Ligation sequencing V14 - PCR barcoding (SQK-LSK114 with EXP-PBC001 or EXP-PBC096)

Oxford Nanopore Technologies
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Protocol

Ligation sequencing V14 - PCR barcoding (SQK-LSK114 with EXP-PBC001 or EXP-PBC096) VPBC_9182_v114_revK_07Mar2023

  • Requires the PCR Barcoding Expansion (EXP-PBC001 or EXP-PBC096) with the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
  • This protocol barcodes gDNA or amplicons
  • Library preparation time ~150 minutes + PCR
  • High yield
  • Uses up to 96 barcodes
  • Includes PCR steps
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

FOR RESEARCH USE ONLY

Overview

  • Requires the PCR Barcoding Expansion (EXP-PBC001 or EXP-PBC096) with the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)
  • This protocol barcodes gDNA or amplicons
  • Library preparation time ~150 minutes + PCR
  • High yield
  • Uses up to 96 barcodes
  • Includes PCR steps
  • Compatible with R10.4.1 flow cells

For Research Use Only

Document version: PBC_9182_v114_revK_07Mar2023

1. Overview of the protocol

PCR Barcoding Expansion features:

We have two PCR barcoding expansions available depending on the number of barcodes required:

  • PCR Barcoding Expansion 1-12 (EXP-PBC001): up to 12 unique barcodes are available
  • PCR Barcoding Expansion 1-96 (EXP-PBC096): up to 96 unique barcodes are available

These expansions are used with the Ligation Sequencing Kit V14 and recommended for users who:
  • Want to multiplex up to 12 or 96 barcodes, depending on the expansion they are using.
  • Would like to achieve raw read sequencing modal accuracy of Q20+ (99%) or above.
  • Want to optimise their sequencing experiment for output.
  • Require control over read length.
  • Would like to utilise upstream processes such as size selection or whole genome amplification.

Introduction to the PCR Barcoding protocol

This protocol describes how to carry out PCR barcoding of gDNA using the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) with the PCR Barcoding Expansion Pack 1-12 (EXP-PBC001) or 1-96 (EXP-PBC096). This protocol also outlines recommendations to PCR barcode amplicons. Using the PCR Barcoding expansions allows for up to either 12 or 96 samples to be combined and loaded onto a single flow cell. It is highly recommended that a Lambda control experiment is completed first to become familiar with the technology.

Note: For amplicon inputs, first-round PCR product with the following tailed primers are required. 5’ TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC-[ project-specific forward primer sequence ] 3’ 5’ ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC-[ project-specific reverse primer sequence ] 3’

Steps in the sequencing workflow:

Prepare for your experiment You will need to:

  • Extract your DNA, and check its length, quantity and purity. The quality checks performed during the protocol are essential in ensuring experimental success
  • Ensure you have your sequencing kit, the correct equipment and third-party reagents
  • Download the software for acquiring and analysing your data
  • Check your flow cell to ensure it has enough pores for a good sequencing run

Experiment workflow

The table below is an overview of the steps required in the sample and library preparation, including timings and optional stopping points.

Library preparation Process Time Stop option
For gDNA: DNA end-prep

or

For amplicons: Incorporate tailed primers		 Prepare the DNA ends for PCR adapter attachment

or

Perform a round of PCR to incoporate tailed primers		 35 minutes 4°C overnight
For gDNA: attach barcoding adapters

or

For amplicons: second round of PCR to incorporate barcode sequences		 Attach barcoding adapters to the DNA ends.

or

Complete a second round of PCR to incorporate the Oxford Nanopore barcode sequences.		 40 minutes 4°C overnight
Amplify and pool samples Amplify each barcoded sample by PCR, then pool the samples together. 15 minutes + Adjustable PCR time 4°C overnight
End-prep Repair the DNA and prepare the DNA ends for adapter attachment 35 minutes 4°C overnight
Adapter ligation and clean-up Attach the sequencing adapters to the DNA ends 20 minutes 4°C short-term storage or for repeated use, such as re-loading your flow cell
-80°C for single-use, long-term storage.
We strongly recommend sequencing your library as soon as it is adapted.
Priming and loading the flow cell Prime the flow cell and load the prepared library for sequencing 5 minutes

PCR barcoding PBC

Sequencing and analysis

You will need to:

  • In the current MinKNOW software version, the PCR Barcoding Expansions are not available in "Kit selection" when setting up a sequencing run. These will be included in the next software update. For the meantime, we recommend the following:
    • Start a sequencing run in the MinKNOW software using SQK-LSK114, which will collect raw data from the device and convert it into basecalled reads.
    • Demultiplex your data post-run on MinKNOW using the barcoding option, choosing either EXP-PBC001 or EXP-PBC096 as your barcoding kit. Further information is available in the "Post-run barcoding" of the MinKNOW protocol.
  • Start the EPI2ME software and select the barcoding workflow for further analysis (this step is optional).
IMPORTANTE

We do not recommend mixing barcoded libraries with non-barcoded libraries prior to sequencing.

IMPORTANTE

Compatibility of this protocol

This protocol should only be used in combination with:

2. Equipment and consumables

Material
  • 100 ng of each sheared DNA sample to be barcoded in 45 µl
  • OR 100 ng first-round PCR product (with tailed primers) per sample
  • PCR Barcoding Expansion 1-12 (EXP-PBC001)
  • PCR Barcoding Expansion 1-96 (EXP-PBC096)
  • Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) (kit de secuenciación por ligación V14)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (NEB E7546) (Módulo de reparación de extremos/Adición de dA)
  • Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, M0367)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora para celdas de flujo MinION
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Termociclador
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P200
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Pipeta y puntas P2
  • Cubeta con hielo
  • Magnetic rack
  • Temporizador
  • Multichannel pipette and tips
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
Equipo opcional
  • Bioanalizador Agilent (o equivalente)
  • Centrifuga Eppendorf 5424 (o equivalente)

100 ng of gDNA is required per sample.

If using amplicons, 100 ng of first-round PCR product (with tailed primers) is required per sample.

IMPORTANTE

Fragmentation and size selection

For successful amplification, it is critical that the DNA fragment distribution of templates used in the PCR are <8 Kbp. If the input DNA is not < Kbp, use follow steps outline in Shearing genomic DNA using the Covaris g-TUBE™ to shear the sample to each a fragment distribution <8 Kbp.

