA fragmentation step, however in some cases it may be advantageous to fragment your sample. For example, when working with lower amounts of input gDNA (100 ng – 500 ng), fragmentation will increase the number of DNA molecules and therefore increase throughput. Instructions are available in the DNA Fragmentation section of Extraction methods.

Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments - instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.

Prepare the DNA in nuclease-free water.

  1. Transfer <1 μg DNA of each sample into a fresh 0.2 ml PCR tube or plate
  2. Adjust the volume to 45 μl with nuclease-free water
  3. Mix thoroughly by flicking the tube to avoid unwanted shearing
  4. Spin down briefly in a microfuge

Using a separate 0.2 ml thin-walled PCR tube for each DNA sample to be barcoded, set up the end-repair / dA-tailing reactions as follows:

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent Volume
<1 µg DNA 45 µl
Ultra II End-prep reaction buffer 7 µl
Ultra II End-prep enzyme mix 3 µl
Nuclease-free water 5 µl
Total 60 µl

Mezclar con la pipeta.

Incubar en el termociclador, primero a 20 ºC durante 5 minutos y después a 65 ºC durante 5 minutos más.

Transfer each sample to a separate 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 60 µl of resuspended AMPure XP beads to the end-prep reaction and mix by pipetting.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Prepare sufficient fresh 70% ethanol in nuclease-free water.

Place on a magnetic rack, allow beads to pellet and pipette off supernatant.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 180 µl of freshly-prepared 70% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Spin down and place the tubes back on the magnet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the tubes from the magnetic rack and resuspend the pellet in 31 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Remove eluate once it is clear and colourless. Transfer each eluted sample to a new 0.2 ml thin-walled PCR tube.

Quantify 1 µl of end-prepped DNA using a Qubit fluorometer - recovery aim >700 ng.

FIN DEL PROCESO

Take forward approximately 700 ng of end-prepped DNA in 30 µl nuclease-free water into adapter ligation. However, at this point, it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

5. Ligation of Barcode Adapter

Material
  • Barcode Adapter (BCA)
Consumibles
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, cat # M0367)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 70 % recién preparado en agua sin nucleasas
  • 10 mM Tris-HCl pH 8.5
Instrumental
  • Microcentrífuga
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Mezclador vórtex
  • Separador magnético, adecuado para tubos Eppendorf de 1,5 ml
  • Cubeta con hielo
Equipo opcional
  • Bioanalizador Agilent (o equivalente)

Add the reagents in the order given below, mixing by pipetting between each sequential addition:

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent Volume
End prep DNA 30 µl
Barcode Adapter 20 µl
Blunt/TA Ligase Master Mix 50 µl
Total 100 µl

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 40 µl of resuspended AMPure XP beads to the reaction and mix by flicking the tube.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 5 minutes at room temperature.

Prepare 500 μl of fresh 70% ethanol in nuclease-free water.

Spin down the sample and pellet on a magnet. Keep the tube on the magnet, and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 70% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Spin down and place the tube back on the magnet. Pipette off any residual 70% ethanol. Briefly allow to dry.

Remove the tube from the magnetic rack and resuspend pellet in 25 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Remove and retain 15 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

  • Remove and retain the eluate which contains the DNA library in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube
  • Dispose of the pelleted beads

Quantify 1 µl of end-prepped DNA using a Qubit fluorometer.

Dilute the library to a concentration of 10 ng/µl with nuclease-free water or 10 mM Tris-HCl pH 8.5.

FIN DEL PROCESO

Take forward the sample to the next step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

6. Barcoding PCR

Material
  • PCR Barcode Primers (BC01-12, at 10 µM)
Consumibles
  • LongAmp Taq 2X Master Mix (e.g. NEB, cat # M0287)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water
Instrumental
  • Termociclador
  • Gradilla magnética
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)

Set up a barcoding PCR reaction as follows for each library:

The following is written for LongAmp Taq, but can be adapted for use with other polymerases.