Additionally, we offer several options for size-selecting your DNA sample to enrich for long fragments. Instructions are available in the Size Selection section of Extraction methods.

Cantidad de muestra inicial de ADN

Cómo realizar un control de calidad de la muestra inicial de ADN

Es importante que la muestra de ADN cumpla con los requisitos de cantidad y calidad. Usar demasiado ADN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado, que contenga ARN o contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.

Para realizar un control de calidad en la muestra de ADN, consulte el protocolo Input DNA/ RNA QC

Contaminantes químicos

Dependiendo de cómo se extraiga el ADN de la muestra cruda, ciertos contaminantes químicos pueden permanecer en el ADN purificado, lo cual afecta la eficacia de la preparación de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. Encontrará más información sobre contaminantes en la página Contaminants de la comunidad Nanopore.

Reactivos de otros fabricantes

Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.

Se recomienda preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en los primeros tres meses desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION, y en las primeras cuatro semanas tras la compra de celdas de flujo Flongle. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.

Celda de flujo Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía
Flongle 50
MinION/GridION 800
PromethION 5000
IMPORTANTE

AMPure XP Beads

Within the Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114), AMPure XP Beads (AXP) are supplied at the volume needed to complete the "End-prep" and "Adapter ligation and clean up" steps of the protocol. However, for initially preparing the sample ends and the PCR steps, extra AMPure XP Beads are required for purification and clean-up. Please note, other purification methods are available.

Contenido del kit Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114)

Nota: Hemos cambiando el formato de nuestros kits; hemos sustituido algunos de los viales de un solo uso por botellas de mayor contenido.

Formato de tubos monouso SQK-LSK114 v2

Formato en botella SQK-LSK114 v2

Nota: este producto contiene un reactivo, AMPure XP, fabricado por Beckman Coulter Inc., que puede conservarse con el kit a -20 °C sin perjudicar su estabilidad.

Nota: la muestra de control de ADN (DCS) es un amplicón estándar de 3,6 kb, que mapea el extremo 3' del genoma Lambda.

PCR Barcoding Expansion 1-12 (EXP-PBC001) contents

2017 07 18 PCB v1 DS

Name Acronym Cap colour No. of vials Fill volume per vial (μl)
PCR Barcode 1-12 BC1-12 Clear 12 20
Barcode Adapter BCA Blue stripe 1 260

PCR Barcoding Expansion Pack 1-96 (EXP-PBC096)

2655 10999
Name Acronym Cap colour No. of vials/plates Fill volume per well (µl)
PCR Barcode Primer Mix plate BC01-96 White 1 plate 24
Barcode Adapter plate BCA Blue 1 plate 240

Layout of barcodes in the 96 tube plate

The wells of the 96 tube plate correspond to the barcodes in the following way. All barcodes are supplied at 10 µM concentration and to be used at a final concentration of 0.2 µM.

Barcode 96 plate

Capping and decapping the 96 well format

96 barcode sequences

Component Sequence
BC01 / RB01 AAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTG
BC02 / RB02 TCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGT
BC03 / RB03 GAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGG
BC04 / RB04 TTCGGATTCTATCGTGTTTCCCTA
BC05 / RB05 CTTGTCCAGGGTTTGTGTAACCTT
BC06 / RB06 TTCTCGCAAAGGCAGAAAGTAGTC
BC07 / RB07 GTGTTACCGTGGGAATGAATCCTT
BC08 / RB08 TTCAGGGAACAAACCAAGTTACGT
BC09 / RB09 AACTAGGCACAGCGAGTCTTGGTT
BC10 / RB10 AAGCGTTGAAACCTTTGTCCTCTC
BC11 / RB11 GTTTCATCTATCGGAGGGAATGGA
BC12 / RB12 CAGGTAGAAAGAAGCAGAATCGGA
BC13 / 16S13 / RB13 AGAACGACTTCCATACTCGTGTGA
BC14 / 16S14 / RB14 AACGAGTCTCTTGGGACCCATAGA
BC15 / 16S15 / RB15 AGGTCTACCTCGCTAACACCACTG
BC16 / 16S16 / RB16 CGTCAACTGACAGTGGTTCGTACT
BC17 / 16S17 / RB17 ACCCTCCAGGAAAGTACCTCTGAT
BC18 / 16S18 / RB18 CCAAACCCAACAACCTAGATAGGC
BC19 / 16S19 / RB19 GTTCCTCGTGCAGTGTCAAGAGAT
BC20 / 16S20 / RB20 TTGCGTCCTGTTACGAGAACTCAT
BC21 / 16S21 / RB21 GAGCCTCTCATTGTCCGTTCTCTA
BC22 / 16S22 / RB22 ACCACTGCCATGTATCAAAGTACG
BC23 / 16S23 / RB23 CTTACTACCCAGTGAACCTCCTCG
BC24 / 16S24 / RB24 GCATAGTTCTGCATGATGGGTTAG
BC25 / RB25 GTAAGTTGGGTATGCAACGCAATG
BC26 / RB26 CATACAGCGACTACGCATTCTCAT
BC27 / RB27 CGACGGTTAGATTCACCTCTTACA
BC28 / RB28 TGAAACCTAAGAAGGCACCGTATC
BC29 / RB29 CTAGACACCTTGGGTTGACAGACC
BC30 / RB30 TCAGTGAGGATCTACTTCGACCCA
BC31 / RB31 TGCGTACAGCAATCAGTTACATTG
BC32 / RB32 CCAGTAGAAGTCCGACAACGTCAT
BC33 / RB33 CAGACTTGGTACGGTTGGGTAACT
BC34 / RB34 GGACGAAGAACTCAAGTCAAAGGC
BC35 / RB35 CTACTTACGAAGCTGAGGGACTGC
BC36 / RB36 ATGTCCCAGTTAGAGGAGGAAACA
BC37 / RB37 GCTTGCGATTGATGCTTAGTATCA
BC38 / RB38 ACCACAGGAGGACGATACAGAGAA
BC39 / RB39 CCACAGTGTCAACTAGAGCCTCTC
BC40 / RB40 TAGTTTGGATGACCAAGGATAGCC
BC41 / RB41 GGAGTTCGTCCAGAGAAGTACACG
BC42 / RB42 CTACGTGTAAGGCATACCTGCCAG
BC43 / RB43 CTTTCGTTGTTGACTCGACGGTAG
BC44 / RB44 AGTAGAAAGGGTTCCTTCCCACTC
BC45 / RB45 GATCCAACAGAGATGCCTTCAGTG
BC46 / RB46 GCTGTGTTCCACTTCATTCTCCTG
BC47 / RB47 GTGCAACTTTCCCACAGGTAGTTC
BC48 / RB48 CATCTGGAACGTGGTACACCTGTA
BC49 / RB49 ACTGGTGCAGCTTTGAACATCTAG
BC50 / RB50 ATGGACTTTGGTAACTTCCTGCGT
BC51 / RB51 GTTGAATGAGCCTACTGGGTCCTC
BC52 / RB52 TGAGAGACAAGATTGTTCGTGGAC
BC53 / RB53 AGATTCAGACCGTCTCATGCAAAG
BC54 / RB54 CAAGAGCTTTGACTAAGGAGCATG
BC55 / RB55 TGGAAGATGAGACCCTGATCTACG
BC56 / RB56 TCACTACTCAACAGGTGGCATGAA
BC57 / RB57 GCTAGGTCAATCTCCTTCGGAAGT
BC58 / RB58 CAGGTTACTCCTCCGTGAGTCTGA
BC59 / RB59 TCAATCAAGAAGGGAAAGCAAGGT
BC60 / RB60 CATGTTCAACCAAGGCTTCTATGG
BC61 / RB61 AGAGGGTACTATGTGCCTCAGCAC
BC62 / RB62 CACCCACACTTACTTCAGGACGTA
BC63 / RB63 TTCTGAAGTTCCTGGGTCTTGAAC
BC64 / RB64 GACAGACACCGTTCATCGACTTTC
BC65 / RB65 TTCTCAGTCTTCCTCCAGACAAGG
BC66 / RB66 CCGATCCTTGTGGCTTCTAACTTC
BC67 / RB67 GTTTGTCATACTCGTGTGCTCACC
BC68 / RB68 GAATCTAAGCAAACACGAAGGTGG
BC69 / RB69 TACAGTCCGAGCCTCATGTGATCT
BC70 / RB70 ACCGAGATCCTACGAATGGAGTGT
BC71 / RB71 CCTGGGAGCATCAGGTAGTAACAG
BC72 / RB72 TAGCTGACTGTCTTCCATACCGAC
BC73 / RB73 AAGAAACAGGATGACAGAACCCTC
BC74 / RB74 TACAAGCATCCCAACACTTCCACT
BC75 / RB75 GACCATTGTGATGAACCCTGTTGT
BC76 / RB76 ATGCTTGTTACATCAACCCTGGAC
BC77 / RB77 CGACCTGTTTCTCAGGGATACAAC
BC78 / RB78 AACAACCGAACCTTTGAATCAGAA
BC79 / RB79 TCTCGGAGATAGTTCTCACTGCTG
BC80 / RB80 CGGATGAACATAGGATAGCGATTC
BC81 / RB81 CCTCATCTTGTGAAGTTGTTTCGG
BC82 / RB82 ACGGTATGTCGAGTTCCAGGACTA
BC83 / RB83 TGGCTTGATCTAGGTAAGGTCGAA
BC84 / RB84 GTAGTGGACCTAGAACCTGTGCCA
BC85 / RB85 AACGGAGGAGTTAGTTGGATGATC
BC86 / RB86 AGGTGATCCCAACAAGCGTAAGTA
BC87 / RB87 TACATGCTCCTGTTGTTAGGGAGG
BC88 / RB88 TCTTCTACTACCGATCCGAAGCAG
BC89 / RB89 ACAGCATCAATGTTTGGCTAGTTG
BC90 / RB90 GATGTAGAGGGTACGGTTTGAGGC
BC91 / RB91 GGCTCCATAGGAACTCACGCTACT
BC92 / RB92 TTGTGAGTGGAAAGATACAGGACC
BC93 / RB93 AGTTTCCATCACTTCAGACTTGGG
BC94 / RB94 GATTGTCCTCAAACTGCCACCTAC
BC95 / RB95 CCTGTCTGGAAGAAGAATGGACTT
BC96 / RB96 CTGAACGGTCATAGAGTCCACCAT

3. End-prep

Material
  • 100 ng of each sheared DNA sample to be barcoded in 45 µl
Consumibles
  • NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
  • NEBNext® Ultra II End Prep Reaction Buffer from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
Instrumental
  • P1000 pipette and tips
  • P100 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P10
  • Termociclador
  • Cubeta con hielo
  • Microfuge
  • Magnetic rack
  • Vortex mixer
Equipo opcional
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
CHECKPOINT

Verificar la celda de flujo

Antes de empezar a preparar la biblioteca, recomendamos se verifique la celda de flujo para comprobar que tiene poros suficientes para realizar un buen experimento.

Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo están disponibles en el protocolo de MinKNOW.

Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Ensure the reagents are well mixed.
    Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.

Prepare the DNA in nuclease-free water.

  1. Transfer 100 ng DNA of each sample into a fresh 0.2 ml PCR tube or plate
  2. Adjust the volume to 45 μl with nuclease-free water
  3. Mix thoroughly by flicking the tube to avoid unwanted shearing
  4. Spin down briefly in a microfuge

Set up the end-repair reaction as follows for each library:

Reagent Volume per sample
100 ng DNA 45 µl
Ultra II End-prep reaction buffer 7 µl
Ultra II End-prep enzyme mix 3 µl
Nuclease-free water 5 µl
Total 60 µl

Mix by pipetting and briefly spin down.

Using a thermal cycler, incubate for 5 minutes at 20 °C and 5 minutes at 65 °C.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 60 µl of resuspended AMPure XP beads to the end-prep reaction and mix by pipetting.

Incubate at room temperature for 5 minutes.

Prepare sufficient fresh 80% ethanol in nuclease-free water for all of your samples. Allow enough for 400 µl per sample, with some excess.