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent Volume
PCR Barcode (one of BC01-BC12, at 10 µM) 2 µl
10 ng/µl adapter ligated template 2 µl
LongAmp Taq 2x master mix 50 µl
Nuclease-free water 46 µl
Total volume 100 µl

If the amount of input material is altered, the number of PCR cycles may need to be adjusted to produce the same yield.

Mix gently by flicking the tube, and spin down.

Amplify using the following cycling conditions:

Cycle step Temperature Time No. of cycles
Initial denaturation 95 °C 3 mins 1
Denaturation 95 °C 15 secs 12-15 (b)
Annealing 62 °C (a) 15 secs (a) 12-15 (b)
Extension 65 °C (c) dependent on length of target fragment (d) 12-15 (b)
Final extension 65 °C dependent on length of target fragment (d) 1
Hold 4 °C ∞

a. This is specific to the Oxford Nanopore primer and should be maintained

b. Adjust accordingly if input quantities are altered

c. This temperature is determined by the type of polymerase that is being used (given here for LongAmp Taq polymerase)

d. Adjust accordingly for different lengths of amplicons and the type of polymerase that is being used. Oxford Nanopore R&D teams standardly use 8 min for DNA fragmented to 8 kb.

Transfer each sample to a separate 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 60 µl of resuspended AMPure XP beads to each reaction and mix by flicking the tube.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Prepare sufficient fresh 70% ethanol in nuclease-free water.

Spin down the samples and pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless. Keep the tubes on the magnet and pipette off the supernatant.

Keep the tube on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 70% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repeat the previous step.

Spin down and place the tubes back on the magnet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the tubes from the magnetic rack and resuspend each pellet in 10 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 10 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.

  • Dispose of the pelleted beads

Quantify the barcoded library using standard techniques, and pool all barcoded libraries in the desired ratios in a 1.5 ml DNA LoBind Eppendorf tube.

Prepare 1 µg of pooled barcoded libraries in 47 µl nuclease-free water.

FIN DEL PROCESO

This pooled library is now ready to be end-repaired and adapted for sequencing. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

7. End-prep

Material
  • Pooled barcoded DNA
  • DNA Control Sample (DCS) (muestra de control)
  • AMPure XP Beads (AXP)
Consumibles
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module (NEB E7546)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen Q32851)
Instrumental
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P10
  • Thermal cycler
  • Microcentrífuga
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Gradilla magnética
  • Cubeta con hielo
Equipo opcional
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Descongelar el reactivo DNA Control Sample (DCS) a temperatura ambiente, centrifugar, mezclar con la pipeta y poner en hielo.

CONSEJO

Se recomienda usar DNA Control Sample (DCS) en la preparación de la biblioteca para localizar y solucionar problemas. De todos modos, se puede omitir este paso y compensar el 1 µl extra con la muestra de ADN.

Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Ensure the reagents are well mixed.
    Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.

In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:

Reagent Volume
DNA Control Sample (DCS) 1 µl
DNA 49 µl
Ultra II End-prep Reaction Buffer 7 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
Total 60 µl

Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting.

Incubar en el termociclador, primero a 20 ºC durante 5 minutos y después a 65 ºC durante 5 minutos más.

IMPORTANTE

AMPure XP bead clean-up

It is recommended that the repaired/end-prepped DNA sample is subjected to the following clean-up with AMPure XP beads. This clean-up can be omitted for simplicity and to reduce library preparation time. However, it has been observed that omission of this clean-up can: reduce subsequent adapter ligation efficiency, increase the prevalence of chimeric reads, and lead to an increase in pores being unavailable for sequencing. If omitting the clean-up step, proceed to the next section.

Resuspend the AMPure XP Beads (AXP) by vortexing.

Transferir la muestra de ADN a un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

Añadir 60 µl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción de preparación de extremos y mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Preparar 500 µl de etanol al 80 %, con agua sin nucleasas.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Dejar el tubo en el imán y lavar el agregado de microesferas, con cuidado de no desplazarlo, con 200 µl de etanol al 80 %. Retirar el etanol con una pipeta y desechar.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 61 µl de agua sin nucleasas. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 61 µl de eluido y guardar en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

MEDIDA OPCIONAL

Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer.