Spin down the samples and pellet on a magnet until supernatant is clear and colourless. Keep the samples on the magnet, and pipette off the supernatant.

Keep the samples on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Spin down and place the samples back on the magnetic rack. Pipette off any residual ethanol. Allow the pellet to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the samples from the magnet and resuspend each pellet in 16 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove eluate once it is clear and colourless. Transfer each eluted sample to a new tube or plate well.

Quantify 1 µl of end-prepped DNA using a Qubit fluorometer.

FIN DEL PROCESO

Take forward the end-prepped DNA into the next step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

4. Ligation of Barcode Adapter

Material
  • Barcode Adapter (BCA)
Consumibles
  • NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, cat # M0367)
  • Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881)
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
Instrumental
  • Microfuge
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Mezclador vórtex
  • Cubeta con hielo
  • Multichannel pipette and tips
  • Magnetic rack
  • P1000 pipette and tips
  • P100 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P10
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Prepare the NEB Blunt/TA Ligase Master Mix according to the manufacturer's instructions, and place on ice:

  1. Thaw the reagents at room temperature.

  2. Spin down the reagent tubes for 5 seconds.

  3. Ensure the reagents are fully mixed by performing 10 full volume pipette mixes.

Spin down the Barcode Adapter (BCA), pipette mix and place on ice.

Add the reagents in the order given below, into fresh 0.2 ml PCR tubes or 96-well plate:

Reagent Volume
End-prepped DNA 15 µl
Barcode Adapter 10 µl
Blunt/TA Ligase Master Mix 25 µl
Total 50 µl

Mix by pipetting and briefly spin down.

Incubate the samples for 10 minutes at room temperature.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 20 µl of resuspended AMPure XP beads to each sample for a 0.4X clean and mix by pipetting up and down ten times.

Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 5 minutes at room temperature.

Prepare sufficient fresh 80% ethanol in nuclease-free water for all of your samples. Allow enough for 400 µl per sample, with some excess.

Place on a magnetic rack, allow beads to pellet and pipette off supernatant.

Keep the samples on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repetir el paso anterior.

Place the samples back on the magnet. Pipette off any residual 80% ethanol. Allow to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.

Remove the samples from the magnet and resuspend pellet in 25 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnet until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain the eluate once it is clear and colourless. Transfer each eluted sample to a fresh 0.2 ml PCR tube or plate.

  • Dispose of the pelleted beads.

Quantify 1 µl of the adapter ligated DNA using a Qubit fluorometer.

FIN DEL PROCESO

Take forward the adapter ligated samples into the Barcoding PCR step. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

5. Barcoding PCR

Material
  • 100-200 fmol of each adapter-ligated sample
  • OR 100-200 fmol of each amplicon sample
  • PCR Barcodes (BC01-96, at 10 µM)
Consumibles
  • LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, M0533)
  • Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, AM9937)
  • Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter™, A63881)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
Instrumental
  • Thermal cycler
  • Magnetic rack
  • Microfuge
  • P1000 pipette and tips
  • P100 pipette and tips
  • Pipeta y puntas P10
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Please note, this protocol is written for a template input of 100–200 fmol with PCR Barcodes (BC01-96) used at a final concentration of 0.2 µM. However, the input mass and the number of PCR cycles may be adjusted as appropriate depending on the requirements of the experiment.

Thaw the PCR Barcodes (BC01-96) required for your number of samples at room temperature. Individually mix the barcodes by pipetting, spin down, and place on ice.

IMPORTANTE

If using amplicon samples, ensure the samples have undergone a round of PCR with tailed primers before commencing with the protocol.

Prepare the samples in nuclease-free water:

  1. Transfer 100-200 fmol of each sample to a clear 0.2 ml PCR tube or plate
  • For 1–12 samples: Adjust the volume to 48 μl with nuclease-free water
  • For 13–96 samples: Adjust the volume to 24 μl with nuclease-free water
  1. Mix thoroughly by flicking the tube or plate to avoid unwanted shearing
  2. Spin down briefly in a microfuge

Select a unique barcode for each sample to be run together on the same flow cell.

Note: Only use one barcode per sample.

Set up a barcoding PCR reaction as follows for each library in fresh 0.2 ml PCR tubes or plate:

Between each addition, pipette mix 10-20 times.

Reagent Volume per sample for using 1–12 barcodes Volume per sample for using 13 barcodes or more
PCR Barcode (one of BC1-BC96, at 10 µM) 2 µl 1 µl
Adapter ligated DNA or amplicons with tailed primers 48 µl 24 µl
HotStart LongAmp Taq 2x master mix 50 µl 25 µl
Total volume 100 µl 50 µl

If the amount of input material is altered, the number of PCR cycles may need to be adjusted to produce the same yield.

Mix by pipetting and briefly spin down.

Amplify using the following cycling conditions:

Cycle step Temperature Time No. of cycles
Initial denaturation 94 °C 3 mins 1
Denaturation 94 °C 15 secs 15-18 (a)
Annealing 56 °C 15 secs 15-18 (a)
Extension 65 °C 6 mins (b) 15-18 (a)
Final extension 65 °C 10 mins 1
Hold 4 °C ∞

a. Adjust accordingly if input quantities are altered.

b. Adjust accordingly for different lengths of amplicons and the type of polymerase that is being used (LongAmp Taq amplifies at a rate of 50 seconds per kb). Here 6 min is used for ~8 Kbp templates.

Resuspend the AMPure XP beads by vortexing.

Add 0.4X volume of resuspended AMPure XP Beads to each reaction and mix by flicking the tube.

Reagent Volume for 100 µl samples Volume for 50 µl samples
AMPure XP Beads 40 µl 20 µl

Incubate at room temperature for 5 minutes.

Prepare sufficient fresh 80% ethanol in nuclease-free water for all of your samples. Allow enough for 400 µl per sample, with some excess.

Place on a magnetic rack, allow beads to pellet and pipette off supernatant.

Keep the samples on the magnet and wash the beads with 200 µl of freshly prepared 80% ethanol without disturbing the pellets. Remove the ethanol using a pipette and discard.

Repeat the previous step.

Spin down and place the samples back on the magnet. Pipette off any residual ethanol. Allow to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellets to the point of cracking.

Remove the samples from the magnetic rack and resuspend each pellet in 25 µl nuclease-free water. Incubate for 2 minutes at room temperature.

Pellet the beads on a magnetic rack until the eluate is clear and colourless.

Remove and retain 25 µl of each eluate into clean 0.2 ml PCR tubes or plate.

Dispose of the pelleted beads

Quantify the barcoded library using a Qubit fluorometer and pool all barcoded libraries in the desired ratios in a 1.5 ml DNA LoBind Eppendorf tube.

Gel analysis of amplified and ligated DNA

Sometimes a high-molecular weight product is visible in the wells of the gel when the PCR products are run, instead of the expected smear. These libraries are typically associated with poor sequencing performance. We have found that repeating the PCR with fewer cycles can remedy this.

Prepare 1 µg of pooled barcoded libraries in 50 µl nuclease-free water.

If the volume of your pool exceeds the 50 µl required for the end-prep reaction, consider a 2.5X AMPure XP Bead purification of the pool to concentrate your sample.

FIN DEL PROCESO

This pooled library is now ready to be end-repaired and adapted for sequencing. However, at this point it is also possible to store the sample at 4°C overnight.

6. End-prep

Material
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
Consumibles
  • NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
  • NEBNext® Ultra II End Prep Reaction Buffer from NEBNext® Ultra II End Repair Module (NEB, E7546)
  • Tubos de PCR de pared fina (0,2 ml)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • Etanol al 80 % recién preparado con agua sin nucleasas
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
Instrumental
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P10
  • Thermal cycler
  • Microcentrífuga
  • Mezclador Hula (mezclador giratorio suave)
  • Gradilla magnética
  • Cubeta con hielo
Equipo opcional
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)

Prepare the NEBNext Ultra II End Repair / dA-tailing Module reagents in accordance with manufacturer's instructions, and place on ice:

For optimal performance, NEB recommend the following:

  1. Thaw all reagents on ice.

  2. Ensure the reagents are well mixed.
    Note: Do not vortex the Ultra II End Prep Enzyme Mix.

  3. Always spin down tubes before opening for the first time each day.

  4. The NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer may contain a white precipitate. If this occurs, allow the mixture(s) to come to room temperature and pipette the buffer several times to break up the precipitate, followed by a quick vortex to mix.

Prepare the PCR amplified DNA in nuclease-free water

  1. Transfer 1 ug genomic DNA into a 0.2 ml thin-walled PCR tube.
  2. Adjust the volume to 50 μl with nuclease-free water.
  3. Mix thoroughly by flicking the tube to avoid unwanted shearing.
  4. Spin down briefly in a microfuge.

In a 0.2 ml thin-walled PCR tube, mix the following:

Reagent Volume
DNA 50 µl
Ultra II End-prep Reaction Buffer 7 µl
Ultra II End-prep Enzyme Mix 3 µl
Total 60 µl

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.

Incubar en el termociclador, primero a 20 ºC durante 5 minutos y después a 65 ºC durante 5 minutos más.

Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.

Transferir la muestra de ADN a un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

Añadir 60 µl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción de preparación de extremos y mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Preparar 500 µl de etanol al 80 %, con agua sin nucleasas.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán hasta que el sobrenadante se vuelva claro e incoloro. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Dejar el tubo en el imán y lavar el agregado de microesferas, con cuidado de no desplazarlo, con 200 µl de etanol al 80 %. Retirar el etanol con una pipeta y desechar.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de etanol. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 61 µl de agua sin nucleasas. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 61 µl de eluido y guardar en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

FIN DEL PROCESO

Una vez el ADN está reparado y con los extremos preparados, se puede proceder a la ligación del adaptador. En este punto, también se puede guardar la muestra a 4 ⁰C hasta el día siguiente.

7. Ligación de los adaptadores y purificación

Material
  • Ligation Adapter (LA) (adaptador de ligación)
  • Ligation Buffer (LNB) (tampón de ligación) del kit Ligation Sequencing Kit
  • Long Fragment Buffer (LFB) (tampón para fragmentos largos)
  • Short Fragment Buffer (SFB) (tampón para fragmentos cortos)
  • AMPure XP Beads (AXP) (microesferas magnéticas)
  • Elution Buffer (EB) (tampón de elución) del kit de Oxford Nanopore
Consumibles
  • Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467)
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Q32851) (kit de ensayo ADNbc alta sensibilidad)
  • Tubos de ensayo Qubit™ (Invitrogen Q32856)
Instrumental
  • Gradilla magnética
  • Microcentrífuga
  • Mezclador vórtex
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
  • Fluorímetro Qubit (o equivalente para el control de calidad)
CONSEJO

Recomendamos utilizar Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467).

La ligasa Salt-T4® DNA Ligase (NEB, M0467) puede adquirirse por separado o como parte del NEBNext® Companion Module v2 para Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (ref. E7672S or E7672L).

La ligasa Quick T4 DNA Ligase (NEB, E6057), disponible en la versión anterior —NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (NEB, E7180S or E7180L)— también es compatible, pero los nuevos reactivos recomendados ofrecen mayor eficacia y ligación.

IMPORTANTE

Aunque la ligasa recomendada de otros fabricantes se suministra con su propio tampón, la eficiencia del adaptador, Ligation Adapter (LA), es mayor cuando se usa el tampón Ligation Buffer (LNB) suministrado en el kit Ligation Sequencing Kit.

Centrifugar los viales Ligation Adapter (LA) y Salt-T4® DNA Ligase y poner en hielo.

Descongelar el vial Ligation Buffer (LNB) a temperatura ambiente, centrifugar y mezclar con la pipeta. Debido a su viscosidad, la agitación en vórtex de este tampón es ineficaz. Tras descongelar y mezclar, colocar en hielo inmediatamente.

Descongelar el vial Elution Buffer (EB) a temperatura ambiente, agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

IMPORTANTE

La fase de lavados tras la ligación de los adaptadores está diseñada para enriquecer los fragmentos de ADN de >3 kb o para purificar todos los fragmentos por igual, según el tampón que se utilice -Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).

  • Para enriquecer fragmentos de ADN de 3 kb o mayores, utilizar el tampón para fragmentos largos, Long Fragment Buffer (LFB).