FIN DEL PROCESO

Una vez el ADN está reparado y con los extremos preparados, se puede proceder a la ligación del adaptador. En este punto, también se puede guardar la muestra a 4 ⁰C hasta el día siguiente.

8. Adapter ligation and clean-up

Material
  • Adapter Mix (AMX)
  • Ligation Buffer (LNB) (tampón de ligación) del kit Ligation Sequencing Kit
  • Long Fragment Buffer (LFB) (tampón para fragmentos largos)
  • Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
  • Elution Buffer (EB) (tampón de elución) del kit de Oxford Nanopore
Consumibles
  • NEBNext Quick Ligation Module (NEB E6056) (Módulo de ligación rápida)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter™, A63881)
Instrumental
  • Gradilla magnética
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE

Although the recommended third-party ligase is supplied with its own buffer, the ligation efficiency of Adapter Mix (AMX) is higher when using Ligation Buffer supplied within the Ligation Sequencing Kit.

Spin down the Adapter Mix (AMX) and Quick T4 Ligase, and place on ice.

Descongelar el vial Ligation Buffer (LNB) a temperatura ambiente, centrifugar y mezclar con la pipeta. Debido a su viscosidad, la agitación en vórtex de este tampón es ineficaz. Tras descongelar y mezclar, colocar en hielo inmediatamente.

Descongelar el vial Elution Buffer (EB) a temperatura ambiente, agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

IMPORTANTE

La fase de lavados tras la ligación de los adaptadores está diseñada para enriquecer los fragmentos de ADN de >3 kb o para purificar todos los fragmentos por igual, según el tampón que se utilice -Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).

  • Para enriquecer fragmentos de ADN de 3 kb o mayores, utilizar el tampón para fragmentos largos, Long Fragment Buffer (LFB).

  • Para conservar fragmentos de ADN de todos los tamaños, utilizar el tampón para fragmentos cortos, Short Fragment Buffer (SFB).

To enrich for DNA fragments of 3 kb or longer, thaw one tube of Long Fragment Buffer (LFB) at room temperature, mix by vortexing, spin down and place on ice.

To retain DNA fragments of all sizes, thaw one tube of Short Fragment Buffer (SFB) at room temperature, mix by vortexing, spin down and place on ice.

In a 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, mix in the following order:

Between each addition, pipette mix 10 - 20 times.

Reagent Volume
DNA sample from the previous step 60 µl
Ligation Buffer (LNB) 25 µl
NEBNext Quick T4 DNA Ligase 10 µl
Adapter Mix (AMX) 5 µl
Total 100 µl

Ensure the components are thoroughly mixed by pipetting, and spin down.

Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.

IMPORTANTE

If you have omitted the AMPure purification step after DNA repair and end-prep, do not incubate the reaction for longer than 10 minutes.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 40 µl of resuspended AMPure XP beads to the reaction and mix by flicking the tube.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Lavar las microesferas magnéticas con 250 μl o de Long Fragment Buffer (LFB) o de Short Fragment Buffer (SFB). Golpear el tubo suavemente con el dedo para resuspender las microesferas, centrifugar, colocar en la gradilla magnética y dejar que las microesferas precipiten. Retirar el sobrenadante con una pipeta y desechar.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 15 µl de Elution Buffer (EB). Centrifugar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tratándose de ADN de alto peso molecular, incubar a 37 ⁰C puede mejorar la recuperación de fragmentos largos.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 15 μl del eluido que contiene la biblioteca de ADN y conservar en un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.

Deshechar las microesferas precipitadas.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

IMPORTANTE

We recommend loading 5-50 fmol of the final prepared library onto a flow cell.