  • Para conservar fragmentos de ADN de todos los tamaños, utilizar el tampón para fragmentos cortos, Short Fragment Buffer (SFB).

Descongelar el vial Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) a temperatura ambiente, agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

En un tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml mezclar en el siguiente orden:

Entre cada adición, mezclar con la pipeta de 10 a 20 veces.

Reactivo Volumen
Muestra de ADN del paso anterior 60 µl
Ligation Adapter (LA) 5 µl
Ligation Buffer (LNB) 25 µl
Salt-T4® DNA Ligase 10 µl
Total 100 µl

Mezclar pipeteando con suavidad y centrifugar brevemente la reacción para asegurarse de que se mezcla completamente.

Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Resuspender las microesferas magnéticas AMPure XP Beads (AXP) agitándolas en vórtex.

Añadir 40 μl de microesferas magnéticas resuspendidas AMPure XP Beads (AXP) a la reacción y mezclar dando suaves golpes al tubo con el dedo.

Incubar en el mezclador Hula (o mezclador giratorio suave) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar la muestra y precipitar en un imán. Dejar el tubo en el imán y retirar el sobrenadante con una pipeta.

Lavar las microesferas magnéticas con 250 μl o de Long Fragment Buffer (LFB) o de Short Fragment Buffer (SFB). Golpear el tubo suavemente con el dedo para resuspender las microesferas, centrifugar, colocar en la gradilla magnética y dejar que las microesferas precipiten. Retirar el sobrenadante con una pipeta y desechar.

Repetir el paso anterior.

Centrifugar y colocar el tubo de nuevo en el imán. Retirar con una pipeta cualquier residuo de sobrenadante. Dejar secar el agregado durante 30 s aproximadamente, sin dejar que se agriete.

Quitar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el agregado en 15 µl de Elution Buffer (EB). Centrifugar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tratándose de ADN de alto peso molecular, incubar a 37 ⁰C puede mejorar la recuperación de fragmentos largos.

Precipitar las microesferas en un imán, durante al menos 1 minuto, hasta que el eluido se vuelva claro e incoloro.

Extraer 15 μl del eluido que contiene la biblioteca de ADN y conservar en un tubo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind.

Deshechar las microesferas precipitadas.

CHECKPOINT

Cuantificar 1 μl de muestra eluida utilizando un fluorímetro Qubit.

Según el tamaño de los fragmentos de la biblioteca de ADN, prepare la biblioteca final en 12 µl de Elution Buffer (EB).

Longitud de fragmentos Cantidad a cargar en la celda de flujo
Muy cortos (<1 kb) 100 fmol
Cortos (1-10 kb) 35–50 fmol
Largos (>10 kb) 300 ng

Nota: Si el producto obtenido en la biblioteca está por debajo de la cantidad de muestra inicial recomendada, cargue la biblioteca entera.

Si es necesario, recomendamos utilizar una calculadora de masa a mol, como la calculadora de NEB.

FIN DEL PROCESO

La biblioteca preparada se usará para cargar la celda de flujo. Conservar la biblioteca en hielo o a 4 °C hasta el momento de cargar.

CONSEJO

Recomendaciones de guardado de la biblioteca

Se recomienda guardar las bibliotecas en tubos Eppendorf DNA LoBind a 4 ⁰C, durante periodos de tiempo cortos o en caso de uso repetido, por ejemplo, para recargar celdas de flujo entre lavados. Para uso individual y para conservar a largo plazo por periodos de más de 3 meses, se recomienda guardar las bibliotecas a -80 ⁰C en tubos Eppendorf DNA LoBind.

8. Cebado y carga de la celda de flujo MinION/GridION

Material
  • Flow Cell Flush (FCF) (enjuague de celda de flujo)
  • Flow Cell Tether (FCT) (anclaje de celda de flujo)
  • Library Solution (LIS)
  • Library Beads (LIB) (microesferas de carga de la biblioteca)
  • Sequencing Buffer (SB) (tampón de secuenciación)
Consumibles
  • Celda de flujo MinION/GridION
  • Tubos de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind
  • Agua sin nucleasas (p. ej., ThermoFisher AM9937)
  • (Opcional) Seroalbúmina bovina (BSA) (50 mg/ml) (p. ej., Invitrogen™ UltraPure™ BSA 50 mg/ml, AM2616)
Instrumental
  • Dispositivo MinION o GridION
  • Pantalla protectora para celdas de flujo MinION
  • Pipeta y puntas P1000
  • Pipeta y puntas P100
  • Pipeta y puntas P20
  • Pipeta y puntas P10
IMPORTANTE

Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo R10.4.1 (FLO-MIN114).

CONSEJO

Cebado y carga de la celda de flujo

Se recomienda a los nuevos usuarios que miren el vídeo Priming and loading your flow cell antes de realizar su primer experimento.

Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB) o Library Solution (LIS), -si se requiere-, y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex, centrifugar y colocar en hielo.

IMPORTANTE

Para obtener un rendimiento de secuenciación óptimo y mejorar el rendimiento de las celdas de flujo MinION R10.4.1 (FLO-MIN114), recomendamos añadir seroalbúmina bovina (BSA), en una concentración total de 0,2 mg/ml, a la mezcla de cebado de la celda de flujo.

Nota: No se aconseja utilizar ningún otro tipo de albúmina (p. ej., seroalbúmina humana recombinante).

Para preparar la mezcla de cebado con seroalbúmina bovina, mezclar Flow Cell Flush (FCF) y Flow Cell Tether (FCT) como se indica a continuación. Mezclar con la pipeta a temperatura ambiente.

Nota: Hemos cambiando el formato de algunos de los viales de nuestros kits, de tubos monouso a botellas de mayor cantidad.

Formato en tubos monouso En el tubo de Flow Cell Flush (FCF), añadir directamente 5 µl de seroalbúmina bovina (BSA), a una concentración de 50 mg/ml y 30 µl de Flow Cell Tether (FCT).

Formato en botella: En un tubo proporcionado a la cantidad de celdas de flujo que se vayan a utilizar, mezclar los siguientes reactivos:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Flow Cell Flush (FCF) 1 170 µl
Bovine Serum Albumin (BSA) a una concentración de 50 mg/ml 5 µl
Flow Cell Tether (FCT) 30 µl
Volumen total 1 205 µl

Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.