Loading more than the maximal recommended amount of DNA can have a detrimental effect on output as higher quantities of DNA results in a larger number of ligated DNA ends with loaded motor protein. This depletes fuel in the Sequencing Buffer, regardless of whether or not the DNA fragments are being sequenced. This leads to fuel depletion and speed drop-off early in the sequencing run. Dilute the libraries in Elution Buffer if required.

If you are using the Flongle for sample prep development, we recommend loading 3-20 fmol instead.

FIN DEL PROCESO

La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo o a 4 °C hasta el momento de cargar.

CONSEJO

Library storage recommendations

We recommend storing libraries in Eppendorf DNA LoBind tubes at 4°C for short term storage or repeated use, for example, reloading flow cells between washes. For single use and long-term storage of more than 3 months, we recommend storing libraries at -80°C in Eppendorf DNA LoBind tubes. For further information, please refer to the DNA library stability Know-How document.

MEDIDA OPCIONAL

If quantities allow, the library may be diluted in Elution Buffer (EB) for splitting across multiple flow cells.

Additional buffer for doing this can be found in the Sequencing Auxiliary Vials expansion (EXP-AUX001), available to purchase separately. This expansion also contains additional vials of Sequencing Buffer (SQB) and Loading Beads (LB), required for loading the libraries onto flow cells.

9. Priming and loading the SpotON flow cell

Material
  • Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002)
  • Loading Beads (LB)
  • Sequencing Buffer (SQB)
Consumibles
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
Instrumental
  • MinION Mk1B or Mk1C
  • SpotON Flow Cell
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
CONSEJO

Cebado y carga de la celda de flujo

Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Thaw the Sequencing Buffer (SQB), Loading Beads (LB), Flush Tether (FLT) and one tube of Flush Buffer (FB) at room temperature before mixing the reagents by vortexing, and spin down at room temperature.

To prepare the flow cell priming mix, add 30 µl of thawed and mixed Flush Tether (FLT) directly to the tube of thawed and mixed Flush Buffer (FB), and mix by vortexing at room temperature.

Open the MinION device lid and slide the flow cell under the clip.

Press down firmly on the flow cell to ensure correct thermal and electrical contact.

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

Abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizando la tapa en el sentido de las agujas del reloj.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:

  1. Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
  2. Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
  3. Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Cargar 800 μl de solución en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5 SPANISH

Thoroughly mix the contents of the Loading Beads (LB) by pipetting.

IMPORTANTE

The Loading Beads (LB) tube contains a suspension of beads. These beads settle very quickly. It is vital that they are mixed immediately before use.

In a new tube, prepare the library for loading as follows:

Reagent Volume per flow cell
Sequencing Buffer (SQB) 37.5 µl
Loading Beads (LB), mixed immediately before use 25.5 µl
DNA library 12 µl
Total 75 µl

Note: Load the library onto the flow cell immediately after adding the Sequencing Buffer (SQB) and Loading Beads (LB) because the fuel in the buffer will start to be consumed by the adapter.

Completar el cebado de la celda de flujo:

  1. Levantar suavemente la tapa del puerto de carga SpotON.
  2. Cargar 200 µl de solución en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

Flow Cell Loading Diagrams Step 5

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5 SPANISH 2

Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.

Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.

Flow Cell Loading Diagram Step 07 V5 SPANISH

Gently replace the SpotON sample port cover, making sure the bung enters the SpotON port, close the priming port and replace the MinION device lid.

Flow Cell Loading Diagrams Step 8

Flow Cell Loading Diagrams Step 9

10. Adquisición de datos e identificación de bases

Cómo empezar a secuenciar

Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.

Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:

  • En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o en remoto.
  • Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.

Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:

Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:

1. Ir a la página de inicio y pulsar "Iniciar secuenciación".

2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de muestra.

3. En la pestaña Kit, seleccionar el kit de secuenciación utilizado durante la preparación de la biblioteca.

4. Configurar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o dejar la configuración por defecto en la pestaña Configuración del experimento.

Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, se puede activar en MinKNOW en la fase posejecución. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.

5. En la página de Inicio, pulsar Iniciar la secuenciación.

Análisis de datos

Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.

Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de identificación de bases y de análisis posterior, consulte el documento Data Analysis.

En la sección Análisis posterior, se describen otras opciones para analizar los datos.

11. Reutilización y devolución de celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a entre 2 °C y 8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

12. Análisis posterior

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:

1. Flujos de trabajo de EPI2ME

A fin de realizar un análisis en profundidad de los datos, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales sobre bioinformática y flujos de trabajo, que están disponibles en EPI2ME. La plataforma proporciona un espacio donde los flujos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis para la investigación

Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y flujos de trabajo bioinformáticos, disponibles en EPI2ME Labs, que encontrará en la sección del mismo nombre de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los proyectos que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte el centro de recursos Resource Centre y busque herramientas bioinformáticas para su aplicación. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/programas informáticos.

13. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <70 % Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

14. Issues during the sequencing run

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Pore occupancy below 40%

Observation Possible cause Comments and actions
Pore occupancy <40% Not enough library was loaded on the flow cell Ensure you load the recommended amount of good quality library in the relevant library prep protocol onto your flow cell. Please quantify the library before loading and calculate mols using tools like the Promega Biomath Calculator, choosing "dsDNA: µg to pmol"
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and sequencing adapters did not ligate to the DNA Make sure to use the NEBNext Quick Ligation Module (E6056) and Oxford Nanopore Technologies Ligation Buffer (LNB, provided in the sequencing kit) at the sequencing adapter ligation step, and use the correct amount of each reagent. A Lambda control library can be prepared to test the integrity of the third-party reagents.
Pore occupancy close to 0 The Ligation Sequencing Kit was used, and ethanol was used instead of LFB or SFB at the wash step after sequencing adapter ligation Ethanol can denature the motor protein on the sequencing adapters. Make sure the LFB or SFB buffer was used after ligation of sequencing adapters.
Pore occupancy close to 0 No tether on the flow cell Tethers are adding during flow cell priming (FLT/FCT tube). Make sure FLT/FCT was added to FB/FCF before priming.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones:

1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Reducción de la velocidad de secuenciación y del índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Reducción de la velocidad de secuenciación y el índice de calidad Qscore en una fase avanzada de la secuenciación En la química del kit 9 (p. ej., SQK-LSK109), cuando la celda de flujo está sobrecargada con la biblioteca se observa un consumo rápido de combustible (consulte el protocolo correspondiente a su biblioteca de ADN para ver las recomendaciones) Añadir más combustible a la celda de flujo, siguiendo las instrucciones en el protocolo de MinKNOW. En futuros experimentos, cargar cantidades menores de biblioteca en la celda de flujo.

Fluctuación de la temperatura

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo, procure que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace.

Guppy – no input .fast5 was found or basecalled

Observation Possible cause Comments and actions
No input .fast5 was found or basecalled input_path did not point to the .fast5 file location The --input_path has to be followed by the full file path to the .fast5 files to be basecalled, and the location has to be accessible either locally or remotely through SSH.
No input .fast5 was found or basecalled The .fast5 files were in a subfolder at the input_path location To allow Guppy to look into subfolders, add the --recursive flag to the command

Guppy – no Pass or Fail folders were generated after basecalling

Observation Possible cause Comments and actions
No Pass or Fail folders were generated after basecalling The --qscore_filtering flag was not included in the command The --qscore_filtering flag enables filtering of reads into Pass and Fail folders inside the output folder, based on their strand q-score. When performing live basecalling in MinKNOW, a q-score of 7 (corresponding to a basecall accuracy of ~80%) is used to separate reads into Pass and Fail folders.

Guppy – unusually slow processing on a GPU computer

Observation Possible cause Comments and actions
Unusually slow processing on a GPU computer The --device flag wasn't included in the command The --device flag specifies a GPU device to use for accelerate basecalling. If not included in the command, GPU will not be used. GPUs are counted from zero. An example is --device cuda:0 cuda:1, when 2 GPUs are specified to use by the Guppy command.

Last updated: 3/10/2023

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