Flow Cell Loading Diagrams Step 1a

Flow Cell Loading Diagrams Step 1b

MEDIDA OPCIONAL

Antes de cargar la biblioteca, verifique la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.

Si se ha verificado con anterioridad la cantidad de poros presentes en la celda de flujo, este paso se puede omitir.

Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.

Para abrir el puerto de cebado de la celda de flujo, deslizar la tapa en el sentido de las agujas del reloj.

Flow Cell Loading Diagrams Step 2

IMPORTANTE

Tenga cuidado a la hora de extraer el tampón. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que el tampón cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.

Tras abrir el puerto de cebado, verificar si hay una burbuja de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de tampón para quitar las burbujas:

  1. Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
  2. Introducir la punta de la pipeta en el puerto de cebado.
  3. Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de tampón entrar en la punta de la pipeta.

Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de tampón circulando desde el puerto de cebado a través de la matriz de poros.

Flow Cell Loading Diagrams Step 03 V5

Cargar 800 μl de mezcla de cebado en el puerto de cebado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar 5 minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.

Flow Cell Loading Diagrams Step 04 V5 SPANISH

Mezclar con la pipeta, minuciosamente, el contenido del vial Library Beads (LIB).

IMPORTANTE

Este vial contiene microesferas en suspensión. Las microesferas precipitan muy rápido; por eso, es fundamental mezclarlas justo antes de usar.

En la mayoría de experimentos de secuenciación, se recomienda usar Library Beads (LIB) . El reactivo Library Solution (LIS) está indicado para bibliotecas de ADN más viscosas.

En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind, preparar la biblioteca de la siguiente manera:

Reactivo Volumen por celda de flujo
Sequencing Buffer (SB) 37,5 µl
Library Beads (LIB) mezcladas justo antes de usar, o Library Solution (LIS), si se requiere 25,5 µl
Biblioteca de ADN 12 µl
Total 75 µl

Completar el cebado de la celda de flujo:

  1. Levantar suavemente la tapa del puerto de muestra SpotON.
  2. Cargar 200 µl de mezcla de cebado en el puerto de cebado (no en el puerto de muestra SpotON), evitando introducir burbujas de aire.

Flow Cell Loading Diagrams Step 5

Flow Cell Loading Diagrams Step 06 V5 SPANISH 2

Mezclar la biblioteca pipeteando suavemente, justo antes de cargar.

Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto de muestra SpotON. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.

Flow Cell Loading Diagram Step 07 V5 SPANISH

Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto de muestra SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de cebado.

Step 8 update - SPANISH

Flow Cell Loading Diagrams Step 9 SPANISH

IMPORTANTE

Para obtener resultados de secuenciación óptimos, instale la pantalla protectora justo después de cargar la biblioteca.

Recomendamos poner la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.

Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:

  1. Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.

  2. Colocar la pantalla protectora con suavidad sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y debe cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.

J2264 - Light shield animation Flow Cell FAW optimised. SPANISH

ATENCIÓN

La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipularla con cuidado.

FIN DEL PROCESO

Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.

9. Data acquisition and basecalling

Aspectos generales del análisis de datos de nanoporos

Para obtener una descripción completa del análisis de datos de nanoporos, que incluya distintas posibilidades para el análisis de identificación y postidentificicación de bases, consultar el documento Data Analysis.

How to start sequencing

The sequencing device control, data acquisition and real-time basecalling are carried out by the MinKNOW software.Please ensure MinKNOW is installed on your computer or device. Further instructions for setting up a sequencing run can be found in the MinKNOW protocol.

In the current MinKNOW software version, the PCR Barcoding Expansions are not available in "Kit selection" when setting up a sequencing run. These will be included in the next software update.

For the meantime, we recommend starting a sequencing run in the MinKNOW software using Ligation Sequencing Kit V14 (SQK-LSK114) to perform real-time basecalling. Once basecalling is complete, the data can be demultiplexed using post-run barcoding on MinKNOW, as outlined below.

MinKNOW settings for real-time basecalling and post-run barcoding:

Real-time basecalling

Follow the instructions in the MinKNOW protocol beginning from the "Starting a sequencing run" section for your device until the end of the "Completing a MinKNOW run" section.

Select Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK114) in "Kit selection". The barcoding option will be unavailable as default. Other parameters can be kept at their default settings.

Picture1

Post-run barcoding

Follow the instructions in "Post-run barcoding" of the MinKNOW protocol.

Click Analysis to open post-run options. Choose Barcoding and input your fastq data files. Select the PCR Barcoding Expansion used during library preparation in "Barcode settings" and use the default settings for other parameters.

Picture2

Screenshot 2023-03-08 094211

10. Análisis posterior

Análisis posterior a la identificación de bases

Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de identificación de bases:

1. Procesos de trabajo en EPI2ME

Para realizar un análisis de datos exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y procesos de trabajo de bioinformática, disponibles en EPI2ME Labs, situados en la sección EPI2ME Labs de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los procesos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.

2. Herramientas de análisis

El departamento de Investigación de Oxford Nanopore Technologies ha creado una serie de herramientas de análisis que están disponibles en el repositorio Oxford Nanopore de GitHub. Las herramientas están diseñadas para usuarios avanzados y contienen instrucciones sobre cómo instalar y ejecutar el programa. Estas herramientas están públicamente disponibles y cuentan con un mantenimiento mínimo.

3. Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad

Si en ninguno de los recursos anteriores se proporciona un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, puede consultar la sección Bioinformatics del centro de recursos Resource Centre. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/software.

11. Reutilización y devoluciones de las celdas de flujo

Material
  • Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) (kit de lavado de celda de flujo)

Si al terminar el experimento desea volver a usar la celda de flujo, siga las instrucciones del protocolo Flow Cell Wash Kit y guarde la celda de flujo lavada a 2-8 ⁰C.

El protocolo Flow Cell Wash Kit está disponible en la comunidad Nanopore.

CONSEJO

Una vez terminado el experimento, recomendamos lavar la celda de flujo cuanto antes. Si no es posible, se puede dejar en el dispositivo y lavar al día siguiente.

Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución para lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.

Aquí puede encontrar las instrucciones para devolver celdas de flujo.

Nota: Antes de proceder a su devolución, las celdas de flujo deben lavarse con agua desionizada.

IMPORTANTE

Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la guía de resolución de problemas, Troubleshooting Guide, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.

12. Problemas durante la extracción de ADN/ARN y la preparación de bibliotecas

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Baja calidad de la muestra

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza del ADN (la lectura del Nanodrop para ADN OD 260/280 es <1,8 y OD 260/230 es <2,0-2,2) El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Pruebe con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.
Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel). El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.
El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado El ARN se degradó durante la extracción Probar un método de extracción de ARN diferente. Encontrará más información sobre RIN en la página RNA Integrity Number. Asimismo, dispone de información adicional en la página DNA/RNA Handling.

Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el espacio de trabajo y el instrumental de laboratorio estén libres de ribonucleasas.

Escasa recuperación de ADN tras la limpieza con microesferas magnéticas AMPure

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra inferior a lo previsto. 1. Las microesferas magnéticas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra hay que asegurarse de que estén bien resuspendidas.

2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado Cuanto menor sea la proporción de microesferas magnéticas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel, y, a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas magnéticas que se debe utilizar. SPRI cleanup
Escasa recuperación tras la preparación de extremos El paso de lavado utilizó etanol a <70 % Cuando se utilice etanol a <70 %, el ADN se eluirá de las microesferas magnéticas. Asegúrese de utilizar el porcentaje correcto.

13. Problemas durante el experimento de secuenciación

A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.

También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del Live Chat de la comunidad Nanopore.

Menos poros al inicio de la secuenciación que después de verificar la celda de flujo

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. En este vídeo se muestran algunas buenas prácticas para evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La celda de flujo no está colocada correctamente Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar con una posición diferente del dispositivo (GriION/PromethION).
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la comprobación de la celda de flujo La presencia de contaminantes en la biblioteca ha dañado o bloqueado los poros El número de poros resultante tras la comprobación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ADN/ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes están descritos en la página Contaminants. Se recomienda, probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Error en el script de MinKNOW

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script"
Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo con la biblioteca cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir recomendaciones de almacenamiento adicionales.

Ocupación de poro por debajo del 40 %

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación de poro <40 % No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo Procure cargar la biblioteca al volumen y la concentración adecuados, tal como se indica en el protocolo correspondiente. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular fmoles con herramientas como la calculadora Biomath de Promega, (opción "dsDNA: μg to fmol").
Ocupación de poro próxima a 0 Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y los adaptadores de secuenciación no se ligaron al ADN En la fase de ligación del adaptador, utilice NEBNext Quick Ligation Module (E6056) y el tampón Ligation Buffer (LNB) de Oxford Nanopore Technologies, suministrado en el kit de secuenciación. Recuerde añadir la cantidad correcta de cada reactivo. Prepare una biblioteca de control con lambda para valorar la integridad de los reactivos de otros fabricantes.
Ocupación de poro próxima a 0 Se utilizó el kit Ligation Sequencing Kit y en la fase de lavado, después de la ligación del adaptador, se utilizó etanol en lugar de Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB). El etanol puede desnaturalizar la proteína motor en los adaptadores de secuenciación. Usar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) después de la ligación de los adaptadores.
Ocupación de poro próxima a 0 No hay anclaje en la celda de flujo Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (Flush Tether (FLT) para los kits 9, 10 y 11, y Flow Cell Tether (FCT) para el kit 14). Asegurarse de añadir un anclaje —Flush Tether (FLT) o Flow Cell Tether (FCT)— al tampón antes del cebado; el tampón utilizado es Flush Buffer (FB) para los kits 9, 10 y 11 y Flow cell Flush (FCF) para el Kit 14.

Longitud de lectura más corta de lo esperado

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado Fragmentación no deseada de la muestra de ADN La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN se puede fragmentar durante la extracción de la preparación de la biblioteca.

1. Consulte la sección de buenas prácticas de los métodos de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore.

2. Visualizar la distribución de la longitud de los fragmentos de las muestras de ADN en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca. DNA gel2 En la imagen superior, la muestra 1 contiene alto peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado.

3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex cuando se mezclen los reactivos. Dar suaves golpes con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Gran proporción de poros no disponibles

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros no disponibles (se muestran en azul oscuro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros)

image2022-3-25 10-43-25 Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros de arriba muestra una proporción creciente de poros no disponibles.		 Hay contaminantes presentes en la muestra Algunos contaminantes se pueden eliminar de los poros mediante la función de desbloqueo incorporada en MinKNOW. Si funciona, el estado de los poros cambiará a "sequencing pores" (secuenciación de poros). Si la porción poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta, pruebe una de las siguientes opciones:

1. Realizar un enjuague de nucleasa con el kit de lavado Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004)
2. Realizar varios ciclos de PCR para intentar diluir cualquier contaminante que pueda estar causando problemas.

Gran proporción de poros inactivos

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están dañados de manera irreversible) Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de forma permanente. Para conocer las buenas prácticas de cebado y carga de la celda de flujo, ver el vídeo Priming and loading your flow cell
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Ciertos compuestos copurificados con ADN Compuestos conocidos, incluidos los polisacáridos, se asocian generalmente con el ADN genómico de las plantas.

1. Consulte la página Plant leaf DNA extraction method.
2. Limpiar usando el kit QIAGEN PowerClean Pro.
3. Realizar una amplificación del genoma completo con la muestra original de ADNg utilizando el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos/no disponibles Hay contaminantes presentes en la muestra Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Fluctuación de la temperatura

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de la temperatura La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector están bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica.

Error al intentar alcanzar la temperatura deseada

Observación Posible causa Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" El dispositivo ha sido colocado en un lugar a una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). MinKNOW tiene un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez acabado el tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continua. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede llevar a una disminución en el rendimiento y a generar un índice de calidad Qscore menor. Corrija la ubicación del dispositivo de secuenciación para asegurarse de que se encuentra a temperatura ambiente y con buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Para obtener más información sobre el control de temperatura de MinKNOW Mk 1B, consulte la sección de preguntas frecuentes, FAQ.

Last updated: 8/21/2024

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